Mutagenesis in Lupinus polyphyllus a tool for producing spring variants?
Fatta N.1, Mascarini A2, Lopez S.3
Genetics (1) and Floriculture (2) Departments Facultad de Agronomía UBA Av. San Martín 4453 Buenos Aires City. Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA) (3)
RESUMEN
Lupinus polyphyllus permanece vegetativa durante el primer año, acumula frío durante el invierno y en el segundo se induce a floración. Las inflorescencias son racimos terminales atractivos de variados colores. En Buenos Aires la temperatura invernal media histórica es 11.5 °C, el número de horas de frío es insuficiente para que L.polyphyllus florezca y no se registra oferta comercial de plantas en maceta. Se optó por la vía de la mutagénesis inducida como fuente de variabilidad genética en L.polyphyllus con el objetivo de rescatar variantes genéticas que satisfagan su necesidad de frío naturalmente en Buenos Aires, sean capaces de florecer y dar semillas viables. Semillas cosechadas en Bariloche fueron sembradas el 4/9/2003. 600 plántulas recibieron radiación gamma en dosis de 50 Gy y se cultivaron en macetas en un invernáculo de la Facultad de Agronomía. 18 plantas fueron trasladadas al suelo en el invierno 2004 y después de la floración se cosecharon 30 semillas (BA) que se sembraron el 20/5/2005 en macetas junto con una entrada de 93 semillas procedentes de Bariloche (SALVAJES). En una oportunidad se contó el número de hojas de las 6 plantas BA sobrevivientes y de las 93 SALVAJES hallándose diferencias estadísticas significativas a favor de las primeras. Se alcanzó el objetivo propuesto ya que se recuperaron individuos que alcanzaron a florecer y fructificar naturalmente en Buenos Aires. La descendencia de estos individuos sería un germoplasma apropiado para iniciar un plan de mejoramiento genético que podría originar una variedad vegetal de L.polyphyllus apta para Buenos Aires.
Palabras claves adicionales: Vernalización; Carácter cualitativo; Radiación gamma; Variedad vegetal.
SUMMARY
Lupinus polyphyllus remains vegetative during the first year, stores cold during winter and is induced to blossoming in the second year. Inflorescences are attractive and varied coloured terminal clusters. In Buenos Aires the historical average winter temperature is 11.5 ºC and the number of hours of cold are not enough for L. polyphyllus to flower so there is no commercial offer in pots. The line of work chosen to produce genetic variability in L. polyphyllus, was induced mutagenesis with the purpose of rescuing genetic variants that meet the required cold naturally in Buenos Aires and capable of flowering and producing viable seeds. Seeds harvested in Bariloche were sown on september 4, 2003. 600 seedlings received gamma radiation at a rate of 50 Gy and were grown in pots in a greenhouse at the Facultad de Agronomia. 18 plants were transplanted to the soil in the winter of 2004 and after flowering, 30 seeds were harvested (BA) which were sown in pots on may 20, 2005 together with 93 seeds from Bariloche (WILD). Once, the number of leaves was counted in the 6 surviving plants from BA and the WILD 93, finding significant statistical differences in favour of the former. The objective persued was attained since individual plants that were capable of blossoming and bearing fruit naturally in Buenos Aires were obtained. The descendence of these individuals would be the appropiate germoplasm to initiate a genetic improvement plan that could originate a plant variety of L. polyphyllus apt for Buenos Aires.
Additional key words: Vernalization; Qualitative character; Gamma radiation; Plant variety
INTRODUCCIÓN
Lupinus polyphyllus es una especie perenne
que permanece vegetativa y en roseta durante el
primer año. En el segundo año rebrota de tallos
seudorizomatosos (Planchuelo, 2004), se elonga
hasta 1.5 m y se induce a floración (Wareing y
Phillips, 1970; Planchuelo, 2004). La inflorescencia
en racimos terminales y erectos (Ulibarri et
al, 2002) tiene numerosas flores papilionoideas
de colores azules, rojos, rosados, blancos y variegados
(Dimitri, 1978). Sus raíces pivotantes son
profundas y en las raíces secundarias pueden presentarse
nódulos del género Rhizobium (Cohen,
2005).
L. polyphyllus esta asilvestrado en la zona andino-
patagónica argentina de inviernos marcados
en donde alcanza a cubrir sus requerimientos de
vernalización (Planchuelo, 1984; Vallejos et al,
2002) dándose la diferenciación a estado reproductivo.
