ARTÍCULOS ORIGINALES
Toxicidad en peces de herbicidas formulados con glifosato
Toxicity in fishes of herbicides formulated with glyphosate
Alvarez, Maria1; Gimenez, Isabel T.2; Saitua, Hugo1; Enriz Ricardo D.1; Giannini Fernando A.1*
1Cátedra de Química General. Universidad Nacional de San Luis. Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Chacabuco y
Pedernera (5700) San Luis, Argentina. Tel.: 00-54-02664/4424689 int. 157.
2Cátedra de Bioestadística Aplicada, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis.
*fagian3@gmail.com
Recibido: 19 de octubre de 2011
Aceptado: 5 de marzo de 2012
Resumen.
En nuestro país existe una gran extensión de hectáreas cultivadas con soja transgénica, la misma ha sido modificada
genéticamente para soportar la acción de un herbicida denominado glifosato. Debido a la gran cantidad de formulaciones comerciales
que incluyen glifosato es de importancia analizar el impacto ambiental producido por éstas.
La evaluacion de la toxicidad aguda de dos herbicidas comerciales formulados con glifosato y de una solución del mismo; frente
a peces de la especie Poecilia reticulata "lebistes" acusa que una de las soluciones produce mortalidad del 100 % de los especimenes
a 100 μl/l (equivalente a 48 mg/l de principio activo); la otra a 50 μl/l (equivalente a 24 mg/l de principio activo) y la solución
formulada con glifosato puro no produce mortalidad aún a concentraciones de 400 mg/l.
Utilizando dosis sub letales en función de los datos obtenidos en el ensayo de toxicidad aguda se determinó que a largo plazo
especimenes de Cyprinus carpio haematopterus "carpa koi", manifestaron severas alteraciones hematológicas principalmente
frente a una de las formulaciones evaluadas.
Palabras clave: Glifosato; Coadyuvantes; Peces; Toxicidad
Sumary.
Nowadays, transgenic soya, modified in order to withstand the impact of the herbicide glyphosate, in one of the main crops grown in Argentina. Due to the large number of commercial formulations that include this drug, is important to analyze both, the acute and chronic environmental impact that they cause. Here the acute toxicity of two commercial herbicides glyphosatebased toward the fish Poecilia reticulate "guppy" was evaluated and compared with pure glyphosate solutions. Interestingly, while commercial herbicides formulations induce a 100% of mortality at concentration ranged between 50 and 100 μl/l, the pure glyphosathe does not present mortality even at doses higher than 400 mg/l. When some long term effects toward Cyprinus carpio haematopterus "koi" were determined by using the sub-lethal doses already calculated it was demonstrated that one of the commercial herbicides induces severe haematological alterations.
Keywords: Glyphosate; Excipients; Fish; Toxicity
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial y desde el año 1984 se utiliza el
concepto de "desarrollo sustentable", entendiendo
por esto a la vinculación del desarrollo
con factores como los recursos humanos, la
alimentación, las especies, los ecosistemas, la
energía y la industria. En nuestro país desde
hace ya bastante tiempo, investigadores del
INTA y del CONICET han aconsejado plantear
la producción agropecuaria en términos de
agro ecosistemas mencionando la necesidad
de no tratar el sistema agropecuario como
algo separado del sistema ecológico.
La Argentina es un país productor y exportador
de materias primas e insumos agrícolas
siendo la soja uno de los más importantes.
Esta oleaginosa presenta en la actualidad un
gran interés por ser un producto de gran valor
económico. Gran parte de esta producción
es exportada como grano, siendo los países
asiáticos los principales compradores.
Para aumentar el rendimiento se emplean variedades
transgénicas que son resistentes a un
herbicida denominado glifosato, esto ha colaborado
para que en ciertas regiones, el glifosato
se transforme en un compuesto utilizado
en forma extensiva con la finalidad de controlar
las malezas durante el ciclo del cultivo de
soja. Este empleo masivo y descontrolado ha
ocasionado preocupación en las poblaciones
urbanas respecto de los riesgos toxicológicos de este plaguicida, especialmente en las áreas
limítrofes con la zona rural.
