BIOLOGÍA MOLECULAR
Polimorfismo Pro12Ala del gen PPAR-g2 y síndrome metabólico. Estudio preliminar
Pro12Ala polymorphism of the PPAR-g2 gene and the metabolic syndrome. Preliminary study
Erika Fernández1 *, Luz Marina Morales2 *, Renata Vargas3 *, Laury Sandrea3 *, Emperatriz Molero-Conejo4 *, Virginia Fernández4 *, Mariana Zambrano1 **, Lissett Connell3 *, Gilberto Campos5 *, Jose Aranguren-Mendez6 ***
1. Master en Genética.
2. Master en Bioquímica.
3. Lic. en Bioanálisis.
4. Doctorado en Ciencias Medicas
5. Master en Gerencia de proyectos de Investigación
y Desarrollo.
6. Doctor en Genética
* Instituto de Investigaciones Clínicas Dr.
Américo Negrette. Facultad de Medicina.
Universidad del Zulia.
** Cátedra de Bioquímica Clínica. Escuela de
Bioanálisis. Facultad de Medicina. Universidad
del Zulia
*** Cátedra de Genética de la Facultad de Veterinaria.
Universidad del Zulia, Venezuela
Resumen
El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2 en individuos no emparentados con síndrome metabólico de la ciudad de Maracaibo. Se seleccionaron 50 individuos (22 con síndrome metabólico y 28 sin síndrome metabólico) entre 22 y 58 años. A cada individuo se le realizó una evaluación clínica, nutricional y bioquímica. Para analizar la secuencia de la variante Pro12Ala del gen PPAR se empleó PCR y digestión enzimática de los fragmentos de restricción del polimorfismo (PCR-RFLP). En los individuos con síndrome metabólico el porcentaje de portadores del alelo Ala fue de 13,6%, mientras que en el grupo sin síndrome metabólico fue de 32,14%. La frecuencia para el alelo Ala del polimorfismo Pro12Ala fue de 0,12 y para el alelo Pro fue de 0,88. Los individuos con síndrome metabólico y portadores del alelo Ala presentaron niveles más bajos de triglicéridos y col-HDL más alto. Se concluye que la presencia del alelo Ala en individuos con síndrome metabólico mostró un efecto protector sobre el perfil lipídico.
Palabras clave: Síndrome metabólico; Gen del receptor activado de proliferación peroxisómica g2; Polimorfismo; Genética del síndrome metabólico
Summary
The aim of this paper was to determine the prevalence of the polymorphism pro12ala in non-related individuals with metabolic syndrome from Maracaibo-Venezuela. Fifty subjects (22 with metabolic syndrome and 28 without metabolic syndrome) between 22 to 58 years of age were selected. For each individual, biochemical, nutritious, and clinical evaluations were carried out. PCR and restriction-fragment length polymorphism enzyme digestion were used to analyze the Pro12Ala sequence variant of the PPAR gene. The distribution of the Ala allele was 13.6% in the individuals with metabolic syndro- and 32.14% in the group without metabolic syndrome. The frequency distributions of the PPAR gamma sequence variants were 0.12 for Ala variant and 0.88 for Pro. The subjects with the metabolic syndrome and carriers of the Ala 12 allele had lower concentration of triglycerides and higher HDL-C. It can be concluded that the Ala12 allele in individuals with metabolic syndrome had a protective effect on the lipid profile.
Key words: Metabolic syndrome; Human peroxisome proliferators-activated receptor-g2; Polymorphism; Metabolic syndrome genetics
Introducción
El polimorfismo Pro12Ala en el gen PPARg2 ha sido
estudiado como una de las primeras variantes genéticas
con amplio impacto en el riesgo de padecer diabetes
tipo 2 (1), y se ha relacionado con diferentes componentes
del síndrome metabólico (SM) (2). Los estudios
sobre el gen PPAR han permitido aclarar más este
síndrome, dada su participación en la regulación de
la expresión de numerosos genes que afectan el control
de la glicemia, el metabolismo de los lípidos, el tono
vascular y la inflamación (3). La isoforma gamma
del gen PPAR mejora la sensibilidad a la insulina, disminuye
la inflamación, los niveles de ácidos grasos libres
y la presión sanguínea (4-8). Poulsen et al. (1) analizaron
el polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2 en
gemelos con tolerancia a la glucosa normal, encontrando
una alta frecuencia del alelo Ala, evidenciándose así la asociación entre este alelo y una disminución del
riesgo para diabetes mellitus tipo 2 y/o intolerancia a
la glucosa. En Venezuela no existen estudios moleculares
que permitan establecer el riesgo para el desarrollo
de diabetes mellitus tipo 2. Considerando la relación
que se ha descrito entre el polimorfismo Pro12Ala del
PPARg2, SM y la diabetes tipo 2, este estudio preliminar
tuvo como finalidad determinar la prevalencia del polimorfismo
Pro12Ala del PPARg2 en individuos no consanguíneos
con SM.
