MICOLOGÍA
Hongos asociados con dos poblaciones de Acromyrmex lobicornis (Formicidae) de San Luis, Argentina
Mónica A. Lugo1, Esteban M. Crespo2, Matías Cafaro3 y Laura Jofre2
1 Diversidad Vegetal I, IMIBIO-CONICET, FQByF, UNSL.
2 Diversidad Vegetal I, FQByF, UNSL.
3 Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico -
Mayaguez, PR 00681
E-mail: lugo@unsl.edu.ar
Resumen: Los géneros Atta y Acromyrmex comprenden a las hormigas cortadoras o podadoras de hojas de la tribu Attini, único grupo de hormigas que presenta una dependencia obligada con simbiontes fúngicos como fuente de alimento. Los fragmentos de plantas recolectados por estas hormigas son utilizados para cultivar al simbionte fúngico, el que origina gongilidios de los cuales se alimentan las larvas y la reina de la colonia. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar genómica y taxonómicamente los hongos cultivados por dos poblaciones de Acromyrmex lobicornis de la provincia de San Luis. Para ello, se recolectaron muestras del simbionte de las cámaras de cultivo más superficiales de los nidos y se cultivaron en los medios de extracto de malta (EM) y agar papa dextrosa (APD). El simbionte fúngico se identificó como Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Holobasidiomycetes, Agaricales) por sus características morfo-anatómicas en cultivo, las secuencias del gen 5.8S ribosomal y de los espaciadores ITS1 e ITS2. El diámetro de las colonias de los simbiontes fúngicos aislados fue mayor en EM; además, mostraron crecimiento diferencial entre las poblaciones de hormigas de las que fueron aislados. Se discuten posibles implicancias nutricionales y aspectos relacionados con la distribución de los simbiontes aislados.
Palabras clave: Acromyrmex lobicornis; Centro de Argentina; Hormigas podadoras; Leucoagaricus gongylophorus; Simbionte fúngicos de hormigas.
Summary: Fungi associated with two populations of Acromyrmex lobicornis (Formicidae) from San Luis, Argentina. The ant genera Atta and Acromyrmex (Tribe Attini) include the mowers or trimmers of leaves called leaf-cutting ants, which are the only ants that show an obligate dependence of fungal symbionts as a food source. Fragments of plants collected by these ants are used to grow the fungal symbionts, which produce gongylidia for the larvae and queen of the colony to feed on. The aim of this study was to isolate and characterize both, genetically and taxonomically the fungi cultured by two populations of Acromyrmex lobicornis from San Luis province. Samples were collected from the most superficial chambers of the nests and fungal isolates were cultured in malt extract (ME) and potato dextrose agar (PDA) media. The fungal symbiont associated to A. lobicornis nests was identified as Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Holobasidiomycetes, Agaricales) through its morpho-anatomic characteristics and sequencing of ITS1, ITS2 and 5.8S ribosomal gene. Fungal growth in ME was higher than in PDA, and symbiont isolates showed differential growth rates depending on ant populations from where they originated. Fungal symbiont nutritional features and distributional aspects are discussed.
Key words: Acromyrmex lobicornis; Central Argentina; Fungal symbiont; Leaf-cutter ants; Leucoagaricus gongylophorus.
Introducción
Los géneros Atta y Acromyrmex comprenden a
las hormigas cortadoras o podadoras de hojas, las
que se agrupan en la tribu Attini (Hymenoptera,
Formicidae), de distribución neártica y neotropical
(Cherrett et al., 1989). Estas hormigas son las
únicas que muestran una dependencia obligada
con simbiontes fúngicos como fuente de alimento
(Currie, 2001).
Desde un punto de vista ecológico, la simbiosis
entre las hormigas cortadoras de hojas y los
hongos que cultivan sería de tipo nutricional. Los
fragmentos de plantas recolectados por las hormigas no constituyen su alimento en forma
directa, sino que son utilizados para cultivar al
simbionte fúngico, el que los degrada y metaboliza
(Cherret et al., 1989) originando hifas ensanchadas
apicalmente denominadas gongilidios (Martin &
Martin, 1970), de los que se alimentan las larvas y
la reina de la colonia (Currie, 2001).
Estas hormigas cultivan los hongos dentro de
sus nidos, en cámaras especiales, a las que llevan
fragmentos de hojas, flores y/o frutos de diversas
plantas. Estos elementos vegetales son cortados
en piezas más pequeñas y son masticados por
las obreras, quienes le agregan al mismo tiempo
sustancias salivales y anales ricas en amonio y
aminoácidos, constituyendo así el sustrato utilizado
por los hongos. Las obreras, además, eliminan
continuamente los invasores del nido para evitar
la contaminación de los hongos. Luego de que el
cultivo lleva varios meses de actividad el nido es
descartado y reemplazado por otro nuevo (Paracer
& Ahmadjian, 2000).
