Modelos animales: desarrollo de la línea de ratones congénicos BALB/c.Cg-Ctslnkt
Fabricio Maschi1, Miguel Ayala1, Fernando Benavides2 y Cecilia Carbone1.
1Cátedra de Animales de Laboratorio y Bioterio, Facultad de Ciencias Veterinarias,
UNLP Calles 60 y 118 s/n (1900) La Plata, Argentina.
2The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Science-Park Research Division,
1808 Park Road 1C, Smithville, TX 78957. USA
RESUMEN
En los últimos 40 años, el desarrollo de modelos murinos ha posibilitado realizar avances trascendentes en el estudio y terapéutica de muchas enfermedades humanas y animales. Por otro lado, el empleo de retrocruzas ha permitido crear animales congénicos, resultado de transferir una mutación a otro fondo genético (otra cepa de ratones). La mutación espontánea recesiva nackt (símbolo nkt) fue descubierta en el año 1981 y se caracteriza por ratones parcialmente inmunodeficientes (el desarrollo de los linfocitos T CD4 se encuentra alterado), que además presentan defectos en el crecimiento del pelo y prurito crónico. El gen afectado fue inicialmente localizado en el cromosoma 13 del ratón y luego identificado como un alelo nulo de la catepsina L (nomenclatura: Ctslnkt). El objetivo de este trabajo fue desarrollar la línea congénica BALB/c-nkt, introduciendo esta mutación en la línea consanguínea BALB/c. Se recibió un grupo de ratones BALB/c;129S2 parcialmente congénicos (N3) para la mutación nackt, y se continuó con la producción de esta cepa congénica hasta la generación N10, utilizando retrocruzas seguidas de intercruza y selección de ratones mutantes. Esta cepa congénica completa (del inglés full congenic) en fondo BALB/c (denominada BALB/c.Cg-Ctslnkt) incorporó una porción pequeña del cromosoma donante portando la mutación nackt. Esta cepa congénica, actualmente disponible en nuestro país, representa una importante herramienta para estudios de inmunología, como modelo animal en estudios de dermatología y un modelo knock-out espontáneo para el gen de la catepsina L.
SUMMARY
In the last 40 years, the development of murine models has made possible remarkable achievements in the study and the therapeutic of many human and animal diseases. On the other hand, the use of backcross programs has allowed the development of congenic strains of rodents, that is the introgression of a mutation onto a recipient genetic background. The spontaneous nackt mutation (nkt) is characterized by impaired CD4 T-cell development and generalized alopecia, due to abnormal epidermal differentiation and hair follicle cycling. The introgression of this locus onto BALB/c, one of the most widely used mouse inbred strains, made possible the development of a new murine model. The objective of this work was to develop a full congenic BALB/c-nkt (nomenclature: BALB/c.Cg-Ctslnkt) through repeated backcross-intercross rounds. The development of this congenic strain was continued until the N10 generation, where the introgressed segment of the donor chromosome carrying the mutation is supposed to be very small. This congenic strain, available in our country, represents an important tool for immunology and dermatological studies and represents a spontaneous knock-out animal model for the cathepsin L gene.
Palabras Claves: Modelos animales; Nackt; Ratón inmunodeficiente; Epidermis; Folículo piloso; Catepsina L
INTRODUCCIÓN
En los últimos 40 años, el desarrollo de modelos
murinos ha posibilitado realizar avances
trascendentes en el estudio y terapéutica de muchas
enfermedades humanas y animales (Silver
1995; Benavides y Guénet 2003). La reciente explosión
de nuevas tecnologías de manipulación
genética y reproductivas ha producido una revolución
en la obtención de dichos modelos murinos.
Estos animales genéticamente modificados
representan una gran ventaja, considerándose
como una herramienta de mayor precisión que
permite traspolar los resultados de los estudios
sobre enfermedades tales como Alzheimer, Parkinson
y esclerosis múltiple, entre otras (Bedell
y col., 1997).
Desde que George Snell, en el año 1948, desarrolló sus trabajos para estudiar el complejo
mayor de histocompatibilidad en ratones (H2),
las metodologías reproductivas para trasladar un
locus de interés a líneas de ratones establecidas
han permitido desarrollar varios de estos modelos.