Materiales y Métodos
Se estudiaron 50 individuos no consanguíneos, (22
con síndrome metabólico y 28 sin síndrome metabólico),
con edades comprendidas entre 22-58 años que
fueron atendidos entre septiembre de 2006 y febrero
de 2007, en la consulta de Enfermedades Metabólicas
del Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr. Américo
Negrette" (Maracaibo, Venezuela). El criterio de inclusión
fue: haber nacido en la ciudad de Maracaibo, con
al menos un padre nacido en esta ciudad. Los individuos
con hipertiroidismo, enfermedad hepática crónica,
enfermedad renal crónica, infección aguda, enfermedad
hematológica, historia familiar de diabetes,
enfermedad cardiovascular y tratamiento farmacológico
para hipertensión, hipercolesterolemia y diabetes
mellitus tipo 2, fueron excluidos del estudio. Todos los
participantes del mismo firmaron su consentimiento
luego de que se les explicara la naturaleza del mismo.
El protocolo de esta investigación fue aprobado por el
Comité de Ética del Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr. Américo Negrette".
A cada sujeto se le realizó una historia clínica, donde
constó la información sobre sus hábitos tabáquico y
alcohólico. Se midieron los parámetros antropométricos
tales como peso (Kg), talla (cm), y circunferencia
de cintura (cm) a nivel umbilical. Se calculó el índice
de masa corporal (IMC) empleando la fórmula de
Quetelet (Kg/m2). La presión arterial (Korotkoff 5ta
fase), se midió empleando un esfingomanómetro de
mercurio estándar, en el brazo derecho, en posición
sentada, realizando tres mediciones con un intervalo
de un minuto, obteniendo un promedio de ellas.
Para el diagnóstico del síndrome metabólico se
consideraron los criterios establecidos por el ATP III
(9), que se indican a continuación:
Los sujetos con tres o más alteraciones se clasificaron
como individuos con síndrome metabólico.
A cada individuo, después de 12 horas de ayuno, se
le tomó una muestra de sangre venosa que se centrifugó a 3.000 rpm durante 15 min para obtener suero. Se
determinaron los niveles de glicemia, triglicéridos, colesterol
total, col-HDL, TGO (ASAT, aspartato aminotransferasa)
y TGP (ALAT, alanin aminotransferasa)
empleando métodos enzimáticos en un equipo analizador
automático de química sanguínea (Autohumalyser
900 S plus, Wiesbaden, Alemania). Se calculó el
col-LDL empleando la fórmula de Friedewald (10).
La muestra de ADN genómico se obtuvo aplicando
la técnica combinada de extracción de ADN a partir de las técnicas Fenol/Sevag (11) e Inorgánica (12). Para
tal fin se extrajeron de cada individuo en estudio, 5
mL de sangre periférica, con ácido etilendiamino tetracético
(EDTA) 5 mM pH 7,4. La amplificación del
ADN genómico se realizó por medio del análisis de
PCR-RFLP, siguiendo la metodología realizada por Oh
et al. (13). El producto amplificado se verificó mediante
una electroforesis en gel de agarosa al 2%, empleando
5 μL de producto amplificado con 2 μL de la mezcla
de los colorantes Azul de Bromofenol y Azul de
Xilencianol 1:1 y 30% de glicerol. Se utilizó como marcador
de peso molecular (MPM) el f174 digerido con
Hae III, el cual se tiñó con bromuro de etidio. El fragmento
de ADN una vez amplificado fue sometido a
una reacción de digestión enzimática, empleando la
enzima BstU-I (New England, BioLabs Inc.). La caracterización
de los productos digeridos se llevó a cabo
realizando una electroforesis en un gel de agarosa al
2,5%, con buffer TE1X a 100 V, utilizando como MPM
el f174 con Hae III (Fig. 1).