El glifosato o N-(fosfonometil) glicina es una
sustancia altamente soluble en agua (10.500
mg/l) con un tiempo de vida media en agua
de entre 3,5 y 70 días. Su acción herbicida
se debe a su capacidad para inhibir la 5-enolpiruvilshikimatofosfatosintasa
(Mallory-Smith
y Ratzinger 2003), enzima que interviene en
la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en
vegetales.
Además de este principio activo, las formulaciones
contienen otras sustancias para aumentar
su eficacia como el surfactante polioxietileno-
amina (POEA); existiendo evidencias
de que estos coadyuvantes son los principales
responsables de las características tóxicas
de los productos comerciales (Folmar y col.
1979; Domínguez Cortinas y col. 2008).
Los peces han sido utilizados desde hace mucho
tiempo como modelos biológicos experimentales
para medir el impacto ambiental de
diferentes sustancias (Slooff y col. 1983; Ballesteros
y col. 2009; Lushchak y col. 2009).
Puntualmente, nuestro grupo de trabajo los
utiliza para evaluar la potencial toxicidad de
diferentes noveles drogas de origen natural
y/o sintético (Bisogno y col. 2007; Mascotti y
col. 2008; Garibotto y col. 2010).
El objetivo de este trabajo ha sido determinar
los efectos de la toxicidad aguda y crónica en
peces de dos herbicidas comerciales formulados
con glifosato y de una solución de glifosato
puro. Para evaluar la toxicidad aguda
se registró el parámetro "mortalidad" utilizando
como modelo experimental Poecilia reticulata"lebistes" (Figura 1a); para el caso de la
toxicidad crónica se utilizaron dosis subletales
según resultados de la experiencia anterior
y se evaluaron parámetros somáticos (factor
de condición), histológicos (aspectos microscópicos
de las branquias), biomarcadores bioquímicos
(uremia y transaminasas) y hematológicos
(hematocrito y extendidos) utilizando
como modelo experimental Cyprinus carpio
haematopterus "carpa koi" (Figura 1b).
Figura 1a. Poecilia reticulata "lebistes".
Figura 1b. Cyprinus carpio haematopterus "carpa koi".
MATERIALES Y MÉTODOS
Formulaciones y soluciones utilizadas
Se seleccionaron dos formulaciones comerciales
de herbicidas, presentes en el mercado
nacional, cuyo principio activo es glifosato.
La formulación A es un herbicida utilizado en
jardinería (Glacoxan®), por lo tanto de uso no
extensivo; la formulación B es un herbicida de
uso en agricultura (Round-Up®), por lo tanto
extensivo; ambas fueron adquiridas en comercios
de la provincia de San Luis y poseen una
concentración del principio activo del 48%
p/v. Con cada una de estas formulaciones se
realizaron las correspondientes soluciones, diluyendo
directamente las mismas en el agua
que se les colocó a los peces. La solución C
fue preparada con Glifosato puro STD (máxima
pureza) 99,7% provisto por Monsanto Argentina.
Se disolvieron 180 mg de principio
activo en 300 ml de agua destilada para formar
una solución madre, la cual se diluyó para
realizar el ensayo.
Las características de estas soluciones se
presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Características físico químicas de las formulaciones y soluciones evaluadas.
Ensayos de toxicidad aguda
Se utilizó la técnica recomendada por la U.S.
Fish and Wildlife Service (Johnson y Finley
1980) que ha sido modificada para utilizar una
menor cantidad de compuestos a ensayar, según
Mascotti y col. (2008). El efecto tóxico de
los compuestos se evaluó en peces de la especie Poecilia reticulata "lebistes", criados en
nuestro laboratorio, de 0,7 a 1 cm de largo y de 15 a 20 días de vida. Diez peces se expusieron
a cada concentración del compuesto a ensayar,
usando cinco concentraciones por cada
prueba de toxicidad (en un rango de 100 μl/l a
6,25 μl/l). Las soluciones y los organismos se
colocaron en un recipiente de 1 litro donde se
mantuvieron hasta el final de las evaluaciones.
