FEDERACIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA CLÍNICA Y CIENCIA DE LABORATORIO CLÍNICO
Hacia una estandarización de las
mediciones de transferrina deficiente
en hidratos de carbono (TDH).
I. Definición del analito y propuesta de un
método de referencia
Federación Internacional de Química Clínica y Laboratorio Clínico (IFCC)
Grupo de Trabajo sobre Estandarización de la Transferrina Deficiente en Hidratos
de Carbono (IFCC-WG-CDT)
Jan-Olof Jeppsson1, Torsten Arndt2, François Schellenberg3, Jos P.M. Wielders4, Raymond F. Anton5, John B. Whitfield6 y Anders Helander7 *
1. Malmö University Hospital, Malmö, Sweden
2. Bioscientia Institut für Medizinische Diagnostik
GmbH, Ingelheim, Germany
3. Hôpital Trousseau, CHRU, Tours, France
4. Meander Medisch Centrum, Amersfoort,
The Netherlands
5. Alcohol Research Center, Medical University
of South Carolina, Charleston, SC, USA
6. Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Australia
7. Karolinska Institutet and Karolinska University
Hospital, Stockholm, Sweden
Esta traducción fue autorizada por la IFCC. Sin embargo, la IFCC no acepta ninguna responsabilidad por la exactitud de la misma. El documento definitivo continúa siendo el original en inglés.
Resumen
Un cambio, asociado con el alcohol, en el patrón sérico de la glicoforma de transferrina, la transferrina deficiente en hidratos de carbono (TDH), se utiliza como biomarcador del consumo crónico de alcohol de moderado a excesivo. Una de las limitaciones actuales del análisis de TDH es la falta de estandarización, lo cual dificulta la comparación clínica y analítica entre los estudios. Esta situación impulsó la creación de un Grupo de Trabajo (WG) sobre la Estandarización de TDH con el auspicio de la Federación Internacional de Química Clínica y Laboratorio Clínico (IFCC). El trabajo de estandarización tiene como objetivo definir y validar el analito, seleccionar un método de referencia, elaborar procedimientos para la producción de materiales de referencia y realizar sugerencias para el uso clínico de TDH. La primera recomendación del WG es que la disialotransferrina debería ser la molécula blanco primaria para la medición de TDH y el analito simple en el que se base la estandarización de TDH. Además, se recomienda que la HPLC sea el principio analítico considerado como base de un método de referencia provisorio hasta que se establezca un método de referencia de espectrometría de masas apropiado. En el uso clínico, la TDH debería expresarse en una cantidad relativa (% TDH) para compensar por las variaciones en la concentración de transferrina total.
Palabras clave: Biomarcador de alcohol; Transferrina deficiente en hidratos de carbono; Disialotransferrina; Cromatografía líquida de alta definición; Estandarización
Antecedentes históricos: transferrina deficiente en hidratos de carbono (TDH) y métodos analíticos
La transferrina, principal glicoproteína para el
transporte de hierro en humanos, muestra una microheterogeneidad
distintiva debida a variaciones en la
secuencia de los aminoácidos, a la estructura oligosacárida
(N-glicano) y a la carga de hierro (1) (2). En la
década del setenta, Stibler y sus colaboradores compararon
los patrones de transferrina en suero y en líquido
cefalorraquídeo utilizando la técnica del enfoque
isoeléctrico (IEF) recientemente desarrollada, e identificaron
un patrón con una isoforma de transferrina
anormal (glicoforma) que estaba relacionado con el
abuso de alcohol (3). Las glicoformas asociadas con el
alcohol mostraban puntos isoeléctricos en un pH de
5,7 o mayor en el estado saturado con hierro y se demostró que poseían un menor contenido de ácido siálico
si se las comparaba con la glicoforma más importante,
la tetrasialotransferrina; por ende se la llamó transferrina "deficiente en carbohidrato" o TDH en su
forma abreviada (4). A la TDH originariamente se la
definió como la suma de las glicoformas asialo-, monosialo-
y disialotransferrina. Estudios posteriores revelaron
que la disialo- y la asialotransferrina no solamente
no poseen los residuos terminales ácidos siálicos sino
que tampoco tienen un N-glican completo en el caso
de la disialo-transferrina o ambos N-glicanos en el caso
de la asialo-transferrina (5) (6).