Existen distintas hipótesis sobre el origen de
los hongos asociados a estas hormigas. Algunas
sostienen que evolucionaron de antecesores
saprofíticos como los que se encuentran en
depósitos de semillas, madera putrefacta y cuerpos
de artrópodos; otras, postulan que provienen de
hongos micorrícicos de algunas especies vegetales
(Garling, 1989). De uno u otro modo, esta asociación
ha permitido que el simbionte fúngico se propagara
por millones de años, resultando en un grupo
monofilético dentro de los hongos leucocoprináceos
(Currie, 2001). Sin embargo, Leucoprinaceae ya
no se considera una familia dentro de Agaricales,
aunque los hongos del género Leucoagaricus
cultivados por hormigas Attini se agrupan en un
mismo clado con Leucocoprinus y Sericeomyces
(Vellinga, 2004a). Asimismo, para otros autores
(Chapela et al., 1994), los cultivos de Atta y
Acromyrmex pertenecen al denominado grupo G1
caracterizado por carecer de fíbulas y presentar
gongilidios; mientras que, los hongos cultivados por
representantes de Asterostigma fueron agrupados
en G2 por estos autores, que demostraron la
monofilia de G1 y G2 mediante el análisis del ADN
ribosomal y la subunidad ribosonal nuclear mayor
("28S"). Estos autores concluyeron que la mayoría
de los hongos cultivados por las Attini superiores
son monofiléticos, pertenecen a Lepiotaceae y
propusieron la clonalidad y transmisión vertical del
simbionte fúngico asociado. Posteriormente, Bot et
al. (2001) proponen que la transmisión parental del
simbionte fúngico podría estabilizar el mutualismo
por la restricción de la transmisión horizontal (entre
nidos) del simbionte. Aunque esta transmisión
puede ocurrir entre especies de un mismo género
en Attini inferiores (Green et al., 2002; Mueller et
al., 1998), estas hormigas se caracterizan porque
el hongo cultivado también puede desarrollarse en
forma libre sin asociarse al nido. Por el contrario,
los simbiontes de las Attini superiores no se han
encontrado libres, lo que junto a su infrecuente
producción de basidiocarpos constituyen las bases
que permitieron proponer la transmisión vertical
y clonal de los linajes (Bot et al., 2001; Mueller et
al., 1998). Sin embargo, la presencia de cuerpos de
fructificación esporádica permitió especular sobre
la existencia de una sexualidad críptica que fue
demostrada por Mikheyev et al. (2006).
Se conocen algunos hongos de los nidos de
las hormigas cortadoras de hojas (Cherrett et al.,
1989; Kendrick, 2000; Mueller, 2002), tales como
Attamyces bromatificus Kreisel, Leucoagaricus spp.
y Lepiota spp. (Holobasidiomycetes, Agaricales),
Auricularia sp. (Phragmobasidiomycetes,
Auriculariales) y Xylaria spp. (Ascomycetes,
Sphaeriales). Sin embargo, solo producen
gongilidios en cultivo los hongos asociados a
las Attini más especializadas representantes
de Atta y Acromyrmex (Mueller et al., 2001;
Mueller, 2002), atribuyéndolos al teleomorfo Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer.
Aunque actualmente las relaciones filogéneticas de
estos simbiontes fúngicos se hallan en discusión,
se los incluye junto con los representantes de G1
y G3 delimitados por Chapela et al. (1994) en
Agaricaceae, Agaricales (Moncalvo et al. 2000,
2002; Matheny et al., 2006).
El género Acromyrmex posee 24 especies,
las que forman nidos con pocas cámaras, todas
superficiales (Cherrett et al., 1989). Se conocen
los hongos simbiontes asociados a los nidos de
A. disciger, A. crassispinus, A. hispinus atratus,
A. hispinus falax, A. laticeps, A. octospinosus, A.
rugosus y A. subterraneus molestans (Mueller
2002; Silva-Pinhati et al., 2004).
Acromyrmex lobicornis Emery es de distribución
sudamericana y está presente en la provincia de San
Luis. En nuestro país solo se han realizado estudios
genéticos (Abril & Bucher, 2007) y nutricionales del simbionte fúngico de esta especie (Abril &
Bucher, 2002, 2004), pero nada se conocía hasta el
momento, sobre la posición taxonómica del mismo.
