HEMOSTASIA Y TROMBOSIS
Efecto de la progesterona sobre la agregación plaquetaria y la producción de eicosanoides por aorta de rata*
Nélida Nélida Polini1, Virginia Laura Massheimer1,2, Juana Sellés1
1. Doctoras en Bioquímica.
2. Investigadora Adjunta del CONICET.
* Cátedra de Análisis Clínicos II, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur.
Resumen
En el presente trabajo se investiga la acción no genómica de la progesterona (Pg) sobre la síntesis de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) y tromboxano (TX) y su vinculación con la regulación de la agregación plaquetaria (AP), utilizando anillos de aorta aislados de ratas hembras (RAS). Se obtuvo evidencia de que la Pg inhibe la AP en forma dosis-dependiente. El metil éster de N-nitro-L-arginina (L-NAME) revierte parcialmente el efecto antiagregante de Pg y sugiere que la inhibición de la AP inducida por la hormona es mediada en parte por el NO. Respecto a los eicosanoides, la Pg estimula significativamente la síntesis de 3H-6cetoPGF1alfa (42 al 182% con respecto al control). Por el contrario, la síntesis de tromboxano no es modificada a ninguna de las dosis ensayadas. En presencia de indometacina -inhibidor de la ciclooxigenasa constitutiva (COX)- la diferencia de la AP entre los grupos control y tratado se reduce significativamente, lo que sugiere que el efecto antiagregante inducido por la Pg es en parte mediado por la producción de PGI2. Estos resultados sugieren que la progesterona modula la agregación plaquetaria a través de un mecanismo que involucra la participación de NO y PGI2.
Palabras clave: Agregación plaquetaria; Progesterona; Óxido nítrico; Prostaciclina; Aterosclerosis; Hormonas ováricas; Aorta.
Summary
Effects of progesterone on platelet aggregation and rat aorta eicosanoid production
Using rat aortic tissue, the non genomic action of progesterone (Pg) on nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), and tromboxane (Tx) synthesis and its relationship with platelet aggregation were studied. Treatment of female rat aortic rings (RAS) with Pg induced a dose-dependent inhibition of platelet aggregation (IPA), which was partially abolished when RAS were treated in the presence of the specific NOS inhibitor N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME). This observation would indicate that the inhibition of platelet aggregation (PA) resulted partially dependent on NOS stimulation by the hormone. Pg also produced a dose-dependent increase in PGI2 synthesis (42 at 182% respect to control), but no changes in Tx liberation by aorta was observed, at any concentration of Pg used. RAS preincubation with indomethacine, a COX inhibitor, partially reduced Pg antiaggregatory effect, suggesting that the inhibition of PA induced by hormone is also dependent on PGI2 generation. These results provide evidence that Pg modulates PA involving NO and PGI2 metabolic pathways.
Key words: Platelet aggregation; Progesterone; Nitric oxide; Prostacyclin; Aterosclerosis; Ovarian hormones; Aorta.
Introducción
En condiciones fisiológicas, el óxido nítrico (NO) y
la prostaciclina (PGI2), factores sintetizados y liberados por el endotelio, inhiben la activación endotelial, la expresión
de moléculas de adhesión y la agregación plaquetaria
(AP)(1-3). La disfunción del endotelio altera
el equilibrio de síntesis de estos factores y conduce a su
activación. Esta activación provoca adhesión de leucocitos
y/o agregación/adhesión de plaquetas a la pared
vascular. Ello es consecuencia de un incremento en la
expresión por parte de las células endoteliales, de moléculas
de adhesión VCAM (vascular cell adhesion molecule);
ICAM (intercellular cell adhesion molecule); P-selectina y
PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule- 1), que
atraen y unen a leucocitos y plaquetas. Las plaquetas activadas
cambian de forma, emiten seudópodos y migran
hacia el subendotelio donde se adhieren por unión al
factor de Von Willebrand asociado al colágeno. Todos
estos eventos, sumados a la migración de células musculares
lisas hacia la túnica íntima, participan en la formación
de la placa (4-6).
El NO producido por el endotelio es sintetizado por
la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (NOSe) a
partir de la arginina (7). Luego de producido este radical
libre puede difundir a la luz arterial e inhibir la
agregación plaquetaria, o se trasloca a la capa muscular
subyacente induciendo vasorrelajación dependiente
de GMPc.
Las prostaglandinas (PG) y tromboxano (TX) se
sintetizan a partir del ácido araquidónico por la acción
catalítica de la ciclooxigenasa constitutiva (COX-1) o
inducible (COX-2). Los eicosanoides PGD2, PGE2 y
PGI2 son potentes vasodilatadores y tienen, además, acción
antitrombótica, mientras que el TXA2 es un potente
vasoconstrictor y estimulante de la AP (8)(9).