Se contabilizó el número de organismos muertos
en cada recipiente que se retiraron cada 24
hs. El porcentaje de mortalidad se evaluó cada
96 h. Se determinó para cada formulación comercial
evaluada la mínima concentración de
formulado que produjo el 100% de mortalidad
(MC100%M) y la máxima concentración que
no produjo mortalidad (MC0%M).
Ensayos de toxicidad crónica
Especímenes criados en cautiverio de Cyprinus
carpio haematopterus "carpa koi" de 5-6
meses de vida fueron colocados en recipientes
de 12 litros durante un período de 45 días.
Se colocaron 2-3 especímenes por recipiente
(relación de 1 espécimen por cada 4-6 litros
de agua) y se mantuvieron a temperatura ambiente
con aireación controlada y alimentación
estandarizada. Cada grupo se expuso a dosis
subletales considerando tales a la máxima
concertación que no produjo mortalidad
(MC0%M) en los ensayos de toxicidad aguda.
Se utilizó además un grupo control no expuesto
a ningún herbicida. Al finalizar el período
de evaluación se determinaron los siguientes
parámetros:
a- Variación del factor de condición (FC): se
determinó según la expresión matemática: FC
= P/L3 donde P es el peso en gramos y L la
longitud en cm. Las variables peso y longitud
se determinaron con balanza electrónica y calibre
digital.
b- Parámetros bioquímicos: se utilizó un método
enzimático específico para la determinación
cuantitativa de urea en sangre (Uremia,
Wiener) y un método colorimétrico para la determinación
de la actividad de Transaminasa
Glutámico Pirúvica (GPT) en suero utilizando
kits enzimáticos comerciales (Transaminasas
200, Wiener).
c- Parámetros hematológicos (hematocrito) y
estudio morfológico de las células sanguíneas
por extendido:
c1- Hematocrito: se determinó por centrifugación
de sangre heparinizada, en
un tubo capilar, a 10.000 rpm durante
cinco minutos.
c2- Extendidos: para la realización del
extendido de sangre, ésta fue obtenida
por lesión de las branquias. Se aplicó la coloración de May Grunwald- Giemsa,
la cual se efectuó de la siguiente forma:
a cada extendido se lo cubrió con el
colorante May-Grunwald puro durante
3 minutos, luego se lo enjuagó con
agua destilada 1 minuto y se lo cubrió con colorante de Giemsa diluido al
décimo en agua destilada durante 90
minutos y finalmente se lo enjuagó con
agua destilada.
d- Parámetros histológicos
Se evaluó el estado de las branquias por medio
de imágenes microscópicas tomadas por
fotografía digital inmediatamente después de
haber sacrificado a los especímenes; las imágenes
fueron tomadas con un microscopio Digital
SuperEyes, Modelo A002.
En todos los casos los resultados obtenidos
fueron comparados con los del grupo control.
Análisis estadísticos
Para los resultados de toxicidad aguda se
aplicó el método Chi cuadrado para analizar
y comparar las frecuencias entre los porcentajes
de mortalidad provenientes de las tablas
de toxicidad aguda de las soluciones A y B
frente a peces.
Para las comparaciones entre las mínimas
dosis que producen mortalidad del 100% y
las máximas dosis que no produce mortalidad
se aplicó la prueba no paramétrica de
Mann-Whitney, ya que los resultados no se
distribuyeron en forma normal.
Sobre los resultados de toxicidad crónica se
aplicó una estadística no paramétrica, mediante
los test de Kruskall Wallis y posterior comparación
mediante el test de Dunn para un grado
de significancia del 95%. Se utilizó el software
estadístico Statistx 8.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Toxicidad aguda de las formulaciones A, B y
C frente a peces
Se evaluaron concentraciones decrecientes
de las dos formulaciones comerciales (A y B)
partiendo de una concentración de 100 μl/l de
la formulaciones comerciales y diluyendo las
mismas hasta encontrar la concentración que
no producía mortalidad. La solución de glifosato
técnico pura (solución C) se evalúo a partir
de una concentración de principio activo de
100 mg/l y se fue aumentando hasta 400 mg/l.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Tabla 2.