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa del polimorfismo
Pro12Ala: 1 MPM: Marcador de peso molecular f174 con Hae III.
2: Control sin digestión enzimática, 3: Individuo con el genotipo
Pro/Ala 4: Individuo con el genotipo Pro/Pro.
MÉTODOS ESTADÍSTICOS
La diferencia estadística en la frecuencia alélica entre el grupo de individuos con SM y el grupo de individuos sin SM fue determinada empleando el paquete estadístico SAS versión 8.2. Para confirmar la diferencias entre los grupos de genotipos y para determinar el equilibrio de Hardy-Weinberg se empleó la prueba Chi-cuadrado (χ2). La influencia del genotipo en los parámetros clínicos fue estimada por el LSMEANS. El valor de p<0,05 fue considerado significativo.
Resultados
De acuerdo con los resultados mostrados en la Tabla I, el 44% (22/50) de los individuos estudiados se diagnosticaron con síndrome metabólico. Los niveles promedios de peso e IMC fueron significativamente diferentes entre los sujetos con y sin SM. Los niveles de triglicéridos, presión arterial sistólica y diastólica, aún cuando se encontraban dentro de los valores normales, fueron significativamente superiores (p<0,05) en los sujetos con SM comparados con los individuos sin SM. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la edad promedio de los sujetos con y sin SM. Ambos grupos presentaron niveles de col-HDL bajos.
Tabla I. Características bioquímicas y antropométricas de la población estudiada.
Para evaluar la función hepática en los individuos
con y sin síndrome metabólico se midieron las enzimas
TGO y TGP. La media para la TGO en mujeres fue de
26,77±5,58 U/L y en hombres 20,50±7,14 U/L; en el caso
de la TGP se encontraron medias de 23,33±5,24 U/L
en mujeres y 16,00±4,08 U/L en hombres; todos los valores
estuvieron dentro de los rangos de referencia.
Cuando se determinó la distribución genotípica del
polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2 se encontró que el 76% (38/50) de los individuos estudiados presentaron
el genotipo homocigoto Pro/Pro y el 24%
(12/50) el genotipo heterocigoto Pro/Ala (Tabla II),
no se encontraron individuos con el genotipo Ala/Ala.
La frecuencia para el alelo Pro fue de 0,88 y para el
Ala fue de 0,12. Cuando se clasificaron de acuerdo con
la presencia o ausencia de SM, se observó que en los
sujetos con SM la frecuencia del alelo Pro fue de 0,93
y para el Ala fue de 0,068; en los sujetos sin SM fue de
0,839 y 0,16 para el alelo Pro y Ala, respectivamente.
Se encontró una asociación entre el polimorfismo y
los elementos que definen el SM, observándose que
los individuos con y sin SM con el alelo Ala, presentaron
los niveles más bajos de triglicéridos y col-HDL
más alto, cuando se los comparó con los sujetos con el
alelo Pro, encontrándose que no hubo significancia estadística.
Tabla II. Distribución genotípica del polimorfismo Pro12Ala en los individuos en estudio.
La población estudiada se encontró en equilibrio
genético de Hardy-Weinberg para este polimorfismo.
La frecuencia para el genotipo Pro/Pro fue mayor en
el grupo con SM, mientras que en los individuos sin
SM el genotipo Pro/Ala fue mayor. No se encontraron
diferencias estadísticamente significativas entre
las proporciones de los diferentes genotipos del polimorfismo
Pro12Ala y los grupos estudiados (Tabla II).
Con respecto a las características fenotípicas evaluadas
en la población estudiada, se observaron niveles de
triglicéridos y presión arterial diastólica significativamente
más bajos en los heterocigotos Pro/Ala, en
comparación con los individuos homocigotos Pro/Pro
en el total de la muestra analizada. En las mediciones
de la circunferencia de cintura, IMC, glicemia basal,
niveles de col-HDL y presión arterial sistólica no se observaron
diferencias estadísticamente significativas entre
los individuos con genotipo Pro/Pro y Pro/Ala en
la muestra estudiada (Tabla III).