El objetivo de este trabajo fue aislar, cultivar
y caracterizar genómica y taxonómicamente los
hongos cultivados por dos poblaciones de A.
lobicornis de la provincia de San Luis.
Materiales y Métodos
En diciembre de 2006 se recolectaron muestras
del simbionte fúngico de las cámaras de cultivo
más superficiales de nidos de dos poblaciones de A.
lobicornis de San Luis: una ubicada en el municipio
de Juana Koslay, a 19 km al NE de la ciudad de San
Luis (33° 16' 20" lat. S; 66° 16' long. OE), y otra
situada en cercanías a las Sierras de las Quijadas,
a 90 Km al NO de la cuidad San Luis (ca. 32° 20'
lat. S; 67° 10' long. OE). De cada población se
estudiaron dos hormigueros y de cada uno de ellos
se recolectó, en recipientes de vidrio previamente
esterilizados, material de 3 a 4 cámaras de cultivo.
Las muestras obtenidas de los nidos se sembraron
en los medios de cultivo agar papa dextrosa (APD)
y agar extracto de malta (EM), con el agregado
de cloranfenicol al 0,005% P/V. De cada nido,
denominados N1, N2 (hormigueros de Juana
Koslay), N3 y N4 (hormigueros de Sierra de las
Quijadas), se sembraron 20 cápsulas de Petri (10
con APD y 10 con EM), las que se mantuvieron en
oscuridad y a una temperatura de 25-30 ºC.
Después de tres semanas de cultivo, en solo
seis cápsulas de Petri se observó el desarrollo del
simbionte fúngico. De éstas, correspondientes a
N2 y N3, se realizaron repiques en los medios de
cultivo mencionados (sin cloranfenicol) a fin de
obtener cultivos puros del simbionte. Estos cultivos
se utilizaron para seguir su desarrollo durante
2 meses (a temperatura ambiente y oscuridad),
con la finalidad de observar sus características
morfológicas y efectuar su determinación
taxonómica. El micelio aislado en ambos medios
de cultivo fue montado en KOH al 5% y teñido con
solución acuosa de floxina para su observación en
un microscopio Olympus BH-2. Las micrografías
se obtuvieron con una cámara digital Sony Cybershot
DSC-H9.
Además, los aislamientos obtenidos de N2 y N3
fueron sembraron en EM y APD sin cloranfenicol, se
mantuvieron a temperatura ambiente y en oscuridad,
con 10 réplicas por medio de cultivo, para registrar
los datos del crecimiento de las colonias. Estos
datos del simbionte fúngico se obtuvieron midiendo
el diámetro de las colonias cada 7 días durante 3
meses. Al finalizar el experimento, el número de
réplicas varió entre los nidos y medios de cultivo,
ya que el hongo no sobrevivió en todas las cajas
inoculadas inicialmente y sólo se analizaron los
aislamientos vivos (4-7) que completaron el ensayo.
Para la identificación molecular de los simbiontes
fúngicos de Acromyrmex lobicornis se re-aislaron
y cultivaron los hongos asociados a 5 nidos
localizados en Juana Koslay, San Luis (33° 15'
04" lat. S, 66° 16' 17" long. OE; 32° 15' 03" lat.
S, 66° 13' 13" long. OE; 33° 15' 06" lat. S, 66°
13' 16" long. OE; 33° 15' 06" lat. S, 66° 13' 31"
long. OE; 33° 15' 04" lat. S, 66° 13' 20" long.
OE). Los nuevos aislamientos se obtuvieron de
muestras recolectadas el 23 y 30 de septiembre
de 2011, siguiendo el mismo procedimiento
previamente mencionado para las muestras del
2006. Se obtuvieron aislamientos de todos los
nidos excepto del nido 3; las cepas se denominaron
con las letras (O= aislamiento original, PR=
primer repique del original y A= aislamiento,
para discriminar por un número las cepas distintas
del mismo nido) y números (nido 1= 1-5), por
ejemplo: PR1A1, corresponde al primer repique
del nido 1 y al aislamiento 1. Estas cepas (PR1
A1, PR2A1, PR2A2, PR4A1, PR4A5, PR4A6,
PR5A2, O2A1) se determinaron molecularmente a
partir de la secuenciación de ADN del espaciador
intergénico ribosomal ITS. La extracción de ADN
se efectuó siguiendo el protocolo propuesto por
Cafaro et al. (2011) con modificaciones. Las cepas
puras fueron preservadas en etanol 100% para
su transporte; luego, se dejó evaporar el etanol a
temperatura ambiente y los micelios se transfirieron
a tubos de 1.5mL con 500μL de solución CTAB
(2% Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide,
1.4 M Tris-HCl pH 8.0, 0.25 mM EDTA). A
continuación se maceraron en morteros de cerámica
previamente esterilizados y colocados a -80°C; el
polvo fino obtenido, se recuperó y se procedió a
lavar con 500μL de cloroformo. Posteriormente, se
centrifugaron las muestras por 10 min. a 15000g,
el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo
al cual se le agregaron 500μL de cloroformo
nuevamente, después de agitar las muestras en el vortex, se centrifugaron por segunda vez durante
15 min. a 15000g. El sobrenadante resultante de las
muestras se extrajo y se le adicionó un volumen de
isopropanol, se agitaron y se mantuvieron a -80°C
durante 20 min. para provocar la precipitación de
los ácidos nucleicos. Transcurrido este tiempo las
muestras fueron centrifugadas por 15 min. a 15000g
y el precipitado resultante se lavó con 100μL de
etanol al 70% frío. El ADN se resuspendió en 50μL
de una solución TE 1/10 (10mM Tris-HCl, 0.1mM
EDTA, pH 8.0) y las muestras se guardaron a -20°C.