Diferentes agonistas, entre los que se incluyen las
hormonas ováricas estrógenos y Pg, regulan a nivel del
endotelio la producción de estos compuestos vasoactivos
(NO, PGI2 y TXA2). Las hormonas esteroideas actúan
a través de dos mecanismos: uno genómico, que
comprende la unión al receptor citosólico nuclear y
posterior regulación de la transcripción génica; y otro
mecanismo no genómico de acción rápida (segundos,
minutos), a nivel de la membrana plasmática con posterior
activación de sistemas de transducción de señales
intracelulares (10).
Recientemente en este laboratorio se ha demostrado
que la Pg, en tejido aórtico de rata, estimula la producción
de NO e inhibe la AP, en forma similar a lo reportado
para 17 β-estradiol (11). Se demostró también
que el mecanismo de acción de la Pg es de tipo no genómico
ya que los efectos observados no fueron suprimidos
ni por actinomicina (inhibidor de la transcripción
génica) ni por cicloheximida (inhibidor de la síntesis
proteica) (12).
En el presente trabajo se estudia la acción no genómica
de la Pg sobre la síntesis de NO, PGI2, TX y su vinculación
con la regulación de la AP, en anillos de aorta
de ratas hembra.
Materiales y Métodos
MATERIALES
El ácido 3H-araquidónico fue adquirido en New England Nuclear (Chicago, USA); las placas de sílica gel G para cromatografía en capa fina, en Merck KGaA (Alemania); la Pg, la superóxido dismutasa (SOD), y las otras drogas empleadas, en Sigma (St. Louis, MO, USA).
ANIMALES
Se utilizaron ratas Wistar hembras, en edad fértil (3 a 6 meses). La madurez ovárica se determinó por observación con microscopía óptica de los extendidos vaginales; se consideró función ovárica activa a la presencia de tres estros consecutivos. Los animales fueron alimentados con dieta estándar para roedores, con provisión de agua ad libitum, permaneciendo expuestos a ciclos diarios de 12 horas de luz/oscuridad.
SISTEMA EXPERIMENTAL
Se emplearon anillos de aorta de rata (RAS) aislados y procesados de acuerdo a lo descripto previamente (11). Los animales se sacrificaron por dislocación cervical, inmediatamente se extrajo la aorta toráxica, se colocó en una solución salina Dulbeco tamponada (DPBS) fría, se lavó, se eliminó el tejido conectivo y se cortaron anillos de 5 mm de ancho. En todo momento se cuidó de no lesionar el endotelio vascular. Los anillos se preincubaron en un medio (D) que contenía: NaCl 125,4 mM; KCl 5,9 mM; MgCl2 1,2 mM; CaCl2 1,5 mM; glucosa 11,5 mM; Hepes 10 mM; pH: 7.35 durante 15 min en un baño termostatizado a 37 oC, con agitación constante (12).
DETERMINACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA:
Los RAS se incubaron en medio D, se lavaron exhaustivamente
y se transfirieron a 400 µL de un pool de plasma
rico en plaquetas (PRP) (ajustado a 300 x 10 3 /µL) y
se efectuó el tratamiento hormonal con las concentraciones
de Pg a los intervalos de tiempo que se indican
en cada figura. Los grupos controles fueron tratados
con vehículo solamente (etanol < 0,1%). Para evitar la
degradación del NO producido se utilizaron 60 U/mL
de SOD (superóxido dismutasa), agregada al medio de
incubación previo al tratamiento hormonal (13).
Finalizado el tratamiento, se tomaron alícuotas de
285 µL del PRP y se colocaron en la cubeta del agregómetro
CronoLog 430 de un solo canal. Se determinó la
agregación plaquetaria por el método turbidimétrico de
Born. Se emplearon como agonistas ristocetina, ADP y
epinefrina, a las concentraciones finales indicadas en la
Tabla I (14). Los RAS se disolvieron con NaOH 1 N y se
determinó proteínas por el método de Lowry (15). Los
resultados se expresaron como porcentaje de inhibición
de la agregación plaquetaria por mg de proteína.
Cuando se emplearon L-NAME (inhibidor de la NOS) e indometacina (inhibidor de COX), estos se agregaron al medio de preincubación 10 min antes del tratamiento hormonal.
DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE EICOSANOIDES
Los RAS se premarcaron con ácido 3H-araquidónico (0,3 µCi/mL) durante 90 min y se trataron con Pg durante 5 min con las concentraciones indicadas. Se detuvo el tratamiento por aspiración del medio de incubación, se acidificó con ácido cítrico (pH 3.5-4.5) y se extrajo cuatro veces con 0,5 mL de acetato de etilo. Se colectó la fase orgánica, se evaporó bajo atmósfera de nitrógeno y se resuspendió en acetato de etilo. Se sembró en placas de sílica gel. Como solvente de corrida se empleó acetato de etilo: iso-octano: ácido acético: agua (66:30:12:60, respectivamente) y como revelador, vapores de yodo. Se cuantificó la radioactividad incorporada en cada banda por centelleo líquido, y los resultados se expresan como porcentaje del total de 3H-eicosanoides (16).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se utilizó el test t de Student con un nivel de significación p < 0,05. Cada condición experimental se reprodujo en al menos tres experimentos independientes realizados por cuadruplicado.
Resultados
En primer lugar se evaluó el efecto del tratamiento
del tejido aórtico con Pg (10-8M) sobre la AP, utilizando
ADP, epinefrina y ristocetina, como inductores de la
misma. La Tabla I muestra los resultados de la AP en
condiciones basales (PRP solo), control (RAS + vehículo)
y Pg (RAS en presencia de la hormona). Puede observarse que la presencia de tejido aórtico en el PRP
produce una disminución de la AP inducida por ADP
(57% del control vs 100% del basal), y que el tratamiento
del tejido con Pg incrementa más aún la inhibición
(28% vs 57%, Pg vs control). Con epinefrina o
ristocetina se obtuvieron resultados equivalentes. En
virtud de ello se seleccionó ADP para la ejecución de
los experimentos siguientes.
El efecto de la Pg sobre la AP demuestra ser dosis dependiente
como puede observarse en la Figura 1. Las
curvas de agregación muestran que dosis crecientes de
Pg disminuyen la AP en forma progresiva respecto al
control (20 al 80% de inhibición de la AP sobre el control).
Figura 1. Dosis-respuesta del efecto de la Pg sobre la AP: Los RAS se incubaron durante 1 min en PRP en presencia o ausencia (control) de las concentraciones indicadas de la hormona. La AP se midió como se describe en Métodos. Los resultados se expresan en porcentaje de AP con respecto al basal (PRP más ADP).
Con el objeto de determinar si la acción antiagregante de la Pg era mediada por la producción de NO por parte del tejido aórtico, se midió la AP en presencia de L-NAME, un inhibidor específico de la NOS. En la Figura 2 se puede observar que L-NAME 10-5 M revierte parcialmente el efecto antiagregante de la hormona y sugiere que la IAP inducida por la Pg es mediada en parte por el NO.
Se evaluó si los compuestos empleados en los diferentes tratamientos afectaban directamente la agregación de las plaquetas. Para ello se determinó la AP inducida por ADP en un PRP al cual se le agregó etanol, Pg, L-NAME o indometacina. Además se utilizó nitroprusiato de sodio (dador de NO) como control positivo del funcionamiento. En la Tabla II puede observarse que los diferentes compuestos que se utilizan para los tratamientos del tejido, cuando se agregan al PRP en ausencia de tejido aórtico no afectan la AP inducida por ADP, descartándose por consiguiente un efecto directo de dichos compuestos sobre la AP. El nitroprusiato produce una inhibición del 40%, lo que evidencia la capacidad de las plaquetas de responder al NO.
Dado que el proceso de activación y la AP son también modulados por los eicosanoides prostaglandinas y tromboxanos (17), se estudió el efecto de la Pg sobre la producción de PGI2 y Tx por parte del tejido aórtico,. Como puede observarse en la Figura 3, 5 min de tratamiento con Pg estimulan significativamente la síntesis de 3H-6cetoPGF1alfa en forma dosis dependiente (42 al 182% con respecto al control). Por el contrario, la síntesis de tromboxano no fue modificada por el tratamiento rápido con Pg a ninguna de las dosis ensayadas (Tabla III).
Teniendo en cuenta que la PGI2 es un potente antiagregante plaquetario y que en este sistema la Pg incrementa significativamente su producción (Fig. 3), se estudió la participación de la PGI2 sobre la IAP inducida por la hormona. Con tal fin el tejido aórtico fue pretratado con indometacina 10 µM para suprimir la actividad COX. En presencia del inhibidor la diferencia de la AP entre los grupos control y tratado con hormona se reduce significativamente, lo que sugiere que el efecto antiagregante inducido por la Pg es en parte mediado por la producción de PGI2 (Fig. 4).
