INMUNOLOGÍA
Detección de anticuerpos anti-R7V en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana
Detection of anti-R7V antibodies in patiens infected with the human immunodeficiency virus
Hilda Emilia Scandizzo1 *, Judith Celina Bernstein2 **
1. Bioquímica.
2. Médica Infectóloga.
* Sector de Inmunoserología del Laboratorio
del Hospital Zonal General de Agudos Mi
Pueblo. Progreso 240. Florencio Varela
(CP 1888).
** Unidad de Infectología. Hospital Zonal General
de Agudos Mi Pueblo. Provincia de
Buenos Aires. Argentina.
Resumen
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) incorpora antígenos celulares a la superficie viral durante el proceso de gemación, entre ellos la b2- microglobulina perteneciente al Complejo Mayor de Histocompatibilidad Clase I. El epitope R7V derivado de la b2-microglobulina se encuentra en la superficie del virión y es capaz de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes anti-R7V, cuya presencia se relaciona con la no progresión de la enfermedad. Se utilizó el método ELISA para el análisis de muestras provenientes de la población de pacientes VIH positivos durante el periodo junio-2006 a junio-2007 obteniéndose los siguientes resultados: De 12 pacientes no progresores asintomáticos en un período promedio de 5 años (rango 2-13 años), 5 (41%) fueron positivos para anti-R7V; de 14 pacientes progresores que recibían terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), 2 (14%) fueron positivos para anti-R7V. Se observó una diferencia en los resultados obtenidos en los dos grupos, aunque estadísticamente no fue significativa (OR 4,29; 0,49-53,56; p=0,11) como para establecer una concordancia entre la no progresión y la presencia de anti-R7V. En la medida que puedan estudiarse mayor número de pacientes es factible pueda demostrarse la correlación entre la no progresión y la presencia de anticuerpos anti-R7V, lo que constituye un desafío en el desarrollo de nuevos alcances terapéuticos.
Palabras clave: Anticuerpos anti-R7V; Pacientes no progresores; Prueba de ELISA
Summary
The Human Immunodeficiency Virus incorporates cellular antigens to its viral surface during the budding process, among them b2-microglobulin which is part of the Major Histocompatibility Complex Class I. The R7V epitope derived from b2 microglobulin is present on the virion surface and is able to induce the formation of neutralizing antibodies against R7V, whose presence is associated with non-progression of the illness. ELISA test was Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana performed for testing of samples from our population of HIV-positive patients during the June- 2006 to June-2007 period, and the following results were obtained: 5 (41 %) of 12 non-progressor patients, asymptomatic for a period of 5 years average (range 2-13 years) were positive for anti-R7V; 2 (14%) of 14 progressor patients receiving hightly activity antiretroviral therapy (HAART) were positive for anti-R7V. A difference was observed between the results of the two groups but it was not statistically different (OR 4.29; 0.49-53.36; p=0.11) to establish a concordance between non-progression of the disease and the presence of anti-R7V antibodies. The correlation between non progression and the presence of anti-R7V will be proved, as larger numbers of patients are tested, which represents a challenge for the development of new therapies.
Key words: Anti-R7V antibodies; Non-progressor patients; ELISA test.
Introducción
La característica principal de la infección por el virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH) es la inmunodeficiencia
provocada por el déficit progresivo,
cualitativo y cuantitativo de los linfocitos T, los cuales
tienen en su superficie la molécula CD4 que funciona
como principal receptor del VIH (1).
El mecanismo por el cual el VIH penetra en la célula
huésped se inicia con la unión de la glicoproteína
de envoltura gp120 del virus con ciertos epitopes de la
molécula CD4 de la célula (2), lo cual induce cambios
conformacionales en la gp120, promoviendo una interacción
más eficiente con su respectivo correceptor
(receptores de quimiocinas CCR5 o CXCR4) (3). Luego
del enlace la gp41 del virus inserta su grupo amino
terminal en la membrana celular y a continuación se
lleva a cabo la fusión que permite al virus penetrar en
la célula (4). Durante el proceso de fusión algunos epitopes
virales quedan temporariamente expuestos y
pueden inducir la formación de anticuerpos neutralizantes
(5). La aparición de anticuerpos neutralizantes
suele observarse aproximadamente a partir de las
ocho semanas posteriores a la infección por VIH (6).
El VIH replica dentro de la célula huésped e independientemente
de su tropismo o genotipo incorporará durante el proceso de gemación proteínas de la membrana
celular de la célula huésped a su envoltura tales
como proteínas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(CMH) Clase I y II, o proteínas de adhesión
como la molécula intracelular de adhesión tipo I
(ICAM-1) que puede facilitar la adhesión a otras células
huésped (7)(8). La b2-microglobulina está ligada
en unión no covalente a la cadena a del CMH clase I
y el estudio de péptidos derivados de la secuencia aminoácida
de la b2-microglobulina permitió seleccionar
el epitope llamado R7V, un heptámero (RTPKIQV), capaz
de bloquear la neutralización del VIH cuando se
mezclaba con anticuerpos neutralizantes conocidos (9).
