BIOLOGÍA MOLECULAR
Estandarización de un método de detección molecular del virus influenza (H5N1) de alta patogenicidad
Standardization of a molecular detection method of highly pathogenic avian influenza virus (H5N1)
Maricela Montalvo-Corral1, Mónica Reséndiz2, Gerardo Santos-López3, Verónica Vallejo-Ruiz4, Julio Reyes-Leyva5, Jesús Hernández6
1. Maestra en Ciencias. Especialidad en Epidemiología
Molecular. Estudiante de Posgrado.
Laboratorio de Inmunología. Centro
de Investigación en Alimentación y Desarrollo,
A.C., Sonora, México
2. Químico Biólogo. Asistente de Investigación,
Laboratorio de Inmunología. Centro de
Investigación en Alimentación y Desarrollo,
A.C., Sonora, México
3. Doctor en Ciencias. Especialidad en Virología.
Investigador Asociado. Centro de Investigación
Biomédica de Oriente, IMSS
4. Doctora en Ciencias. Especialidad en Biología
Molecular. Investigador Asociado. Centro
de Investigación Biomédica de Oriente,
IMSS
5. Doctor en Ciencias. Jefe de Laboratorio Biología
Molecular y Virología. Centro de Investigación
Biomédica de Oriente, IMSS
6. Doctor en Ciencias. Investigador Titular. Laboratorio
de Inmunología, Centro de Investigación
en Alimentación y Desarrollo, A.C.,
Sonora, México
Resumen
El virus de la influenza aviar H5N1 de alta patogenicidad mantiene el alerta mundial debido a su potencial zoonótico y pandémico. Surge entonces la necesidad de contar con herramientas para la detección temprana y de esta forma reducir el impacto potencial a la salud humana y animal. En este estudio se estandarizó un método de detección molecular de los genes de la matriz (M), hemaglutinina (H5) y neuraminidasa (N1) del virus de la influenza aviar H5N1 de alta patogenicidad de linaje asiático, mediante transcripción-reversa y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RRT-PCR). A partir de un ARN viral de referencia cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) se construyeron controles positivos mediante clonación de productos de PCR. Los estándares de naturaleza plasmídica se emplearon en la obtención de curvas estándar para determinar los límites de detección de la técnica. La sensibilidad observada para todos los genes analizados fue de 102 copias de ADN/μL. Las curvas mostraron una eficiencia superior al 90%, y R2>0,99. Este método puede ser útil en las campañas de monitoreo del virus en aves migratorias, así como para el tamizaje de muestras clínicas de humanos, en una emergencia de salud.
Palabras clave: Influenza aviar; Detección; Transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
Summary
Highly pathogenic avian influenza virus (HPAI) H5N1 is a global threat due to its zoonotic and pandemic potential. Then, concern arises and the need to have early detection tools to minimize the impact on human and animal health. In this work, a molecular detection method was implemented to detect matrix (M), hemagglutinin (H5) and neuraminidase (N1) genes of HPAI avian influenza virus H5N1, based on real time RT-PCR (RRT-PCR). Positive controls were constructed from reference RNA viral A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), cloned into plasmidic vectors and sequenced. Assay detection sensitivity was assessed with standard curves for each gene. Assay sensitivity was 102 DNA copies/μl in all cases. Curves showed amplification efficiency higher than 90% and R2>0.99. This method could be useful for bird monitoring campaigns and as a screening procedure for clinical samples.
Key words: Avian influenza; Detection; Real time reverse transcription-polymerase chain reaction
Introducción
El virus de la influenza aviar H5N1 de alta patogenicidad
representa un riesgo serio para la salud mundial
debido a su potencial zoonótico y pandémico. La influenza
aviar ocasionada por este subtipo surgió como
una enfermedad en animales, sin embargo, cuando
aparecieron los primeros casos en humanos en el brote
ocurrido en Hong Kong en 1997 se convirtió en un problema
de salud pública (1-4). A la fecha se han confirmado
más de 380 casos, con una mortalidad superior al
60% (4). Adicionalmente, los brotes de influenza aviar
ocasionaron severas pérdidas económicas para la industria
avícola en diversos países de Asia, Europa y África.
Los virus influenza A están ampliamente distribuidos
en su reservorio natural que son las aves acuáticas migratorias
y pueden ser transmitidos a nuevos hospederos incluyendo
el humano (5). Las aves acuáticas, particularmente
de los órdenes Anseriformes y Charadriiformes,
tienen un papel fundamental en la biología y propagación
de estos virus en la naturaleza (6). Diversas cepas del
virus influenza aviar H5N1 de alta patogenicidad (IAAP)
circulan entre la población de aves domésticas y silvestres
en Asia. Estos virus han sufrido rápidos cambios genéticos
desde su aparición (7-10) lo cual ha incrementado su
adaptación al ser humano facilitando el proceso de transmisión
de persona a persona.
