INMUNOHEMATOLOGÍA
Identificación de epitopes Tipo Grupo Sanguíneo ABO en larvas de Ascaris lumbricoides mantenidas in vitro
Identification of ABO Blood Group like epitopes in vitro maintained Ascaris lumbricoides larvae
Patricia Ponce de León1 *, Patricia Foresto2 **, Juana Valverde2 **
1. Bioquímica
2. Doctora en Ciencias Bioquímicas
* Laboratorio de Parasitología. Facultad de
Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR
** Laboratorio de Inmunohematología, Hemorrelogía
e Inmunogenética. Facultad de Cs.
Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR
Resumen
En investigaciones previas se identificaron los mismos epitopes del Sistema ABO en extractos de A. lumbricoides y en sus respectivos hospederos. Los objetivos de este trabajo fueron estudiar la absorción de determinantes antigénicas ABO por cultivo in vitro de estadios larvales de este helminto e investigar la presencia de sustancias Tipo Grupo Sanguíneo ABO en los productos de secreción/excreción de las larvas. Se trabajó con larvas obtenidas de la eclosión de huevos de A. lumbricoides y recolectadas por el método de Baermann en cinco tubos con medio RPMI 1640. En tres de los tubos se adicionaron eritrocitos (A, B y O). Los dos tubos restantes se usaron como control negativo de absorción y para investigar los productos de excreción- /secreción de las larvas. Se aplicaron técnicas de Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa usando anticuerpos monoclonales. Los resultados mostraron que las larvas absorben epitopes A, B y H de los eritrocitos agregados al medio de cultivo. Se identificaron sustancias Tipo A y B en los productos de excreción/secreción de las larvas. La experiencia puede contribuir a la comprensión de los mecanismos de evasión de la respuesta inmune del hospedero utilizados por A. lumbricoides.
Palabras clave: Epitopes ABO; Cultivo; Larvas; Ascaris lumbricoides
Summary
Previous experiences have demonstrated the same ABO System epitopes in A. lumbricoides extracts and in their hosts. The aims of this work were to study ABO antigenic determiner absorption by in vitro culture of the helminth's larvae and to investigate ABO-Blood-Group-like substances in larvae's excretion/ secretion products. Larvae were obtained by hatching of A. lumbricoides eggs. The larvae were collected in 5 tubes with RPMI 1640 medium by the Baermann method. A, B and O erythrocytes were added in 3 of the tubes. The two remaining tubes were used as absorption Negative Control and to investigate larvae's excretion/secretion products. The Semiquantitative Inhibition Agglutination Test was applied by using monoclonal antibodies. The results showed that the larvae may adsorb A, B and H epitopes from the erythrocytes that were added to the culture medium. A and B-Blood-Group-like substances were identified in the excretion/secretion products. The experience can contribute to understand the host's escape mechanism used by A. lumbricoides.
Keywords: ABO epitopes; Culture; Larvae; Ascaris lumbricoides
Introducción
Durante las últimas décadas se ha comunicado que
los antígenos de Grupo Sanguíneo no sólo pueden actuar
como receptores de parásitos, sino que también
pueden estar presentes sobre la superficie de muchas
especies parásitas (1)(2). Se supone que este hecho se
debe a que el parásito recubre su membrana o cutícula
con antígenos del hospedero a los fines de evadir su
respuesta inmune, en un mecanismo de mimetismo
molecular (3)(4). Las primeras experiencias para explicar
este fenómeno en parásitos la realizó Clegg con
Schistosoma mansoni (5).
En investigaciones previas se identificaron antígenos
del Sistema ABO en extractos de Ascaris lumbricoides aplicando técnicas de Inhibición de la Aglutinación
y se observó que los parásitos podían expresar las
mismas determinantes antigénicas ABO que sus respectivos
hospederos (6-9). Los objetivos del trabajo
fueron: investigar la presencia de sustancias Tipo Grupo
Sanguíneo ABO en los productos de secreción/excreción
de las larvas de A. lumbricoides, y estudiar la absorción
de determinantes antigénicas ABO por cultivo in vitro de estadios larvales del parásito, a los fines de
determinar el mecanismo por el cual A. lumbricoides adquiere estos epitopes.