Se han publicado desde entonces cientos de estudios
sobre distintas aplicaciones clínicas de la TDH como
biomarcador para la detección y el seguimiento
del consumo excesivo, crónico, de alcohol, aunque se
ha hecho menos hincapié en los temas analíticos (2) (4) (7-9). La determinación de la TDH tradicionalmente
se ha basado en las diferencias en la carga (es
decir, punto isoeléctrico) entre las glicoformas de la
transferrina saturada con hierro, mediante la IEF de
proteínas en suero seguida por inmunofijación utilizando
anticuerpos anti-transferrina, que durante mucho
tiempo fue considerado el método estándar. Recién
en 1992 se lanzó un equipo comercial de pruebas
para TDH (CDTectTM; Pharmacia Diagnostics, Uppsala,
Suecia) (10). En el método CDTect, que ya no se
utiliza más, la TDH se separaba de las glicoformas no-
TDH por medio de pequeñas columnas de intercambio
aniónico, seguidas de la medición de cantidades
absolutas de TDH (en mg/L o U/L) utilizando un inmunoensayo
de transferrina. Los equipos de prueba de
TDH posteriores (por ejemplo, %TDH TIA, %TDH)
mantuvieron el principio original de la separación en
columnas seguido por un inmunoensayo de transferrina,
pero implicaban modificaciones en el procedimiento
de separación, lo cual dio lugar a la inclusión
de proporciones variables de trisialotransferrina en la
fracción TDH, o en la parte inmunoquímica, cuantitativa
de la prueba (11-13). Se demostró posteriormente
que la inclusión de la trisialotransferrina resultaba ser
desfavorable para las pruebas de TDH, ya que las
muestras de suero que contenían un alto nivel de esta
glicoforma, que no está relacionada con el abuso de alcohol,
pueden producir resultados falsamente elevados
en los inmunoensayos de TDH (14-17).
Otro cambio importante respecto del método original
CDTect consistió en expresar la TDH como concentración
relativa (% TDH) en vez de concentración
absoluta. La normalización de los valores de TDH a la
concentración total de transferrina contribuyó a una
mejora significativa del análisis de TDH (18-21) al compensar
por los valores falsamente altos y falsamente bajos
en casos de aumento (por anemia, embarazo, anticonceptivos
orales) o disminución (por enfermedad
crónica, carcinoma) de las concentraciones de transferrina.
Una desventaja existente en las combinaciones
de inmunoensayo de transferrina/separación en columna
es que separan las glicoformas TDH de las glicoformas
no-TDH basadas en diferencias en punto isoeléctrico
y carga, sin ningún control de las subfracciones
individuales diluidas. De ese modo, estos métodos pueden
proporcionar resultados imprecisos para cualquier
cambio en el punto isoeléctrico, tales como el que sucede
en los polimorfismos genéticos de transferrina y
en los desórdenes raros congénitos de la glicosilación
(CDG) (2) (4) (15) (22). En un número de casos limitado
pero significativo, esto podría dar lugar a resultados
de TDH falsamente altos o bajos que podrían originar
identificaciones de consumo abusivo de alcohol
falso-positivas o falso-negativas con consecuencias indeseadas
desde el punto de vista clínico y forense.
También se han introducido otras técnicas analíticas
para la determinación de rutina de TDH, incluyendo
HPLC comercial y no comercial (23-26) y métodos
de electroforesis capilar (EC) (27-29). A pesar de que
son generalmente más trabajosos y que consumen más
tiempo que los inmunoensayos, las ventajas específicas
de los métodos de HPLC y EC consisten en que se pueden
documentar de manera visible los patrones de glicoformas
de transferrina y, por lo tanto, la posibilidad
de detectar potenciales interferencias analíticas como
las variantes genéticas de transferrina, CDG, y cantidades
relativas elevadas de mono- y trisialotransferrina
(15)(17)(22)(30). Al diferenciar entre consumo de alcohol
moderado y excesivo, el análisis de la curva de
características receptor-operador (ROC) también demostró que el área bajo la curva para HPLC era significativamente
mayor que para el método de la minicolumna
(CDTect) (24).