La diseminación rápida de estos virus ha hecho necesario
mejorar las medidas de bioseguridad en sitios
con brotes, y establecer sistemas de vigilancia en aves
potencialmente infectadas. También se ha buscado desarrollar
métodos de detección temprana que sean cada
vez más confiables. Los métodos tradicionales de detección,
como el aislamiento en embrión de pollo y
técnicas serológicas, son aún estándares de oro para la
detección del virus. Sin embargo, requieren de al menos
dos semanas para la obtención de resultados, por
lo que el uso de herramientas moleculares como la
transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real (RRT-PCR), son una alternativa
viable para agilizar este proceso, siendo técnicas muy
eficientes, sensibles y específicas (11-13). En este trabajo
se describe la estandarización de una técnica molecular
para detectar el virus de la influenza H5N1 de
linaje asiático, capaz de tamizar muestras clínicas de
aves y humanos.
Materiales y Métodos
VIRUS
Se utilizó ARN viral de la cepa de referencia A/Vietnam/1204/2003 (H5N1) y A/Turkey/Italy/228-1279/1999 (H7N1) donado por la M. en C. Irma López (Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica, InDRE, Ciudad de México). Como control positivo para evaluar especificidad de linaje se empleó un ARN de un virus influenza subtipo H5NA de baja patogenicidad de un aislado mexicano de aves de corral.
EXTRACCIÓN DE ARN
El ARN total se extrajo manualmente usando el sistema RNeasy mini kit (Qiagen, Inc, Valencia, CA, EEUU), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN fue eluido en 50 μL de agua libre de nucleasas.
TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT-PCR)
El ADN complementario (ADNc) se sintetizó con el
paquete SuperscriptTM First Strand Synthesis kit (Invitrogen,
Inc, Carlsbad, CA, EEUU). Brevemente, se usó 1 μL de dNTPs 10mM y 1 μL de hexámeros (50 ng/ μL)
incubados a 65 °C por 5 min. Posteriormente se agregaron,
2 μL de solución amortiguadora para RT 10X,
4 μL de MgCl2 25 mM, 2 μL de DTT 0,1 mM y 1 μL de
ARNasa Out (40 U/μL) seguido de una incubación a
42 °C por 2 min. Se añadió 1 μL de transcriptasa reversa
Superscript II (50 U/μL) y la mezcla se incubó a
42 °C por 50 min y 70 °C por 15 min. Finalmente se
agregó 1 μL of ARNasa H a 37 °C por 20 min. La reacción
en cadena de la polimerasa se llevó a cabo empleando
el sistema Brilliant QPCR Core Reagent kit
(Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Se emplearon 2 μL
de ADNc para la amplificación en un termociclador
Smart Cycler (Cepheid Inc, Sunnyvale, CA, EEUU). El
volumen de reacción fue de 25 μL que contenían:
1 μL de mezcla de dNTP 10 mM, 2,5 μL de MgCl2 25 mM, 2.5 μL de solución amortiguadora para PCR
10X, 0,25μL de la enzima Sure start Taq polimerasa
(5U/μL). Los iniciadores y las sondas de hidrólisis Taq-
Man para la detección de los genes M, H5 y N1 fueron
seleccionados de publicaciones previas (11)(14) y se realizó una modificación a la secuencia de sonda para H5
utilizando un software de acceso libre (www.idtdna.com)
(5´-FAM-AAG AAA TGG AAC GTA TGA CTA CCC
GCA-TAMRA-3´).
Las condiciones de corrida fueron las siguientes:
50 °C por 2 min, 95 °C 10 min, 40 ciclos de 95 °C 15 s
y 60 °C 1 min para el alineamiento y extensión, etapa
en la que se colectaron los datos de fluorescencia emitidos
por la hidrólisis de la sonda. Este protocolo se realizó alternativamente en un termociclador ABI 7500 (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EEUU), empleando
ROX como colorante de referencia. Los controles positivos
(ARN viral y plásmidos con la secuencia de interés)
y negativos (NTC, sin la secuencia de interés presente)
fueron incluidos en todos los ensayos.
SECUENCIACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR
Los productos de PCR fueron purificados en columnas GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, LD, Reino Unido) y secuenciados en el Genomic Analysis and Technology Core, GATC (University of Arizona, Tucson, AZ, EEUU). Los análisis de secuencias fueron realizados con el software Chromas LITE version 2.01 (Technelysium Pty Ltd, EEUU), y los alineamientos de nucleótidos se hicieron con el algoritmo BLAST comparando con la base de datos del GenBank.