Tabla III. Características bioquímicas, antropométricas y el polimorfismo Pro12Ala
En los individuos con SM con el genotipo Pro/Pro,
al ajustar los valores por IMC se encontró asociación
positiva significativa (p<0,05) entre la circunferencia
de cintura y los niveles de col-HDL y entre los niveles
de triglicéridos y la presión arterial sistólica. Cuando
se ajustaron los valores por IMC se mantuvo la asociación
entre triglicéridos y la presión arterial sistólica.
Sólo tres individuos con el genotipo Pro/Ala presentaron
SM en los que se encontraron niveles más bajos de
triglicéridos y col-HDL más alto comparados con los
sujetos con el alelo Pro, similar a lo observado en sujetos
sin SM (datos no mostrados).
En el grupo de individuos sin síndrome metabólico
y con el genotipo Pro/Pro, al ajustar los valores por
IMC se encontró asociación positiva significativa
(p<0,05) entre triglicéridos y col-HDL. En los sujetos
con el genotipo Pro/Ala, al ajustar los valores por
IMC, se encontró asociación positiva significativa
(p<0,05) entre presión arterial diastólica y glicemia.
Discusión
En este estudio las características del SM encontradas
con mayor frecuencia fueron la disminución del
col-HDL en el 82% de la población estudiada, obesidad
abdominal en el 70% de los sujetos en estudio, e
hipertensión arterial en el 40%. Estos resultados fueron
superiores a los reportados para el estado Zulia
(2), lo cual podría relacionarse con el número de individuos
estudiados y con los estrictos criterios de inclusión
usados. La combinación de estos tres factores
incrementa el riesgo de esta población para insulino
resistencia, diabetes y enfermedad cardiovascular.
Al analizar la distribución genotípica del polimorfismo
Pro12Ala del gen PPARg2, el genotipo Pro/Pro
se encontró en el 76% y el Pro/Ala en el 24% de los
individuos estudiados, similar a lo informado para la
población caucásica (14-16). El genotipo Ala/Ala no
fue encontrado, posiblemente a causa del reducido tamaño
de la muestra analizada. Un estudio realizado
en 2.245 sujetos no diabéticos daneses (17) informó que solamente 56 individuos (2,5%) fueron homocigotos
para el alelo Ala, el cual es el menos frecuente.
Se ha establecido que se requiere un tamaño de muestra
grande para probar la asociación entre el Pro12Ala
y diabetes tipo 2, debido al efecto modesto del alelo
Pro. Aunque tiene poco efecto sobre el individuo, esta
variante tiene un efecto sustancial sobre la población,
ya que la frecuencia del alelo Pro es muy común. En la
población estudiada la frecuencia alélica fue 0,12 mayor
a la informada en la población blanca de Brasil por
Tavares, et al. (18) y similar a la frecuencia encontrada
en poblaciones caucásicas (6)(16-19). En la población
de Maracaibo, el componente caucásico representa el
73,14% de la mezcla trirracial característica de la misma
(20)(21). Los antecedentes genéticos de las poblaciones
estudiadas podrían explicar las diferencias observadas
en los resultados obtenidos.
Existen controversias del efecto protector del alelo
Ala al asociarlo con el SM (17) y diabetes tipo 2
(7)(8)(15)(18)(22-26). En el presente estudio se encontró una asociación entre algunas de las características
que definen el SM y la presencia del alelo Ala sólo en el
grupo sin SM. Estos individuos presentaron menores niveles
de triglicéridos y col-HDL más alto, con valores de
presión diastólica inferiores a 85 mmHg, contribuyendo
a la disminución del riesgo para desarrollar SM. El hecho
que no se haya encontrado esta asociación en los individuos
con SM, podría explicarse porque una vez que
el cuadro clínico se encuentra avanzado en el individuo,
el alelo Ala no ejerce su efecto protector tal como lo informaron
por Stumvoll, et al. (4).
La circunferencia de cintura fue significativamente
más baja en el grupo sin SM, tanto en los portadores
del genotipo Pro/Pro como en los Pro/Ala, diferente
a lo informado por Valve, et al. (27) y Meirhaeghe, et
al. (28) quienes al estudiar estas características en mujeres
obesas e individuos con diabetes tipo 2, encontraron
un aumento de la circunferencia de cintura en los
individuos con los genotipos Pro/Ala y Ala/Ala. En este
estudio, los individuos con el genotipo Pro/Ala sin
SM presentaron el IMC más bajo, no observándose esta
característica en los sujetos con SM con el mismo genotipo.