En Buenos Aires (34°35'S, 59°29'O) el
invierno es suave y el número de horas de frío no
es suficiente para que L. polyphyllus florezca.
Con suplementación de frío podría lograrse
floración; sin embargo los costos de dicho tratamiento
aparecen como difíciles de recuperar. Probablemente éste sea uno de los motivos por los
que no se registra oferta comercial de plantas en
maceta.
En función de este análisis se optó por usar la
vía de la mutagénesis inducida como fuente de
variabilidad genética en L. polyphyllus con el objetivo
de rescatar variantes genéticas que satisfagan
su necesidad de frío naturalmente en Buenos
Aires y sean capaces de florecer y dar semillas
viables.
Se han reportados casos de mutantes primaverales.
En Arabidopsis dichos mutantes fueron útiles para evidenciar el modo de acción de las
proteínas codificadas por los genes VRNs de vernalización
(Levy et al, 2002). Por otra parte la selección
de mutantes primaverales espontáneos de
Cicer reticulatum ha tenido un rol destacado en la
nutrición humana (Abbo et al, 2003).
Estas observaciones demuestran que en distintas
poblaciones existen variantes tanto primaverales
como invernales.
La mutagénesis como medio de producir variabilidad
esta recomendada para caracteres cualitativos
o para caracteres en que intervienen
pocos genes (Poehlman, 1988). Para caracteres
cuantitativos la probabilidad de provocar simultáneamente
mutaciones en todos los genes que
los codifican es despreciable. Frecuentemente la
necesidad de vernalización es un carácter regido
por uno (género Lolium) o por pocos genes (Wareing
y Phillips, 1970 ; Levy et al, 2002). Hiort
(1985) propone que algunos caracteres codificados
por pocos genes podrían estarlo por una combinación
de genes mayores y menores, de manera
que el efecto de una mutación podría ser evidente
si afectara a uno de los primeros. El efecto de una
mutación también podría mostrar un gradiente de
expresión, si se considera que puede mutar el gen
(de vernalización) o los genes que codifican elementos
de control de la expresión del gen
(Hiorth, 1985). En Arabidopsis un mecanismo semejante
involucra un mutante que confiere primaveralidad
aunque sería un mutante para un gen
que interactúa con los genes VRN y no un mutante
para un gen VRN (Zhang y van Nocker,
2002). Wareing y Phillips (1970) y Levy et al (2002) indican que son alelos recesivos los que
comúnmente codifican para necesidad de vernalización
por lo que la mutación de uno solo de los
alelos del gen a su estado dominante podría dar
un fenotipo más o menos primaveral sin necesidad
de esperar mutantes sólidas. Finalmente se
ha tomado en consideración el efecto dosis analizado
por Xin et al (1988) y por Grande et al (2002). El efecto dosis podría determinar que el
reemplazo gradual de los alelos de alto requerimiento
de frío por alelos que otorgan primaveralidad
origine una gama de fenotipos capaces de
florecer con números decrecientes de horas de
frío hasta llegar al individuo primaveral que no
conservaría ninguno de los alelos originales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Semillas de L. polyphyllus cosechadas en
1998 en la ciudad de Bariloche (41° 10' latitud
sur, 71° 20' longitud oeste), provincia de Río
Negro (Argentina) y conservadas a 4°C, se ubicaron el 4/9/2003 en cajas de Petri sobre papel de
filtro húmedo a temperaturas entre 18 y 24º C. A
los 7 días, cuando habían emergido la radícula y
la plúmula se sometieron a radiación gamma
con una fuente de Cobalto 60, en el Laboratorio
de Dosimetría de Altas Dosis de la Comisión Nacional
de Energía Atómica (CNEA) ubicada en
la ciudad de Ezeiza, en la provincia de Buenos
Aires. Se suministró una dosis de 50 Gy para lo
cual se requirió 42'52" a una velocidad de 1.1645
Gy/minuto con un Equipo Gammacell 220 procedente
de Canadá (Atomic Energy of Canada
Limited, Ottawa) y adquirido por la CNEA el
8/6/1965. Inmediatamente se plantó en 600 macetas
de 12 cm de diámetro y de 1 l de volumen
utilizando un sustrato constituido por resaca, perlita,
turba y pinocha en partes iguales. Las macetas
se dispusieron al azar en un invernáculo de la
Facultad de Agronomía de la Universidad de
Buenos Aires. Se regó con agua de red y se fertilizó cada 20 días con un fertilizantes de relación
N:P:K de 18:18:18 a razón de 0.5 g/l (90 ppm de
N). En el invierno 2004 se plantaron en el suelo
las 18 plantas sobrevivientes en un predio de la
Facultad ya citada. Se continuó regando y fertilizando
como se había hecho con las macetas y se
colectó toda la semilla producida.