Tabla 2. Toxicidad aguda de las formulaciones comerciales evaluadas
y de la solución de sal técnica de glifosato.
Se determinó que el herbicida B es, al menos, cuatro veces más tóxico que el herbicida A y que la solución del principio activo no resultó tóxica, aun a valores de hasta 400 mg/l; estos resultados concuerdan con estudios reportados que demuestran la implicancia de los excipientes de las formulaciones comerciales en los efectos de la toxicidad de las mismas (Servizi y col. 1987).
Análisis estadísticos
La diferencia en la toxicidad aguda frente a
peces es altamente significativa entre las concentraciones
de 100 μl/l y 50 μl/l para la solución
preparada de la formulación A con un P ≤ 0,0001.
Toxicidad crónica de las formulaciones A,
B y C frente a peces
Muchos efectos tóxicos producidos por diversas
sustancias sobre los organismos no
se manifiestan de forma inmediata; pero son
suficientes para modificar la biología de éstos
llegando incluso a condicionar su posibilidad
de sobrevida. Estos efectos se pueden evaluar
utilizando diferentes biomarcadores
Para analizar estos efectos fue necesario un
cambio de modelo biológico experimental
debido a la necesidad de disponer de especímenes
de tamaño mayor para poder evaluar los parámetros bioquímicos y hematológicos
propuestos.
Variación del factor de condición (FC)
Este factor puede indicar el estado nutricional
de los organismos y es útil para comparar y
cuantificar numéricamente la condición o estado
en que el pez se encuentra. En una primera
etapa de determinó para cada espécimen
su FC (FC día 0) y al finalizar la experiencia se
determinó nuevamente (FC día 45). Se determinaron
cuantitativamente las diferencias obtenidas;
los resultados se presentan en la Tabla 3.
En líneas generales y observando los valores
de FC al día 0 vs. día 45 pudo observarse que
todos los individuos habían desmejorado su
condición; estando en estas condiciones los
del grupo control no se pudo atribuir este déficit
a algún efecto de las soluciones, quizás se
debió a variaciones individuales.
Tabla 3. Variación del FC en peces y de las variables que lo
determinan al inicio y final de la experiencia.
Analizando un comparativo del parámetro peso se vio que en todos los casos disminuyó, contrario a lo que sucede con la longitud. Los valores de FC se analizaron mediante metodología indicada, no encontrándose diferencias significativas entre ellos para un grado de significación del 95%.
Parámetros bioquímicos (urea y GPT en sangre)
y hematológicos
Los resultados obtenidos en la evaluación de
los parámetros bioquímicos se presentan en
la Tabla 4.
Tabla 4. Parámetros hematológicos y bioquímicos obtenidos en peces
luego de 45 días de exposición frente a las soluciones evaluadas.
Urea en sangre
La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas. Se forma en el hígado y es
eliminada por la orina o sistema excretor. Un
aumento indica mal funcionamiento del sistema
excretor y una disminución está asociada
a una incorrecta absorción de nutrientes proteicos
(Henry 1993).
Los resultados muestran que los grupos de
especímenes sometidos a soluciones de herbicidas
comerciales formulados con Glifosato
(A y B) presentaron valores bajos de uremia,
comparados con el grupo control; esto podría
estar indicando una deficiente absorción fundamentalmente de las proteínas del alimento.
El grupo sometido a la Solución C no presentó diferencias significativas respecto del grupo
control.
Los valores de uremia se analizaron mediante
la metodología indicada, encontrándose diferencias
significativas entre los grupos de ensayo
sometidos a las soluciones A y B versus
el grupo control (p ≤ 0.001). Por comparaciones
posteriores por el test de Dunn se encontró que los valores correspondientes a la solución
C no difirieron del control; pero si existieron
diferencias entre los valores de la solución
A y B respecto del control y fueron semejantes
entre ellos.