Deeb, et al. (6), encontraron que el alelo Ala
estuvo asociado a IMC más bajo, niveles de insulina en
ayunas menores, y mayor sensibilidad a la insulina,
mientras que Ek, et al. (29) establecieron que la heterocigosidad
de la variante del codón 12 no estuvo asociada
con diferencias en el IMC o cambios en la regulación
del peso durante el seguimiento en sujetos
delgados u obesos. Sin embargo, en los obesos portadores
del genotipo Ala/Ala, se observó un mayor IMC y mayor ganancia de peso en su seguimiento, al ser
comparados con los obesos portadores del genotipo
homocigoto Pro, mientras que el grupo de sujetos delgados
portadores del genotipo homocigoto Ala tuvo
menor IMC y menor incremento en el IMC a lo largo
de su seguimiento, al ser comparado con los homocigotos
Pro/Pro.
El presente estudio reveló que los niveles de triglicéridos
de los individuos con el genotipo Pro/Ala estuvieron
un 43% por debajo de los valores obtenidos
en los sujetos que presentaron el genotipo Pro/Pro
en el grupo general. Al estratificar el grupo completo
en base a la presencia o no del SM, se encontraron resultados
similares. Frederiksen, et al. (17), informaron
aproximadamente 30% de reducción en los niveles de
triglicéridos en individuos daneses con la variante genotípica
Ala/Ala, sin síndrome de insulino resistencia.
Del mismo modo, Douglas, et al. (8) encontraron
niveles más bajos de triglicéridos en individuos con
genotipo Pro/Ala y Ala/Ala. En este estudio, los individuos
con el genotipo Pro/Ala, con y sin SM, presentaron
niveles de col-HDL más elevados que los individuos
con el genotipo Pro/Pro. Deeb, et al. (6) informaron niveles más altos de col-HDL en los individuos
con el genotipo Ala/Ala al compararlos con los
Pro/Pro y Pro/Ala. Existen diversos trabajos que han
informado que no existe asociación entre la presencia
del polimorfismo Pro12Ala y los niveles de colesterol
total, col-HDL, col-LDL o triglicéridos en poblaciones
de latinos y europeos (17)(23)(30).
Por otra parte, se encontró una disminución estadísticamente
significativa en la presión arterial diastólica
entre los individuos con genotipo Pro/Pro y
Pro/Ala sin SM. Según estos resultados, la PAD no se
encontró asociada al genotipo sino más bien al hecho
de no presentar SM. Estudios previos (31) han informado
una relación baja entre hipertensión y col-HDL,
siendo ambos componentes del SM. Se ha establecido
que el conjunto de estos componentes, más que su
efecto individual, aumenta el riesgo cardiovascular
(32). La asociación entre la variante Pro12Ala y la presión
arterial no está clara. Frederiksen, et al. (17) observaron
que los sujetos que presentaban el genotipo
homocigoto Ala/Ala tuvieron menores niveles de presión
arterial diastólica mientras que Douglas, et al. (8) informaron un aumento de la presión diastólica en los
individuos con el genotipo Pro/Ala y Ala/Ala. Por otra
parte, no se encontró asociación entre los niveles de
glicemia basal y el polimorfismo Pro12Ala, similar a lo
observado por Tavares, et al. (18).
En conclusión, la presencia del alelo Ala en individuos
con SM mostró un efecto protector sobre el perfil
lipídico de los sujetos estudiados y en los individuos
sin SM tuvo un mejor efecto sobre las variables antropométricas
y presión arterial, disminuyendo el riesgo
para el desarrollo del mismo.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por CONDES-LUZ Nº 0589-04
CORRESPONDENCIA
MGSC. ERIKA FERNÁNDEZ
Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr. Américo Negrette"
Facultad de Medicina. La Universidad del Zulia
Calle 65 con AV 18 A planta baja apartado postal 23
MARACAIBO, Venezuela
Tel.: (58) 04146031823 Fax: (58) 02617597247
E-mail: erikafernandez2002@yahoo.com; erfernandez@luz.edu.ve
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Aceptado para su publicación el 16 de diciembre de 2008