Materiales y Métodos
OBTENCIÓN DE ESTADIOS LARVALES DE A. LUMBRICOIDES
Se trabajó con estadios larvarios obtenidos a partir de heces con huevos de este helminto. Los huevos se concentraron por el método de flotación de salmuera (10), se lavaron 3 veces en agua destilada y se colocaron en SO4H2 0,1 N durante 12 a 24 días a 37 ºC hasta la observación microscópica de huevos larvados (11). Se consideró que los estados larvales eran una mezcla de larvas de primer y segundo estadio (L1/ L2) debido a comunicaciones sobre el tiempo requerido para el desarrollo de la larva durante la embrionación in vitro (12). Se tomaron alícuotas del sedimento fecal con los huevos larvados y se neutralizaron con igual volumen de buffer fosfato 0,5 M pH 7. Se lavaron 3 veces en agua destilada, y se procedió a la remoción de la cubierta de los huevos con hipoclorito de sodio 1% a 37 ºC en atmósfera del 5% de CO2 durante 30 min. A continuación se lavaron 3 veces en agua destilada estéril y 3 veces en el mismo buffer suplementado con antibióticos (vancomicina 300 μg/mL; colistina 750 μg/mL; nistatina 1250 U/ mL; trimetoprima 500 μg/mL). Los huevos larvados se colocaron en el medio de eclosión a 37 ºC agitando constantemente durante 1 a 2 horas hasta la liberación completa de las larvas.
MEDIO DE ECLOSIÓN
Por cada 0,5 mL de suspensión de huevos, se adicionó:
1 mL de bisulfito de sodio 0,1 M y 1 mL de cloruro
de sodio 0,25 M (pre-gaseado conteniendo 0,0025% de
Tween 80 y 0,1 M de bicarbonato de sodio) (11).
Las larvas (L1/ L2) fueron recolectadas por el método
de Baermann-Moraes (13) en medio RPMI 1640
(Gibco) al cabo de 2 horas a la misma temperatura. Este
medio de cultivo es una mezcla de sales enriquecida
con aminoácidos, vitaminas y otros componentes esenciales
para el crecimiento celular. Completada la recolección,
las larvas fueron concentradas por centrifugación
y se procedió al recuento que determinó una
cantidad de 1100 a 1200 larvas/mL.
CULTIVO DE ESTADIOS LARVALES DE A. LUMBRICOIDES
Se tomaron alícuotas de 1 mL del concentrado de
larvas y se sembraron en 4 tubos que contenían 10 mL
de medio RPMI 1640 suplementado (tubos 1, 2, 3 y 4)
y en otro tubo (tubo 5) con 3 mL de este mismo medio.
El medio RPMI 1640 estuvo suplementado con
1% de la mezcla de antibióticos descrita y 1% de complejo
(concentraciones finales del complejo en g/L: vitamina
B12 0,010; L-glutamina 10,0; clorhidrato de
guanina 0,03; adenina 1,0; ácido p-aminobenzoico
0,013; L-cistina 1,10; NAD-coenzima 1- 0,25; cocarboxilasa
0,10; nitrato férrico 0,02; clorhidrato de tiamina
0,003; clorhidrato de cisteina 25,9; Glucosa 100,0).
En los tubos 1, 2 y 3 se agregaron 100 μL de sedimento
de eritrocitos tipificados A, B y O respectivamente.
Los tubos 4 y 5 fueron usados como controles negativos
y para investigar productos de excreción/secreción Tipo
antígenos ABO. Todos los tubos se cultivaron 10 días
a 37 ºC en una atmósfera de N2-CO2-O2 (90-5-5).
ERITROCITOS TIPIFICADOS
Se seleccionaron eritrocitos frescos A, B y O por aglutinación directa enfrentándolos a anticuerpos monoclonales (Wiener: anti-A, Cod 1443152, Lote 603729; anti-B, Cod 143154, Lote 511512). Luego se los lavó tres veces en solución salina y se preparó una suspensión al 1% (100 μL de eritrocitos en 10 mL de solución fisiológica), para que tuviera la misma concentración que la agregada al medio de cultivo. Se titularon los eritrocitos con anticuerpos monoclonales suministrados por "Monoclonal Antibodies against Blood Group Antigens" (Workshop, París, 2001) a los fines de tipificarlos y de esta manera determinar la expresión de epitopes ABO. Para la titulación se realizaron diluciones geométricas seriadas al medio del anticuerpo (volumen final 25 μL) y se adicionó igual volumen de la suspensión de eritrocitos a todos los tubos; se determinó el título como la inversa de la última dilución que presentó aglutinación (14). Los resultados de la titulación de los eritrocitos agregados al medio de cultivo y las características de los anticuerpos monoclonales utilizados para la tipificación, se muestran en la Tabla I.