CONSTRUCCIÓN DE CURVAS ESTÁNDAR
Los productos de PCR purificados fueron clonados
en el sistema pCR2.1-TOPO TA Cloning kit, (Invitrogen,
Inc., Carlsbad, CA, EEUU). Los plásmidos con el
fragmento de interés fueron propagados en bacterias E.
coli competentes químicamente. Posteriormente fueron
extraídos, cuantificados y empleados en la construcción
de curvas estándar para determinar la sensibilidad de la
técnica, con diluciones por duplicado en el intervalo de
101-108 copias de ADN/μL (15).
El método de cálculo de copias de ADN/μL fue el
siguiente:
Peso en Daltons (g/mol) = (tamaño en pares de bases del plásmido + tamaño en pares de bases del inserto) (330 Da X 2 nucleótidos/pb), posteriormente
(g/mol) / (Número de Avogadro) = (g/molécula) =
Número de copias
Concentración del plásmido = (g/μL) /
(g/moléculas) = moléculas /μL
Resultados
Los resultados de las curvas estándar confirmaron la sensibilidad y especificidad del sistema de detección. Los límites de detección observados para los ensayos con los diferentes genes mostraron una alta sensibilidad dentro de un amplio intervalo de 102-108 copias de ADN/μL Los resultados individuales fueron los siguientes: para el gen H5, se obtuvo un límite de detección de 102 copias de ADN/μL, pendiente (m) de -3,42 y coeficiente de determinación (R2) de 0,997 (Fig. 1-A). En el ensayo de la cinética de amplificación de N1, el límite fue de 102 copias de ADN/μL, m = -3,49 y R2= 0,998 (Fig. 1-B). Para el gen M la sensibilidad de la técnica fue de 102 copias de ADN/μL con una m = -3,16 y una R2 de 0,999 (Fig 1-C). En la figura 1D se observa una curva de amplificación típica. La eficiencia de la reacción de amplificación fue calculada con la ecuación E = 10(-1/m)-1 y ésta fue de 96, 93 y 107% para H5, N1 y M, respectivamente. Además de la sensibilidad, otro parámetro importante que debe evaluarse es la especificidad, por ello se empleó ARN viral de la cepa de referencia H7N1 (A/Turkey/Italy/228-1279/1999) y otro aislamiento mexicano de virus influenza aviar H5NA de baja patogenicidad. En todos ellos se observó la detección del gen de la matriz, pero ninguno fue positivo a H5 o N1 de linaje asiático.
Figura 1. Regresión lineal de los puntos
obtenidos en las curvas estándar empleando
las diluciones décuples por duplicado
del vector plasmídico con los insertos
de los genes de interés. Cada
punto en el eje de las x representa el número
de copias de ADN/μl y en el eje de
las y, el ciclo umbral de detección. A)
curva estándar gen H5; B) gen N1; C) gen
M; D) cinética de amplificación típica.
Discusión y Conclusiones
Los resultados de estos ensayos indican que la reacción
de PCR en tiempo real se efectuó dentro de los
parámetros aceptables para este tipo de metodologías
y que es una técnica robusta en términos de los resultados
de los coeficientes de determinación obtenidos.
Se observaron valores muy cercanos a los informados
anteriormente por Spackman y col. (11) y Payungporn
y col. (14), 102 copias de ARN/μL, 103 y 102, para M,
H5 y N1, respectivamente. Sin embargo, en este estudio
se realizó la evaluación de los límites de detección
con el vector plasmídico. Esta estrategia puede ser empleada
como una alternativa para la elaboración de
curvas estándar, debido a que el uso y construcción de
ARN transcritos in vitro es un proceso que aumenta el
costo, tiempo y laboriosidad de la estandarización,
considerando no obstante sus limitantes ya que se obvia
la posible influencia de la eficiencia del proceso de
transcripción reversa en la detección.
La aparición de enfermedades infecciosas emergentes
entre la población humana, como el caso de la
influenza aviar, representa un riesgo serio para la salud
pública y animal. El diagnóstico temprano es una
herramienta invaluable para la prevención y control
de brotes. La PCR en tiempo real representa una alternativa
a los métodos de diagnóstico tradicionales que
puede ser aplicado a muestras clínicas y especímenes
de campo. La técnica aquí descrita puede ser empleada
para el monitoreo de virus influenza en aves migratorias,
así como en el tamizaje de muestras clínicas
presuntamente positivas al virus influenza aviar H5N1
de alta patogenicidad, en una emergencia de salud.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el financiamiento otorgado a este estudio a través del proyecto No. 66021 de los FONDOS MIXTOS SONORA-CONACyT y FONSEC-Salud (2003-C01-085).
CORRESPONDENCIA
DR. JESÚS HERNÁNDEZ
Laboratorio de Inmunología
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo
A. C. Hermosillo 83000, SONORA, México
Tel./Fax: +52 662 289 2400
E-mail: jhdez@ciad.mx
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Aceptado para su publicación el 3 de febrero de 2009