Transaminasa glutámico pirúvica (GPT)
Las transaminasas son enzimas ampliamente
difundidas en el organismo. La actividad sérica
en condiciones normales es baja o nula. Una
destrucción en los tejidos en los cuales están
presentes conduce a un aumento en los niveles
séricos. Puntualmente, la pirúvico transaminasa
o GPT es una enzima utilizada para evaluar el
funcionamiento hepático. Su concentración elevada
en sangre le confiere cierta especificidad
en el diagnóstico de daños tóxicos hepáticos
(Ióvine Selva 1990)
Los resultados mostraron que no existieron
diferencias significativas entre los grupos
evaluados Los valores de transaminasa se analizaron mediante
metodología indicada, no encontrándose
diferencias significativas para un grado de
significación del 95%.
Hematocrito
Es el porcentaje del volumen total de sangre
compuesto de glóbulos rojos. Es una medición
determinada por el tamaño y número de
glóbulos rojos.
En los resultados se pudo observar cómo el
valor de hematocrito disminuyó en presencia
de la solución A y de la solución C; esto podría
deberse a un mal funcionamiento en la génesis
de glóbulos rojos.
Los valores de hematocrito se analizaron mediante
la metodología indicada, encontrándose
diferencias significativas. Por comparaciones
posteriores por el test de Dunn se encontró que los valores correspondientes a la solución
preparada con la formulación B no difirieron
del control; pero si existieron diferencias
entre los valores de la solución preparada con
la formulación A y la solución C respecto del
control y fueron semejantes entre ellos.
Extendido de sangre
El estudio de la morfología y estructura de células
sanguíneas ha sido utilizado e informado
por diferentes autores como indicador de los
efectos tóxicos de la acción de diversos herbicidas
formulados con glifosato (Tolga y Konen
2007). Este estudio se realiza por medio de la
observación microscópica de las preparaciones
coloreadas, con el objetivo de distinguir
estructuras citoplásmicas (generalmente de
aspecto granular, como vacuolas y lisosomas)
que por sus características bioquímicas se tiñen
diferencialmente.
La Figura 2 corresponde a extendidos de individuos
sometidos a la solución A, donde se
observaron eritrocitos con regular cantidad de
vacuolas citoplasmáticas siendo éstas indicadores
de toxicidad hematológica. El resto de
los grupos evaluados no presentó estas características,
al igual que el grupo control.
Figura 2. Extendidos del grupo control y del grupo sometido a dosis subletales de formulación
A, presencia de vacuolas citoplasmáticas indicada por las flechas.
Imágenes microscópicas de las branquias
Los efectos observados en células y tejidos
constituyen un importante parámetro a ser
considerado en la evaluación de un potencial
tóxico sobre los organismos vivos (Fent 1996).
Las características histopatológicas de algunos
órganos como las branquias pueden reflejar
condiciones ambientales y tiempos de
exposición de los especímenes frente a determinados
tóxicos (Schmalz y col. 2002). Las
branquias de los peces están formadas por
capilares a través de los cuales se produce el
intercambio gaseoso que permite la respiración
de los peces. La histopatología de ella es
un importante biomarcador, debido a que al
estar en contacto directo y constante con el
medio se considera un tejido vulnerable a la
calidad del medio ambiente.
En la Figura 3 se presentan imágenes seleccionadas
de un individuo de cada grupo de
ensayo. Se observan alteraciones importantes
en las branquias del grupo sometido a la
solución A, pudiendo observarse coágulos internos;
estos no están presentes en el grupo
sometido a la solución B, a la solución C ni en
el grupo control.
Figura 3. Imágenes de las branquias correspondientes a individuos de cada grupo evaluado, presencia de coágulos indicados por las flechas.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en el ensayo de toxicidad
aguda demostraron que las formulaciones
comerciales evaluadas son tóxicas aun
a bajas concentraciones, siendo la formulación
B la más tóxica, provocando un 100% de
mortalidad aún a valores de 25 μl/l de formulación
comercial, equivalente a 12 mg/l de sal
de glifosato. Se determinó también que, aún a
concentraciones altas (hasta 400 mg/l), el glifosato
puro no presentó estos efectos. En función
del análisis comparativo de los valores de
mortalidad obtenidos en el test utilizado queda
demostrado que los excipientes juegan un
rol fundamental en la toxicidad aguda.