Tabla I. Titulación de los eritrocitos agregados al medio de cultivo y características de los anticuerpos monoclonales utilizados.
INVESTIGACIÓN DE ANTÍGENOS ABO EN LAS LARVAS
Una vez finalizado el tiempo de cultivo, se procedió a la separación por migración de las larvas (L1/ L2)
de los tubos 1, 2 y 3, utilizando el método de Baermann-Moraes (13) y recolectándolas en buffer fosfato
0,5 M pH 7. Las larvas recolectadas fueron lavadas 3
veces en solución fisiológica y concentradas por centrifugación
(2500-3000 rpm) hasta obtener una concentración
similar de larvas en todos los sedimentos.
Se hizo el recuento y se determinó que la cantidad
era de 200-300 larvas/mL en los 3 tubos.
Los tubos 4 y 5 fueron centrifugados 10 min
(2.500-3.000 rpm) y se separó el medio RPMI 1640 sobrenadante
que se almacenó a -20 ºC hasta el momento
de uso. Los sedimentos con las larvas (L1/ L2) fueron
lavados 3 veces en agua destilada y concentrados
por centrifugación (2.500-3.000 rpm). Se hizo el recuento
de larvas y se determinó que en el tubo 4 había
200-300 larvas/mL y en el tubo 5, la cantidad era
de 600 larvas/mL.
INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN SEMICUANTITATIVA (14)
Se prepararon 2 series de diluciones geométricas
seriadas de cada anticuerpo monoclonal que había reconocido
epitopes expresados por los eritrocitos adicionados
a los medios de cultivo (Workshop, París,
2001) (volumen final 25 μL).
En la primera serie se agregaron 25 μL de solución
fisiológica a todos los tubos y en la segunda, igual volumen
del concentrado de larvas. Se dejó en contacto 30
min a temperatura ambiente. Se reveló agregando 25 μL de una suspensión al 1-3% de eritrocitos frescos de
isogrupo, lavados 3 veces en solución fisiológica. Previamente se probó que los eritrocitos del sistema revelador
expresaran los epitopes ABO hacia los cuales
iban dirigidos los anticuerpos monoclonales utilizados
para la tipificación de los eritrocitos agregados a los
medios de cultivo.
Se determinó el título del anticuerpo monoclonal en
las dos series y se consideró significativa una diferencia de
título igual o mayor a dos diluciones entre ambas.
A los fines de investigar si las larvas presentaban únicamente
epitopes de la misma especificidad que los eritrocitos
agregados al medio de cultivo, se realizó la
Prueba de Inhibición de la Aglutinación enfrentando
también las larvas del tubo 1 a anti-H 2.72 y a anti-B monoclonal
comercial (Wiener, Cod 143154, Lote 511512);
las del tubo 2 a anti-H 2.72 y anti-A monoclonal comercial
(Wiener, Cod 1443152, Lote 603729) y las del tubo
3 a los dos anticuerpos monoclonales comerciales. Para
la realización de esta prueba, de manera similar a la anteriormente
descrita, se titularon los anticuerpos con y
sin el agregado del concentrado de larvas, usando como
sistema revelador eritrocitos de isogrupo. Se consideró significativa una diferencia de título igual o mayor a dos
diluciones.
Se incluyó un testigo negativo de aglutinación en cada
prueba, para lo que se utilizó el concentrado de larvas
del tubo 4 que presentaba una cantidad similar de
larvas/mL a las de los tubos 1, 2 y 3. El testigo negativo
se procesó de la misma manera que los otros concentrados
de larvas.
INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS DE EXCRECIÓN/SECRECIÓN (ES) TIPO GRUPO SANGUÍNEO ABO DE LAS LARVAS
Los medios RPMI 1640 separados de los tubos 4 y 5, se concentraron por centrifugación a 2.500-3.000 rpm durante 15 min. En los sedimentos se realizó la prueba de Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa (14), utilizando anti-A y anti-B monoclonales comerciales (Wiener, anti-A, Cod 1443152, Lote 603729; anti-B, Cod 143154, Lote 511512) y anti- H 2.72. Se prepararon dos series de diluciones de los anticuerpos (volumen final 25 μL). A la primera serie se le agregaron 25 μL de solución fisiológica y a la segunda serie igual volumen de concentrado del medio RPMI 1640. El sistema revelador fue eritrocitos de isogrupo. Se determinó el título del anticuerpo monoclonal en las dos series y se consideró significativa una diferencia de título igual o mayor a dos diluciones entre ambas.
Resultados
IDENTIFICACIÓN DE EPITOPES ABO EN LAS LARVAS
Los concentrados larvales de los tubos 1, 2 y 3 se enfrentaron
a los anticuerpos monoclonales que habían
reaccionado previamente con los epitopes expresados
en los eritrocitos agregados a los medios de cultivo. El
concentrado de larvas del tubo 4 (de similar concentración
en larvas/mL) se usó como control negativo
de las pruebas de Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa.
Las larvas del tubo 1 (en contacto con eritrocitos A),
fueron enfrentadas a 3 anticuerpos monoclonales anti-A. Los resultados mostraron que el concentrado larvario
inhibía de manera significativa al anticuerpo anti-A
2.22, demostrando la presencia de epitopes dirigidos
contra ese anticuerpo en las larvas. A los fines de investigar
si únicamente absorbían epitopes A del medio de
cultivo, se enfrentaron también al anticuerpo anti-H
2.72 y al anti-B monoclonal comercial. Los resultados
mostraron ausencia de epitopes B y H en las larvas cultivadas
con eritrocitos A.
Las larvas del tubo 2 (en contacto con eritrocitos B),
fueron enfrentadas a 5 anticuerpos monoclonales anti-B. Las larvas inhibieron de manera significativa a dos
de estos anticuerpos (anti-B 2.57; anti-B 2.63). También
se investigó la absorción de epitopes A y H en este
concentrado larvario, enfrentándolas a anti-H 2.72
y anti-A monoclonal comercial. Se demostró que las
larvas cultivadas en contacto con eritrocitos B no presentaban
epitopes A y H.
Las larvas del tubo 3 (en contacto con eritrocitos O)
se enfrentaron a los 2 anti-H. Se observó inhibición del
anticuerpo anti-H 2.72. Las larvas fueron enfrentadas
también a los dos anticuerpos comerciales (anti-A y anti-B) y los resultados mostraron que no presentaban
epitopes A y B.
Las experiencias demostraron que las larvas pueden
absorber epitopes de los eritrocitos presentes en
el medio de cultivo. La Tabla II presenta los resultados
de las pruebas de Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa.
Tabla II. Resultados de la Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa para identificación de epitopes ABO en las larvas
IDENTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE EXCRECIÓN/SECRECIÓN TIPO ABO DE LAS LARVAS
La técnica aplicada mostró en el sedimento del tubo
5 (cantidad inicial de RPMI 1640= 3 mL), sustancias
de ES Tipo A y B, tal como se evidenció por la diferencia
significativa de título entre las dos series de
diluciones del anticuerpo monoclonal. En el sedimento
del tubo 4 (cantidad inicial de RPMI 1640=10 mL)
estos productos no fueron evidenciados.
No se detectó sustancias Tipo H en ninguno de los
dos sedimentos.
Los resultados se muestran en la Tabla III.
Tabla III. Resultados de la Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa para identificación de productos de excreción/secreción Tipo ABO de las larvas
Conclusiones
El mimetismo molecular ha sido definido como la
adquisición de moléculas del hospedero sobre la superficie parasitaria o bien la síntesis de moléculas similares,
a los fines de evadir la respuesta inmunitaria.
Se han comunicado experiencias que aportan clara
evidencia de que S. mansoni presenta antígenos A, B, y
H sobre su superficie, cuando es cultivado con sangre
humana. Se demostró que la presencia de una especificidad
particular sobre la superficie de los parásitos era
dependiente de la especificidad presente en la sangre
utilizada para los cultivos (15). En esta experiencia se
demostró el mismo comportamiento, ya que los estados
larvarios de A. lumbricoides expresaron únicamente
al antígeno A, B y H cuando fueron cultivados con el
agregado de eritrocitos A, B y O respectivamente.