Discusión
En este trabajo se demuestra que la Pg a concentraciones
fisiológicas ejerce un efecto directo sobre el tejido
aórtico de rata y modula la AP a través de un mecanismo
que involucra la participación de NO y PGI2. Los resultados
obtenidos con NAME e indometacina evidencian
que el efecto antiagregante de la Pg a través de su acción
directa sobre el tejido vascular sería mediado por la regulación
de la producción de los compuestos vasoactivos
NO y PGI2. Es importante destacar que la síntesis de
tromboxano no es afectada por la hormona, lo cual sugeriría
una acción diferencial del esteroide sobre las enzimas
tromboxano sintasa y prostaciclina sintasa, responsables
de la síntesis de dichos eicosanoides.
Los prostanoides cumplen un rol fundamental en el
control de la hemostasia a través de la regulación de la
activación plaquetaria (18). El TxA2 es el responsable
de la propagación de la activación y del reclutamiento
de las plaquetas hacia el sitio de la agregación. Su
unión al receptor plaquetario TP activa el sistema
Gq/PLC (fosfolipasa C), estimula la liberación de calcio
intracelular en forma dependiente de IP3 y activa el
sistema contráctil CAM/Ca++/ MLCK (calmodulina/
miosina de cadena liviana) induciendo contracción y
la posterior secreción del contenido de los gránulos
plaquetarios. En cambio, la prostaciclina producida
por las células del endotelio vascular constituye el principal
factor antiagregante del organismo (19). Inhibe
la agregación plaquetaria de dos maneras diferentes:
a) en las plaquetas se une a su receptor IP, estimula la
síntesis de AMPc e inhibe la secreción plaquetaria por
fosforilación dependiente de PKA; b) en el lecho vascular
suprime la expresión de moléculas quimiotácticas
para plaquetas y leucocitos , evitando su adhesión y
agregación al endotelio (20).
La postmenopausia es un período en la vida de la mujer
en el que el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares
aumenta significativamente, hecho que se ha
atribuido a la disminución de los niveles de estrógenos
circulantes. La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial.
Diversos agonistas, entre los que se incluye al
estradiol, modulan dichos factores. La regulación de la
actividad endotelial por parte del estradiol es un hecho
bien documentado. Numerosos reportes en la literatura
demuestran que el 17 β-estradiol ejerce una acción directa
a nivel de la pared arterial regulando negativamente
la expresión de algunos de los múltiples factores que
conducen a la aterosclerosis. Se ha demostrado que promueve
la vasorrelajación por activación de la NOS constitutiva, inhibe la migración y proliferación de las células
del músculo liso, suprime la expresión de las moléculas
de adhesión, e inhibe la activación plaquetaria (21). En
la postmenopausia, con la pérdida de este efecto protector
del estradiol, se establecerían condiciones más propensas
para el desarrollo de lesiones ateromatosas.
La pérdida de la función ovárica también afecta a
los niveles circulantes de Pg. Cuando se aplica una terapia
hormonal de reemplazo, el protocolo recomendado
es el que incluye la administración combinada de
estrógenos y progesterona. No obstante ello, es escasa
la información documentada concerniente a la acción
de la Pg sobre la pared arterial a pesar de haberse encontrado
receptores para dicha hormona en el endotelio
(22). Estudios electrofisiológicos han demostrado
que la Pg promueve vasorrelajación a través de la inhibición
de la entrada de calcio a la célula endotelial en
arterias coronarias de conejo (23)(24). Estos resultados
estarían en concordancia con los hallazgos previos
de los autores que muestran que la Pg induce la activación
de la NOS con un significativo aumento de la producción
de NO por parte del tejido aórtico (12), resultando
en una acción vasodilatadora.
Las actuales investigaciones están dirigidas a identificar
en la pared vascular, las vías mensajeras que median
la acción de la Pg y que resultan en un efecto inhibitorio
de la agregación plaquetaria inducida por la
hormona; como así tambien la relevancia fisiológica de
estos efectos observados in vitro. La pérdida de los mismos
durante el período de declinación de la función
ovárica, podría contribuir al desarrollo de las patologías
vasculares observadas en la postmenopausia.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado gracias al aporte del subsidio otorgado por la Secretaría de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional del Sur (PGI: 24/ B047).
CORRESPONDENCIA
Dra. JUANA SELLÉS
Cátedra de Análisis Clínicos II
Departamento de Biología,
Bioquímica y Farmacia
San Juan 670
B8000ICN BAHÍA BLANCA
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Aceptado para su publicación el 13 de julio de 2004