Las dosis subletales también produjeron efectos
tóxicos principalmente a nivel hematológico.
Acusaron, además, alteraciones bioquímicas.
La formulación A fue la que produjo mayores
efectos en los parámetros mencionados.
Esta misma solución fue la responsable de la
formación de microcoágulos en las branquias
(nivel histológico). La solución C no produjo alteraciones
hematológicas e histológicas pero
si bioquímicas. Esto permite suponer que las
dosis subletales de herbicidas formulados con
glifosato tienen efectos a largo plazo, principalmente
a nivel hematológico e histológico
frente al modelo experimental utilizado.
BIBLIOGRAFÍA CITADA
1. Ballesteros M.L., Wunderlin D.A., Bistonia M.A. Oxidative stress responses in different organs of Jenynsia multidentata exposed to endosulfan. Ecotox. Environ. Safe. 2009;72:199–205.
2. Bisogno F., Mascotti L., Sanchez C., Garibotto F., Giannini F., Kurina-Sanz M., Enriz R. Structure-antifungal activity relationship of related cinnamic acid derivatives. J. Agric. Food Chem. 2007;55 (26):10635-10640.
3. Domínguez Cortinas G., Mejía Saavedra J., Santos Medrano G.E., Martínez R.R. Analysis of the toxicity of glyphosate and Faena® using the freshwater invertebrates Daphnia magna and Lecane quadridentata. Environ. Toxicol. Chem. 2008;90(2):377–384.
4. Fent K. Ecotoxicology of organotin compounds. Critical Reviews in Toxicology. 1996;26(1):3 -10.
5. Folmar L.C., Sanders H.O., Julin A.M. Toxicity of the herbicide glyphosate and several of its formulations to fish and aquatic invertebrates. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1979;8:269-278.
6. Garibotto F.M., Garro A.D., Masman M.F., Rodríguez A.M., Luiten P.G.M., Raimondi M., Zacchino S.A., Somlai C., Penke B., Enriz R.D. New small-size peptides possessing antifundal activity. Bioorg. Med. Chem. 2010;18:158-167.
7. Henry J.B. Diagnóstico y Tratamientos Clínicos. 9°ed. Nueva York: Masson- Salvat Medicina, 1993.
8. Ióvine Selva- Ióvine. El laboratorio en el diagnóstico de la enfermedad. 6° ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana, 1990.
9. Johnson W.W., Finley M.T. Handbook of Acute Toxicity of Chemicals to Fish and Aquatic Invertebrates. Washington D.C.: United States Department of the Interior, Fish and Wildlife Service. Resource Publication 137, 1980.
10. Lushchak O.V., Kubrak O.I., Storey J.M, Storey K.B., Lushchak V.I. Low toxic herbicide Roundup induces mild oxidative stress in gold?sh tissues. Chemosphere. 2009;76:932–937.
11. Mallory-Smith C.A., Ratzinger E.J.Jr. Revised classification of herbicides by sites of action for weed resistance management Strategies. Weed Technol. 2003;17(3):605-619.
12. Mascotti M.L., Enriz R.D., Giannini F.A. Acute toxicity study of commercial antifungal drugs using Poecilia reticulata. Lat. Am. J. Pharm. 2008;27(6):904-905.
13. Schmalz W.F., Hernandez A.D., Weis P. Hepatic histopathology in two populations of the mummichog, Fundulus heteroclitus. Mar. Environ. Res. 2002;54:539–542.
14. Servizi J.A., Gordon R.W., Martens D.W. Acute toxicity of Garlon 4 and Roundup herbicides to salmon, daphnia and trout. Environ. Contam. Toxicol. 1995;33:355 – 361.
15. Slooff W., De Zwart D., Van de Kerkhoff J. Monitoring the rivers rhine and meuse in the Netherlands for toxicity. Aquat. Toxicol. 1983;4(2):189-198.
16. Tolga C. Konen S. Detection of cytogenetic and DNA damage in peripheral erythrocytes of goldfish (Carassius auratus) exposed to a glyphosate formulation using the micronucleus test and the comet assay. Mutagenesis. 2007;22(4):263-268.