Las pruebas de Inhibición de la Aglutinación realizadas
mostraron que las larvas del tubo 1 (cultivadas
con eritrocitos A), sólo expresaron epitopes A contra
el anticuerpo 2-22 y las larvas del tubo 2 (cultivadas
con eritrocitos B), expresaron epitopes B contra dos
de los anti-B monoclonales estudiados (2.57, 2.63). Experiencias
previas, ya habían demostrado heterogeneidad
en la expresión de epitopes ABO en A. lumbricoides (9), pero hasta el momento se desconoce el motivo
de este hecho que estaría relacionado con la absorción
de determinados epitopes de los eritrocitos. Cabe señalar
que en estas pruebas la absorción selectiva de determinados
epitopes no pareció depender exclusivamente
de la cantidad de determinantes antigénicas
presentes en los glóbulos rojos adicionados, ya que no
en todos los casos las larvas expresaron los epitopes
que estaban en mayor cantidad en los eritrocitos adicionados,
tal como se pudo inferir por los resultados
de la titulación de los mismos con los anticuerpos monoclonales
utilizados.
En esta experiencia, la adquisición de antígeno H
sobre la superficie parasitaria solamente ocurrió durante
el cultivo de las larvas con sangre Grupo O, en
coincidencia con las observaciones de Goldring et al.
(15). Estos investigadores sugieren que los parásitos
no absorben epitopes H de eritrocitos A, B y AB pues
si bien la sustancia H está presente en estos, los eritrocitos
(con excepción de eritrocitos A1), la cantidad es
menor que en los eritrocitos O, y posiblemente las determinantes
A y B compitan fuertemente por los sitios
de unión de la superficie del parásito (15). Si bien esta
explicación de competición de las determinantes
antigénicas por los sitios de unión a la membrana parasitaria
es lógica y podría ser cierta, posiblemente
exista también otro mecanismo de absorción selectiva,
pues de lo contrario se hubiera encontrado en los concentrados
larvarios siempre las determinantes antigénicas
A y B expresadas en mayor cantidad en los eritrocitos
adicionados.
Los productos de ES Tipo ABO (A y B) fueron detectados únicamente en el tubo 5, que tenía una cantidad
de medio de cultivo menor. Esto se podría deber a
que las larvas de este tubo estaban más concentradas lo
que permitió la detección de los productos de ES con
la técnica de Inhibición de la Aglutinación utilizada.
Se ha comunicado el hallazgo de sustancias semejantes
a los antígenos de Grupo Sanguíneo ABO en los
productos de ES de larvas de Toxocara canis. Smith y et
al. han informado que los productos de ES de larvas de
segundo estadio mantenidas en cultivo, fueron capaces
de neutralizar la reactividad de anti- A y anti -B policlonal
humano contra sus respectivos eritrocitos (16).
También se ha demostrado la presencia de títulos
elevados de isohemaglutininas anti A y anti B en toxocariasis
(17), que podría deberse a los productos de ES
de las larvas.
No se detectó productos de ES Tipo sustancia H en
las condiciones de esta experiencia.
Aunque estos resultados fueron obtenidos bajo determinadas
condiciones experimentales de cultivo in
vitro, los hallazgos demuestran que la absorción es el
mecanismo de adquisición de epitopes ABO en A.lumbricoides.
Se sugiere que, in vivo, el parásito podría adquirirlos
durante la migración larvaria por el torrente
circulatorio.
Esta experiencia también demostró que dentro de
los productos de excreción/secreción de los estadios
larvarios de este nematodo hay sustancias Tipo antígenos
ABO capaces de reaccionar con anticuerpos A y B.
Estos resultados pueden aportar información para
la comprensión del complejo mecanismo de evasión
de la respuesta inmune del hospedador utilizado por
A. lumbricoides.
CORRESPONDENCIA
PATRICIA PONCE DE LEÓN
Laboratorio de Parasitología. Dpto de Microbiología
Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Suipacha 531
2000 ROSARIO
E-mail: tefu1958@hotmail.com
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Aceptado para su publicación el 24 de noviembre de 2008