Con los productos de la extracción de ADN se llevó
a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Se amplificaron los espaciadores intergénicos ITS1
y ITS2 que flanquean el gen ribosomal 5.8S de los
hongos aislados en este estudio. Esta región se eligió
ya que es abundante en las bases públicas de datos
génicos, permitiendo comparar los datos obtenidos
con los preexistentes. Además, es una región muy
utilizada en hongos como marcador molecular para el
nivel de especie (Begerow et al., 2010).
Para amplificar las regiones intergénicas ITS1,
ITS2 y el gen 5.8S ribosomal, se usaron los primers
ITS4 y ITS5 (White et al., 1990), siguiendo
el protocolo de Cafaro (2005), con algunas
modificaciones. Así, las reacciones de amplificación
fueron estandarizadas para un volumen final de
25μL (0.25 mM de cada primer, 0.225 mM dNTPs,
10% solución buffer (M190A, Promega, Madison,
WI), 2.5mM MgCl2, 2 U Taq polimerasa) y se
utilizó un volumen fijo (5 μL) de ADN genómico
diluido 1:50. La reacción del PCR se realizó en
un termociclador BIORAD como se indica a
continuación: 95°C 7 min., 30 ciclos de 90 °C 30s
-53 °C 1 min. - 65 °C de 8 min., 65 °C 16 min. Los
productos se visualizaron en geles de agarosa al
1% teñidos en TE 1x con 0.1% bromuro de etidio
durante 20 min. Luego, las muestras positivas
se enviaron a secuenciar al High Throughput
Genomics Center (Seattle, WA).
La variable diámetro de las colonias se analizó
por medio de la prueba no paramétrica de Mann
Whitney y considerando α=0.05. Estos análisis
estadísticos se realizaron utilizando el programa
Infostat (versión libre). Las secuencias, en
ambas direcciones por muestra, fueron editadas
manualmente en el programa Sequencher 4.3
(Genecodes, MI) obteniéndose aproximadamente
700 pb. Luego de verificar la identidad de estas
secuencias en BLAST, las que correspondían a Leucoagaricus gongylophorus, se alinearon en
Muscle junto a secuencias representantes de otras
especies de Leucoagaricus utilizando el programa
SeaView 4.2.12 (Gouy et al., 2010). Se construyó
un árbol filogénetico por el método de Neighbor
Joining y se calculó el soporte estadístico de las
ramas luego de 1000 pseudoréplicas de Bootstrap con PAUP* v 4.0b4a (Swofford, 2000).
Resultados
Características macroscópicas del cultivo
Los cultivos puros del simbionte fúngico
presentaron una zona central de aspecto blancoalgodonoso,
en donde se observó una elevada
concentración de hifas que disminuyeron en densidad
hacia la periferia, apareciendo solo hifas hialinas en los
bordes externos del cultivo. Con el tiempo aparecen
secreciones (gotas) hialinas en ciertas zonas del
cultivo. Hacia los bordes de la colonia se observaron
zonas de aspecto grumoso, farináceo, formados por
agrupaciones de gongilidios denominadas estáfilos
(Fig. 1 A). A los 60 días, las colonias aisladas de
nidos de Juana Koslay presentaron diámetros de (35)
37,2 (40) mm en EM y (27) 29,14 (32) mm en APD,
mientras que en las aisladas de Sierra de las Quijadas
fueron de 43 mm en EM y (27) 30,5 (32) mm en APD.