Además de estos métodos, el primer inmunoensayo
directo de TDH (N Latex CDT) para ser usado en los
sistemas Dade Behring BNTM (Dade Behring, Marburg, Alemania) se lanzó recientemente (31) (32). El N Latex
CDT es un ensayo inmunonefelométrico directo
basado en un anticuerpo monoclonal que reconoce
específicamente la estructura de las glicoformas de
transferrina que carecen de uno o ambos N-glicanos
completos, que se corresponden con la disialo-, monosialo-
y asialotransferrina (es decir, las glicoformas
TDH), y en un inmunoensayo simultáneo de transferrina
total. Los valores relativos (% TDH) se calculan
automáticamente.
Necesidad de una estandarización de las mediciones de TDH
Durante los últimos 15 años aproximadamente, la
introducción de un amplio rango de técnicas y métodos
analíticos para la cuantificación de TDH en distintas
cantidades absolutas (mg/L o U/L) o relativas
(por ejemplo, % TDH respecto de transferrina total o
tetrasialotransferrina), cada una con sensibilidad y especificidad
analíticas diferentes (2) (4) (9), además de
la inclusión de distintas glicoformas de transferrina en "TDH", ha complicado la comparabilidad de los resultados
analíticos y clínicos entre los estudios (2) (15) (33). La amplia gama de valores de corte asociados para
TDH (que varían de 0,8% a 6,0% para los valores relativos)
utilizada para detectar ingestas de alcohol perjudiciales
también ha ocasionado mucha confusión
entre el personal médico cuando se utiliza esta prueba
de manera clínica para el screening y seguimiento del
consumo excesivo de alcohol. Además, la complejidad
estructural de las glicoformas de la TDH ha impedido
el desarrollo de materiales de referencia sobre los cuales
se pueda basar la estandarización inter-ensayo necesaria
para una supervisión regulatoria de la calidad
del laboratorio clínico y la validez de los resultados.
Estos problemas promovieron el inicio de un Grupo
de Trabajo sobre Estandarización de la TDH (WGTDH)
auspiciado por la Federación Internacional de
Química Clínica y Laboratorio Clínico (IFCC). Las
metas iniciales de este trabajo consisten en definir el
analito más apropiado para TDH, seleccionar un método
de referencia para la medición de TDH, y diseñar
procedimientos para la producción y distribución de
materiales de referencia para el analito seleccionado.
Las metas futuras son validar el analito, el método de
referencia y los materiales de referencia en estudios
multicéntricos. Además, el WG va a realizar recomendaciones
sobre las aplicaciones clínicas para la TDH.
El WG se reunió por primera vez en 2005 en el Congreso
conjunto de la IFCC/AACC en Orlando, Florida,
y hubo una reunión analítica del subgrupo que se
realizó en marzo de 2006 en Ingelheim, Alemania. El
trabajo inicial hacia la estandarización de las mediciones
de TDH ha centrado su atención en la definición
del analito y en la propuesta de un método de referencia.
El trabajo a futuro se dedicará a la preparación de
los materiales de referencia basados en la disialotransferrina
en suero humano purificada, y al uso de tales
materiales para evaluar y comparar diferentes métodos
de TDH.
DEFINICIÓN DEL ANALITO
En gran medida debido a razones analíticas relacionadas
con la separación de las glicoformas de transferrina
utilizando los métodos iniciales, a la TDH originariamente
se la definía como la suma de asialo-,
monosialo- y disialotransferrina (4). Entre ellas, la monosialotransferrina
no es considerada conveniente como
analito blanco para la medición de TDH, debido a
que la cantidad de esta glicoforma en suero está principalmente
asociada con un alto nivel de trisialotransferrina
en la muestra y no con la ingesta de alcohol (15).
Por otro lado, la asialo- y la disialotransferrina están
claramente relacionadas con un excesivo consumo
crónico de alcohol, a pesar de que muestran diferente
sensibilidad y especificidad (25) (28) (34) (35). La disialotransferrina
aumenta con la ingesta de alcohol y
se observan concentraciones elevadas luego de un
consumo sostenido de alcohol, de moderado a excesivo
(36). Con los métodos analíticos actuales para
TDH, la asialotransferrina no se puede medir en sujetos
abstinentes y que beben alcohol socialmente, pero
se transforma en elevada con el alto consumo de alcohol
(37) y luego acompaña un ya elevado nivel de disialotransferrina
(25) (26). Por consiguiente, la sensibilidad
diagnóstica de la asialotransferrina es más baja
en comparación con la disialotransferrina, y demasiado
baja para la detección del consumo crónico pero
moderado de alcohol. Debido a que cualquier mejora
en la especificidad diagnóstica obtenida al medir la
asialotransferrina sola no justifica la significativa reducción
en la sensibilidad diagnóstica si se la compara
con la disialotransferrina (25)(26), y debido a que el
trabajo de estandarización debería enfocarse en una
sola sustancia, se acordó que la disialotrasnferrina debería
ser el analito elegido en primer lugar para la estandarización
de TDH.