Este péptido R7V se utilizó para desarrollar una prueba
de ELISA que permite detectar la presencia de anticuerpos
anti-R7V en pacientes infectados por el VIH.
La presencia de los anticuerpos neutralizantes anti-
R7V es fuertemente asociada a la no progresión de la
enfermedad (10)(11). En la actualidad no se ha demostrado
si la presencia de anticuerpos neutralizantes
en los pacientes no progresores (NP) representan parte
de la protección o son el reflejo de mantener un sistema
inmune relativamente intacto(12).
El elevado grado de mutación del virión, especialmente
a nivel de sus proteínas de envoltura, significa
que es muy difícil pero no imposible producir anticuerpos
protectores (7). Un anticuerpo ideal es aquel
que mantendrá su actividad protectora contra un diverso
panel de virus aislados primarios y estará dirigido
hacia epitopes conservados de las proteínas de envoltura,
que no se alteren en respuesta a presiones
selectivas. La b2-microglobulina está presente en todas
las células y es una proteína altamente conservada, por
lo cual no existe el problema de variabilidad de las glicoproteínas
virales. Los anticuerpos dirigidos contra el
péptido R7V no producen reacciones autoinmunes, ya
que se ha demostrado que este epitope se encuentra
encriptado sobre la superficie celular (8). El objetivo
de este trabajo fue la detección de anticuerpos neutralizantes
anti-R7V en pacientes VIH positivos, especialmente
en pacientes no progresores para tratar de establecer
la relación entre la no progresión clínica y la
presencia de estos anticuerpos, ya que de comprobarse
esta concordancia permitiría en el futuro avanzar sobre
nuevas terapias. Se incluyeron en las determinaciones
a mujeres embarazadas asintomáticas que fueron diagnosticadas
durante el control prenatal de rutina y cuyos
hijos no nacieron infectados por el VIH (14).
Materiales y Métodos
La prueba de ELISA para la búsqueda de anticuerpos anti-R7V consiste en una técnica de enzimoinmunoensayo en microplaca (Anti-R7V ELISA, IVAGEN, Nimes, Francia). El péptido R7V está fijado covalentemente en el fondo de cada vial de la microplaca y la presencia de anticuerpos se detecta por un conjugado enzimático (anti-IgG humana de cabra unida a peroxidasa de rábano picante). La prueba se compone de tres pasos: 1) El suero o plasma del paciente, los controles y calibradores del equipo se diluyen con el buffer provisto y distribuyen en los viales de la microplaca de la siguiente manera: A1: Blanco (buffer diluyente); B1 y C1: Control negativo por duplicado; D1, E1 y F1: Calibrador por triplicado; G1 y H1:Controles positivos por duplicado; y por último las muestras por duplicado. Se cubren las placas con material adhesivo para evitar evaporaciones y se incuban a 37 ºC durante 30 min. Si hay anticuerpos anti-R7V presentes en la muestra del paciente son capturados por el péptido R7V fijado en los viales. Posteriormente se procede al aspirado y a una serie de cuatro lavados de la microplaca en la lavadora de placas, con una solución de buffer fosfato -Proclin 300 para eliminar el material no fijado. 2) Se añade a cada vial el conjugado y se incuba nuevamente la placa cubierta para permitir la unión del conjugado al anti-R7V, capturado en la primera incubación. Luego, se aspira y lava profundamente la placa para eliminar el material no unido. La peroxidasa unida, indicadora de la presencia de anticuerpos anti-R7V, se detecta con la adición del sustrato enzimático (cromógeno) 3,3', 5,5' tetrametilbencidina (TMB). Se deja reposar la placa destapada durante 10 min a temperatura ambiente; se detiene la reacción con el agregado de ácido clorhídrico diluido. La densidad óptica de cada vial se lee en lector de microplacas a DO 450 nm.
CÁLCULOS E INTERPRETACIÓN
Para que la prueba sea válida se deben tener en cuenta los siguientes parámetros: la densidad óptica (DO) del blanco debe ser <0,100. La lectura del blanco debe restarse a todas las DO obtenidas.
DO control negativo<0,200
DO calibrador<DO control positivo
DO calibrador>2,5 x DO control negativo.
Cada DO de las muestras se compara con la DO del calibrador, de la siguiente manera:
R= DO muestra/ DO Cal
Si R<0,8 : anti-R7V negativo
Si R 0,8-1,2 : ZONA GRIS, resultado no concluyente
Si R>1,2: anti-R7V positivo.
Se definió como paciente no progresor (NP) a
aquel asintomático que mantiene un recuento de linfocitos
CD4+ y carga viral con valores estables. Se consideró paciente progresor (PP) a aquel que presenta
progresión clínica, descenso del recuento de linfocitos
CD4+ en un 30-50% del valor absoluto respecto al basal
en dos mediciones en el mismo citómetro de flujo
con al menos dos meses de diferencia y aumento de la
carga viral mayor a 0,5-1 log10 copias o fracaso en lograr
el descenso deseado(13).