Estas semillas que se identificaron como BA,
se sembraron el 20/5/2005 en bandejas de germinación
multicelda sobre un sustrato compuesto
en un 40% del preparado comercial específico
para germinación, 40% perlita y 20% de arena.
Además de la semilla cosechada en el predio de
la Facultad de Agronomía, se sembró semilla procedente
de la ciudad de Bariloche. Esta entrada
se identificó como SALVAJES y se usó como representativo
del material seleccionado naturalmente
en climas de invierno riguroso. El
22/6/2006 se ubicaron en macetas de 6 cm de diámetro
y de 0.75 l de volumen y posteriormente
en macetas de 12 cm de diámetro y de 1 l de volumen
utilizando un sustrato constituido por resaca,
perlita, turba y pinocha en partes iguales y
se dispusieron al azar en un invernáculo de la
misma Facultad. Se contó el número de hojas y se
hizo análisis de la varianza con el programa Infostat
(http://www.infostat.com.ar).
RESULTADOS
Las plantas mostraron buena sanidad durante 2004 por lo que no se efectuaron tratamientos con fitoterápicos. Las hojas palmadas aportaron motivo decorativo invernal ya que no cayeron y tomaron coloraciones rojizas. Durante enero 2005 florecieron 3 plantas (Figura 1) que alcanzaron a fructificar y dar 30 semillas que se cosecharon durante el mes de abril.
Figura 1. Plantas de L. polyphyllus florecidas en la Facultad
de Agronomía de la Universidad de Buenos Aires (Argentina)
durante enero 2005
En 2005 germinaron 93 semillas del grupo SALVAJES y 30 semillas del grupo BA; 6 de las últimas continuaron su desarrollo. El 23/12/05 se contó el número de hojas de todas las plantas hallándose diferencias significativas entre grupos (p=0.027517). Los individuos BA mostraron un número promedio de hojas superior al de los individuos SALVAJES (4 y 3 respectivamente) (Figura 2).
Figura 2. Números de hojas al 23/12/05
DISCUSIÓN
Los resultados permiten concluir que se alcanzó el objetivo propuesto ya que se recuperaron
individuos que alcanzaron a florecer
naturalmente en Buenos Aires. La pérdida de 588
individuos durante el ciclo 2004 se adjudicó a los
daños producidos por el tratamiento mutagénico
y a la selección efectuada por el ambiente. Se
propone que los 15 individuos que no alcanzaron
a inducirse a floración no lograron satisfacer sus
necesidades de frío y que los 3 individuos que
florecieron se diferencian genéticamente de las
poblaciones seleccionadas en los inviernos rigurosos
de la patagonia argentina. Se postula que
las 24 plántulas que murieron en el ensayo del
año 2005 fueron afectadas negativamente por el
ambiente. Es probable que los picos de alta temperatura
que suceden en los otoños de Buenos
Aires sean una de las causas de la muerte. Es probable
que muchos genes del fondo genético
hayan sufrido selección al formarse la población
BA únicamente con aquellos individuos que alcanzaron
a satisfacer su necesidad de frío en Buenos
Aires. Esta puede ser una de las causas de las
diferencias a favor detectadas en el número de
hojas durante 2005 (Figura 2). Las plantas BA
tuvieron buen desarrollo vegetativo e inicialmente
no se evidenciaron efectos de deriva o de
depresión por endogamia relacionados con el pequeño
número de individuos que aportaron descendencia
a esa generación. Elliot (1976) postula
la existencia de mecanismos que impiden la expresión
de dicha depresión e indica que en el proceso
de domesticación de leguminosas como poroto
y lotus que han sido sometidas a intensa selección
se ha establecido un sistema genético que
tolera la autofecundación.
No se ha descartado la existencia de varianza
aditiva para necesidad de frío en la entrada de
1998, de manera que tendría valor distinto de
cero la probabilidad que los individuos florecidos
en Buenos Aires sean producto de la selección
para primaveralidad.
Si bien los plazos para el lanzamiento de un
material genéticamente mejorado son muy prolongados
(Briggs y Knowless, 1967) este germoplasma
podría ser un punto de partida hacia la
búsqueda de una variedad vegetal de L. polyphyllus con buen comportamiento en Buenos Aires.
AGRADECIMIENTOS
A E.Enright por la colaboración con el idioma inglés
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