El nivel de saturación con hierro de la transferrina
también necesita ser considerado en la definición del
analito debido a que esto influye en el punto isoeléctrico
y en la estructura, y, por lo tanto, en las propiedades
químicas y analíticas (y probablemente también en
las antigénicas). Por consiguiente, para los métodos
analíticos de TDH que dependen de diferencias en la
carga (punto isoeléctrico) entre la disialotransferrina
de la molécula elegida y las otras glicoformas, la medición
debería realizarse luego de una saturación completa
con hierro de la transferrina en la muestra. Además,
debido a que la disialotransferrina teóricamente puede ser glicosilada en dos posiciones diferentes (en
Asn-413 o Asn-611) se considera que es de importancia
también elucidar la estructura del analito.
PROPUESTA DE UN MÉTODO DE REFERENCIA PARA TDH
Se recomienda que cualquier método de referencia para TDH sea "público" o independiente de cualquier tecnología patentada. También debería ser aplicable a muestras de pacientes con variantes genéticas de transferrina y otras glicoformas de transferrina, o al menos poder identificar esas muestras. La espectrometría de masas probablemente sea la mejor técnica para un método de referencia, pero en la actualidad la HPLC es considerada el mejor candidato como método de referencia provisorio para TDH, por las siguientes razones:
a) La medición de la absorbancia transferrinahierro a 460-470 nm hace que esta técnica sea específica y sensible y que tenga un bajo riesgo de interferencia analítica (38);
b) Permite que se realice una separación adecuada de las glicoformas de transferrina;
c) La cuantificación de cualquiera de las concentraciones de disialotransferrina, la absoluta o la relativa, puede obtenerse midiendo el área del pico o su altura; y
d) El trazado de HPLC proporciona un registro fácil de comprender para la identificación del pico.
Se ha publicado un método de HPLC bien definido
para la cuantificación de las glicoformas de transferrina
utilizando materiales disponibles comercialmente
(25) y podría establecerse una red internacional de laboratorios
de referencia.
La EC fue considerada menos conveniente como
método de referencia debido a que se basa en la medición
un tanto no específica de la absorbancia de la
unión péptido en ~200 nm, en el que muchas otras biomoléculas
con puntos isoeléctricos similares (por ejemplo,
proteína C-reactiva, cadenas livianas, y factores del
complemento) podrían interferir al estar presentes en
concentraciones mayores (28) (39) (40). Se ha informado
que la sensibilidad analítica de la EC también ha
sido menor que para HPLC (29), a pesar de que se están
desarrollando métodos de EC mejorados.
Conclusiones
La definición de la disialotransferrina como objetivo primario para la medición de TDH y de analito para la estandarización de TDH, y la recomendación de la HPLC como el principio analítico para un método de referencia provisorio hasta que se pueda acceder a un método de espectrometría de masas, representan los primeros pasos hacia una estandarización de las mediciones de TDH. En el uso clínico, los valores de TDH deberían expresarse como una cantidad relativa (% TDH) para compensar por los valores falsamente altos y bajos en caso de disminución o aumento de la concentración total de transferrina. El WG-TDH espera que las recomendaciones que aquí se presentan puedan mejorar el rendimiento diagnóstico de la medición de TDH como biomarcador de consumo de alcohol crónico de moderado a alto y avanzar en la comparabilidad de las pruebas clínicas y analíticas de TDH. Como resultado de esto se logrará una mayor capacidad del laboratorio de ayudar en el trabajo forense, una asistencia más valiosa al personal médico en el diagnóstico y, finalmente, se logrará, nada más y nada menos, mejorar la atención al paciente.
1. de Jong G, van Dijk JP, van Eijk HG. The biology of transferrin. Clin Chim Acta 1990; 190: 1-46.
2. Arndt T. Carbohydrate-deficient transferrin as a marker of chronic alcohol abuse: a critical review of preanalysis, analysis, and interpretation. Clin Chem 2001; 47: 13-27.