Uno de estos métodos es la creación de una
serie de líneas con variantes genéticas propias,
entre las cuales se encuentran las congénicas.
Estas últimas son el resultado de transferir una
mutación de interés, por medio de la reproducción
sexual, a otro fondo genético, normalmente
a una cepa de ratón consanguínea. El desarrollo
de estas líneas es esencial para estudiar tanto el
efecto de las mutaciones espontáneas como el de
las inducidas o de aquellas producidas por manipulación
genética, ya que permite mantener la
mutación en una cepa consanguínea definida aumentando
la uniformidad genotípica y reduciendo
la variabilidad genética, además brinda la
posibilidad de identificar y analizar genes modificadores
que pueden estar presentes en una cepa
endocriada; y sirve como control para estudios
comparativos entre animales de la misma cepa.
Cuando una mutación se manifiesta fenotípicamente,
su estudio es fácilmente realizable ya
que los individuos portadores de la misma se
identifican rápidamente. La mutación recesiva y
espontánea nackt (símbolo: nkt) es una entre
miles que existen en el ratón de laboratorio. Se
trata de una mutación pleiotrópica donde los individuos
homocigotos (nkt/nkt) tienen afectado
el crecimiento del pelo observándose parches de
piel desnuda y zonas de piel áspera alrededor de
los ojos y el cuello, también manifiestan un prurito
crónico a lo largo de toda su vida. El desarrollo
de los linfocitos T se ve también afectado,
presentando una deficiencia marcada de células
CD4+ 8_T en el timo y una disminución importante
de células CD4+ T en los órganos linfáticos
periféricos (Benavides F. et al, 1999).
La mutación nackt apareció en el bioterio de
la Martin Luther Universität en Halle-Wittenberg,
Alemania, en el año 1981 en un stock moderadamente
endocriado derivado del ratón
irradiado N 372. En 1991 se introdujo una pareja
de estos ratones mutantes en el Instituto Pasteur
de Francia y se cruzó con la cepa 129/Sv//Pas
por unas pocas generaciones designándolos
como NKT/Pas para posteriormente realizar intercruzas.
Los trabajos realizados por el laboratorio del
Dr. Benavides han puesto en evidencia que la
mutación nackt (nkt) involucra una deleción de
118 pares de bases en la secuencia del cDNA del
gen de la catepsina L (Ctsl); por esta razón la
mutación ahora se designa como Ctslnkt (Benavides
y col., 2001). La catepsina L tiene un rol importante
en la selección de los linfocitos CD4+ T
en el timo, en la diferenciación de la epidermis y
en los ciclos del folículo piloso, entre muchas
otras funciones (Nakagawa y col., 1998; Benavides
y col., 2002; Lombardi y Col., 2005).
La transferencia de este alelo mutado a una
de las cepas de ratones que más se utiliza, como
es BALB/c, posibilitaría la obtención de un
nuevo modelo murino que posea la mayoría de
las características correspondientes a su fondo
genético sobre el cual se hayan evaluado los resultados
de las pruebas. El objetivo de este trabajo
fue desarrollar la línea congénica
BALB/c-nkt, a partir de la introducción de esta
mutación en la línea consanguínea BALB/c.
MATERIALES Y MÉTODOS
El bioterio del Instituto de Investigaciones
Hematológicas de la Academia Nacional de Medicina
de Buenos Aires recibió un núcleo de ratones
NKT/Pas proveniente del Instituto Pasteur de
Francia con el objeto de comenzar con la producción
de líneas congénicas transfiriendo la mutación
nkt a las cepas BALB/c, C57BL/6 y DBA/2.
Debido a una contaminación microbiológica en
estos ratones, un grupo se envió al Bioterio de la
FCV - UNLP para eliminar los microorganismos
patógenos que los afectaban y posibilitar la continuación
del trabajo.
En las instalaciones del Bioterio de la Cátedra
de Animales de Laboratorio de la Facultad de
Ciencias Veterinarias (UNLP), se programó y realizó una derivación por histerectomía de los ratones
BALB/c-nkt (N3), con la finalidad de
eliminar los patógenos que los afectaban y obtener
ratones libres de patógenos específicos (del
inglés specific pathogen free, SPF). Se utilizaron
como control ratones centinelas de la cepa inmunodeficiente
nude (N:NIH(S)-nu/nu), los que se
pusieron en contacto con los ratones derivados
sometidos a la histerectomía durante un mes.