Se estudiaron 11 pacientes NP que no recibían medicación
al momento de ser analizados; 14 PP que recibían
terapia antirretroviral de gran eficacia (TARGA),
1 paciente NP que recibía TARGA (coinfectado
con el virus de la hepatitis C), 1 PP sin TARGA por fallo
en la adherencia, y por último 9 embarazadas que
fueron diagnosticadas durante el embarazo cuando se
les realizó el análisis de rutina para VIH junto a sus respectivos
hijos recién nacidos.
Resultados
Los resultados obtenidos fueron: DO Control negativo 0,100; DO Control positivo 1,110 y DO Cal 0,610, los cuales cumplían las reglas establecidas anteriormente. De 11 pacientes NP sin tratamiento al momento de ser estudiados (Tabla I) y 1 paciente NP que recibía TARGA, coinfectado con virus de la hepatitis C (Tabla II), 5 (41%) fueron positivos para anti- R7V. De 14 PP que recibían TARGA (Tabla III) sólo 2 (14%) resultaron positivos; en 1 PP sin TARGA por fallo en la adherencia (Tabla IV) se obtuvo un resultado negativo. De las 9 embarazadas y sus respectivos hijos recién nacidos, 1 (11%) resultó positiva y el resultado de la prueba en el neonato fue en zona gris debido a los anticuerpos maternos (Tabla V). Los resultados en zona gris deben ser repetidos con nuevas muestras en el futuro. A las pacientes embarazadas se les realizó la búsqueda de anti-R7V antes de comenzar la profilaxis antirretroviral indicada para disminuir el riesgo de transmisión vertical.
Tabla I. Prevalencia de anticuerpos anti-R7V en pacientes no progresores que no reciben terapia antirretroviral de gran actividad, según parámetros epidemiológicos y de laboratorio.
Tabla II. Dosaje de anticuerpos anti-R7V en paciente no progresor que recibe terapia antirretroviral de gran actividad; parámetros epidemiológicos y de laboratorio.
Tabla III. Prevalencia de anticuerpos anti-R7V en pacientes progresores que reciben terapia antirretroviral de gran actividad, según parámetros epidemiológicos y de laboratorio.
Tabla IV. Dosaje de anticuerpos anti-R7V en paciente progresor sin terapia antirretroviral de gran actividad; parámetros epidemiológicos y de laboratorio.
Tabla V. Prevalencia de anticuerpos anti-R7V en pacientes
embarazadas asintomáticas diagnosticadas en el control prenatal y
en sus respectivos neonatos.
Referencias: (HMI) Hijo de madre infectada.
El paciente NP con TARGA recibía como tratamiento 2 drogas que actuaron como inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI) y 1 inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa (NNRTI). La paciente progresora sin TARGA presentó como enfermedad marcadora una Lesión Intraepitelial Escamosa (SIL) de Alto Grado-CIN III originada por la infección por el Virus del Papiloma Humano (HPV). Dentro del grupo de PP que recibían TARGA, se obtuvieron 2 resultados positivos para anti-R7V; 1 es hijo de madre infectada, cuya enfermedad marcadora fue parotiditis recurrente y el otro paciente presentó infección por Pneumocystis jiroveci. Ambos recibían 2 NRTI + 1 NNRTI. El resultado en la zona gris de este grupo correspondió a una paciente que presentó tuberculosis pulmonar-candidiasis esofágica - neumonía bacteriana recurrente y síndrome de desgaste asociado al VIH; cumplía tratamiento con 2 NRTI + 1 NNRTI.
Discusión y Conclusiones
Como resultado del análisis a la población estudiada, de 12 NP, 5 (41%) resultaron positivos y de 14 PP, 2 (14%) fueron positivos, para anti-R7V, lo cual permite concluir que existe una diferencia entre los resultados de los dos grupos, si bien ésta no es aún estadísticamente significativa (OR 4,29; 0,49-53,36; p=0,11) de forma tal que permita establecer una concordancia entre la presencia de anti-R7V y la no progresión de la enfermedad. En la medida que puedan testearse mayor número de pacientes se podrá establecer una conclusión más certera, como se ha comunicado en estudios multicéntricos realizados en otros países, donde se investiga el desarrollo de terapias de inmunización pasiva con anti-R7V en pacientes en fallo con tratamiento antirretroviral de gran actividad, a raíz de comprobar la correlación entre pacientes NP y presencia de anticuerpos anti-R7V. La detección de anticuerpos neutralizantes en pacientes VIH positivos constituye un desafío en el devenir de nuevos alcances terapéuticos.
CORRESPONDENCIA
HILDA EMILIA SCANDIZZO
Comité de Docencia e Investigación del Hospital Mi Pueblo
Progreso 240, 1888 FLORENCIO VARELA
Buenos Aires
Correo electrónico: emiliascandizzo@gmail.com
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Aceptado para su publicación el 16 de diciembre de 2008