3. Stibler H, Allgulander C, Borg S, Kjellin KG. Abnormal microheterogeneity of transferrin in serum and cerebrospinal fluid in alcoholism. Acta Med Scand 1978; 204: 49-56.
4. Stibler H. Carbohydrate-deficient transferrin in serum: a new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed. Clin Chem 1991; 37: 2029-37.
5. Landberg E, Påhlsson P, Lundblad A, Arnetorp A, Jeppsson J-O. Carbohydrate composition of serum transferrin isoforms from patients with high alcohol consumption. Biochem Biophys Res Commun 1995; 210:267-74.
6. Flahaut C, Michalski JC, Danel T, Humbert MH, Klein A. The effects of ethanol on the glycosylation of human transferrin. Glycobiology 2003; 13:191-8.
7. Allen JP, Litten RZ, Anton RF, Cross GM. Carbohydrate-deficient transferrin as a measure of immoderate drinking: remaining issues. Alcohol Clin Exp Res 1994; 18: 799-812.
8. Fleming MF, Anton RF, Spies CD. A review of genetic, biological, pharmacological, and clinical factors that affect carbohydrate-deficient transferrin levels. Alcohol Clin Exp Res 2004; 28: 1347-55.
9. Bortolotti F, De Paoli G, Tagliaro F. Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) as a marker of alcohol abuse: a critical review of the literature 2001-2005. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2006; 841:96-109.
10. Stibler H, Borg S, Joustra M. A modified method for the assay of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) in serum. Alcohol Alcohol Suppl 1991; 1: 451-4.
11. Helander A, Fors M, Zakrisson B. Study of Axis-Shield new %CDT immunoassay for quantification of carbohydrate- deficient transferrin (CDT) in serum. Alcohol Alcohol 2001; 36: 406-12.
12. Schwarz MJ, Domke I, Helander A, Janssens PM, Van- Pelt J, Springer B, et al. Multicentre evaluation of a new assay for determination of carbohydrate-deficient transferrin. Alcohol Alcohol 2003; 38 :270-5.
13. Alden A, Ohlson S, Påhlsson P, Ryden I. HPLC analysis of carbohydrate deficient transferrin isoforms isolated by the Axis-Shield %CDT method. Clin Chim Acta 2005; 356:143-6.
14. Dibbelt L. Does trisialo-transferrin provide valuable information for the laboratory diagnosis of chronically increased alcohol consumption by determination of carbohydrate- deficient transferrin? Clin Chem 2000; 46: 1203-5.
15. Helander A, Eriksson G, Stibler H, Jeppsson J-O. Interference of transferrin isoform types with carbohydrate deficient transferrin quantification in the identification of alcohol abuse. Clin Chem 2001; 47: 1225-33.
16. Arndt T, Korzec A, Bär M, Kropf J. Further arguments against including trisialo-Fe2-transferrin in carbohydrate- deficient transferrin (CDT): a study on male alcoholics and hazardous drinkers. Med Sci Monit 2002; 8:CR411-8.
17. Arndt T, Gressner A, Herwig J, Meier U, Sewell AC. Argininosuccinatelyase deficiency (ASL) and carbohydrate deficient transferrin (CDT): experience with four independent CDT analysis methods - misleading results given by the %CDT TIA assay. Clin Chim Acta 2006; 373: 117-20.
18. Schellenberg F, Benard JY, Le Goff AM, Bourdin C, Weill J. Evaluation of carbohydrate-deficient transferrin compared with Tf index and other markers of alcohol abuse. Alcohol Clin Exp Res 1989; 13: 605-10.
19. Sorvajärvi K, Blake JE, Israel Y, Niemelä O. Sensitivity and specificity of carbohydrate-deficient transferrin as a marker of alcohol abuse are significantly influenced by alterations in serum transferrin: comparison of two methods. Alcohol Clin Exp Res 1996; 20:449-54.
20. Keating J, Cheung C, Peters TJ, Sherwood RA. Carbohydrate deficient transferrin in the assessment of alcohol misuse: absolute or relative measurements? A comparison of two methods with regard to total transferrin concentration.Clin Chim Acta 1998; 272: 159-69.
21. Helander A. Absolute or relative measurement of carbohydrate- deficient transferrin in serum? Experiences with three immunological assays. Clin Chem 1999; 45:131-5.