Luego se realizó un control microbiológico completo
de los centinelas para confirmar su estado
sanitario.
Para producir la cepa congénica BALB/c.Cg-
Ctslnkt se usó un esquema de retrocruzas seguido
de intercruzas hasta llegar a la generación N10.
Se considera que este número de retrocruzas es
el adecuado para que la cepa de fondo incorpore
una porción pequeña del cromosoma de la cepa
donante portando la mutación (Silver 1995; Benavides
y Guénet 2003). Debemos aclarar que el
gen mutado se encuentra comprendido en un segmento
cromosómico cuyo tamaño se reduce, generación
tras generación a causa de las
recombinaciones cromosómicas. El porcentaje
del genoma de la línea donante que aún persiste
en el genoma receptor se calcula por la formula:
1/2ⁿ (donde n = número de generaciones de retrocruza).
En la actualidad, existen metodologías
para acelerar este proceso por medio del uso de marcadores genéticos -como los microsatélites de
ADN- para seleccionar, en cada generación de retrocruza,
los animales con mayor porcentaje de
fondo genético de la cepa receptora (Wong y col.,
2002).
En cada generación de intercruza se seleccionaron
los animales mutantes (homocigotas
nkt/nkt) por su fenotipo de piel, por lo que un animal
homocigota para la mutación siempre se
cruzó con un ejemplar puro de la línea de fondo,
en este caso la BALB/c (Figura 1).
La figura 1 muestra el esquema de retrocruzas seguido de
intercruza para la creación de la cepa congénica portando la
mutación nackt. En cada generación, empezando por la F1,
es necesario intercruzar los heterocigotos +/nkt para producir
ratones nkt/nkt, los cuales son cruzados por BALB/c
puros.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luego de 10 generaciones de retrocruzas
(N10) se infiere que la cepa BALB/c ha incorporado
una porción pequeña del cromosoma 13 de
la cepa donante (estimativamente un 0,1 % del
genoma de la línea donante), portando la mutación
nackt. La producción de esta cepa congénica
ha llevado 5 años desde su inicio. A partir de la
N10 se prosiguió manteniendo la cepa congénica
BALB/c.Cg-Ctslnkt utilizando el manejo establecido
para líneas endocriadas alcanzando la generación
N10 F3 en condiciones SPF en el Bioterio
de la FCV UNLP.
Se observó que los BALB/c.Cg-Ctslnkt tienen
un desarrollo normal con pelo hasta los 12 días de
edad, a partir del cual el mismo se presenta en
forma de parches de aspecto rugoso y los animales
comienzan a manifestar un prurito intenso.
Como característica particular presentaron alopecia
difusa en la región de cuello y alrededor de
las orbitas (Figura 2A). Los individuos adultos
mantenidos en ambientes convencionales desarrollaron
ocasionalmente lesiones de piel ulcerativas
asociadas con aumento del tamaño de los
nódulos linfáticos del cuello e intercostales (Figura
2B). En algunos de estos ratones también se
puedo observar opacidad de la córnea (datos no
mostrados).
También se confirmó que los BALB/c.Cg-
Ctslnkt de ambos sexos son fértiles cuando se los
mantiene en condiciones SPF presentando parámetros
bioquímicos y hematológicos normales
(datos no mostrados).
Esta cepa congénica que actualmente se mantiene
y está disponible en nuestro país representa
no sólo una importante herramienta para estudios
de inmunología sino también para utilizarse
como modelo animal en estudios del desarrollo
de los linfocitos T CD4, la epidermis y el ciclo
del folículo piloso. Asimismo, representa un modelo
knock-out espontáneo para el gen de la catepsina
L (Benavides F. et al, 2001 y 2002).
En este sentido se puede considerar de gran
importancia la identificación de mutaciones en
colonias de ratones de experimentación y su posterior
mantenimiento en fondos genéticos definidos
lo cual permitiría obtener nuevos modelos
murinos destinados a la investigación biomédica.
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