22. Helander A, Bergström J, Freeze HH. Testing for congenital disorders of glycosylation by HPLC measurement of serum transferrin glycoforms. Clin Chem 2004; 50: 954-8.
23. Jeppsson J-O, Kristensson H, Fimiani C. Carbohydrate deficient transferrin quantified by HPLC to determine heavy consumption of alcohol. Clin Chem 1993; 39: 2115-20.
24. Turpeinen U, Methuen T, Alfthan H, Laitinen K, Salaspuro M, Stenman UH. Comparison of HPLC and small column (CDTect) methods for disialotransferrin. Clin Chem 2001; 47: 1782-7.
25. Helander A, Husa A, Jeppsson J-O. Improved HPLC method for carbohydrate-deficient transferrin in serum. Clin Chem 2003; 49: 1881-90.
26. Helander A, Bergstro¨m JP. Determination of carbohydrate- deficient transferrin in human serum using the Bio-Rad %CDT by HPLC test. Clin Chim Acta 2006; 371: 187-90.
27. Wuyts B, Delanghe JR, Kasvosve I, Gordeuk VR, Gangaidzo IT, Gomo ZA. Carbohydrate-deficient transferrin and chronic alcohol ingestion in subjects with transferring CD-variants. Clin Chem Lab Med 2001; 39: 937-43.
28. Legros FJ, Nuyens V, Minet E, Emonts P, Boudjeltia KZ, Courbe A, et al. Carbohydrate-deficient transferrin isoforms measured by capillary zone electrophoresis for detection of alcohol abuse. Clin Chem 2002; 48: 2177-86.
29. Helander A, Wielders JP, Te Stroet R, Bergstro¨m JP. Comparison of HPLC and capillary electrophoresis for confirmatory testing of the alcohol misuse marker carbohydrate- deficient transferrin. Clin Chem 2005; 51: 1528-31.
30. Carchon HA, Chevigne R, Falmagne JB, Jaeken J. Diagnosis of congenital disorders of glycosylation by capillary zone electrophoresis of serum transferrin. Clin Chem 2004; 50: 101-11.
31. Helander A, Dahl H, Swanson I, Bergström J. Evaluation of Dade Behring N Latex CDT: a novel homogenous immunoassay for carbohydrate-deficient transferrin (abstract). Alcohol Clin Exp Res 2004; 28(Suppl):33A.
32. Kraul D, Hackler R, Althaus H. A novel particle-enhanced assay for the immunonephelometric determination of carbohydrate-deficient transferrin (abstract). Alcohol Clin Exp Res 2004; 28(Suppl):34A.
33. Arndt T, Keller T. Forensic analysis of carbohydrate-deficient transferrin (CDT): implementation of a screening and confirmatory analysis concept is hampered by the lack of CDT isoform standards. Forensic Sci Int 2004; 146: 9-16.
34. Mårtensson O, Härlin A, Brandt R, Seppä K, Sillanaukee P. Transferrin isoform distribution: gender and alcohol consumption. Alcohol Clin Exp Res 1997; 21: 1710-5.
35. Arndt T. Asialotransferrin - an alternative to carbohydrate- deficient transferrin? Clin Chem 2003; 49: 1022-3.
36. Schellenberg F, Schwan R, Mennetrey L, Loiseaux MN, Pages JC, Reynaud M. Dose-effect relation between daily ethanol intake in the range 0-70 grams and %CDT value: validation of a cut-off value. Alcohol Alcohol 2005; 40: 531-4.
37. Schwan R, Loiseaux MN, Albuisson E, Legros FJ, Nuyens V, Malet L, et al. Performance of asialotransferrin in detecting alcohol abuse. Alcohol Clin Exp Res 2005; 29: 81-3.
38. Jeppsson J-O. Isolation and partial characterization of three human transferrin variants. Biochim Biophys Acta 1967; 140: 468-76.
39. Lanz C, Thormann W. Capillary zone electrophoresis with a dynamic double coating for analysis of carbohydrate- deficient transferrin in human serum: impact of resolution between disialo- and trisialotransferrin on reference limits. Electrophoresis 2003; 24: 4272-81.
40. Ramdani B, Nuyens V, Codden T, Perpete G, Colicis J, Lenaerts A, et al. Analyte comigrating with trisialotransferrin during capillary zone electrophoresis of sera from patients with cancer. Clin Chem 2003; 49: 1854-64.