Fig. 1. Simbionte fúngico aislado de nidos de Acromyrmex lobicornis de San Luis. A: Aspecto general de
las colonias en cultivo, la flecha indica la zona de estáfilos (e). B: Gongilidios (g). En el panel A la barra
representa 1 cm y en el B 15μm.
El simbionte fúngico presenta un lento crecimiento en cultivo, alcanzando 53 mm como diámetro máximo a los 3 meses de crecimiento de sus colonias en EM y 40 mm en APD. Los cultivos se desarrollaron en ambos medios, presentando, en general, mayor crecimiento en EM (Fig. 2 A y B). Por otra parte, en la zona central del cultivo en APD se observaron zonas con hifas de crecimiento erecto.
Fig 2. Crecimiento de los simbiontes fúngicos considerando el medio de cultivo (EM, APD). A: Diámetros
promedio de las colonias fúngicas provenientes del nido 2 (N2). B: Diámetros promedio de las colonias del
nido 3 (N3).
El aislamiento obtenido de N2 (Fig. 2 A) no
presentó diferencias de crecimiento entre los
medios EM y APD hasta los 21 días de cultivo, a
los 28 días su crecimiento fue significativamente
mayor en APD (W= 17.00, p= 0.0152) y a partir de
los 35 días fue significativamente mayor en EM (35,
49 y 70 días W= 48.50, p= 0.0076; 42 W= 49.00, p=
0.0076; 56 y 63 días W= 50.00, p= 0.0025; 77 días
W= 49.50, p= 0.0051). La cepa aislada de N3 (Fig.
2 B) mostró diámetros significativamente mayores
en EM a partir de los 21 días de crecimiento (21,
28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 días, W= 10.00, p=
0.0286), creciendo en forma similar en ambos
medios hasta los 14 días de cultivo.
El crecimiento de los simbiontes fúngicos presentó
diferencias considerando el nido (N2, N3) de origen
(Fig. 3 A y B). Las colonias cultivadas en APD
variaron entre nidos sólo a los 21 días de cultivo
(W= 17.00, p= 0.0485), con mayor crecimiento
de los hongos originados de N2 para este único
tiempo de crecimiento. Sin embargo, las colonias
cultivadas en EM presentaron mayores diámetros
en los aislamientos provenientes de N3 a partir de
los 14 días de crecimiento (W= 30.00, p= 0.0159).
Así, en general, los hongos aislados de N3 crecieron
más en EM, mientras que los originarios de N2
no presentaron diferencias de diámetro entre los
diferentes medios.
Fig. 3. Crecimiento de los simbiontes fúngicos considerando los nidos 2 y 3 (N2, N3) de origen. A: Diámetros
promedio de las colonias cultivadas en EM. B: Diámetros promedio de las colonias creciendo en APD.
Características microscópicas del cultivo
Se observaron hifas hialinas de 4-8 μm de diám.,
de paredes delgadas, sin fíbulas y gongilidios de
30-46 x 38-54 μm (Fig. 1 B) desarrollados a los
28 días de cultivo. Las estructuras microscópicas
del simbionte fúngico fueron similares en ambos
medios de cultivo.
Características genómicas del cultivo
Todos los aislamientos del simbionte fúngico
asociado a Acromyrmex lobicornis (representando
a los simbiontes aislados de distintos nidos y a
diferentes cepas dentro del mismo nido) en los
que se analizaron las regiones ITS1/ITS2 y el gen
5.8S ribosomal, forman un grupo monofilético
junto a otros aislamientos de Leucoagaricus
gongylophous con un soporte del 100% (Fig.
4). Los aislamientos obtenidos en este estudio
son indistinguibles de L. gongylophorus aislados
de Atta insularis, A. bisferica, Acromyrmex
hispidus falax y A. subterraneus, al menos con este
marcador molecular. Todos los aislamientos de L.
gongylophorus presentan poca distancia genética
entre ellos, pero se distinguen claramente de otras
especies de Leucoagaricus de vida libre.
Fig. 4. Relación filogenética de los hongos simbiontes de Acromyrmex lobicornis de San Luis. La
topología del árbol filogenético obtenido por Neighbor Joining representa la reconstrucción basada en las
secuencias de los espaciadores intergénicos ITS1/ITS2 y el gen 5.8S ribosomal. Los números en las ramas
representan el soporte probabilístico obtenido por los análisis de 1000 pseudoréplicas de Bootstrap. Los
números de acceso de GenBank se encuentran indicados después del nombre de la especie del hongo e
inmediatamente entre paréntesis y en negrita se indica la hormiga hospedante en el caso de los hongos
simbiontes. Referencias: primer repique del nido 1, aislamiento 1 (PR1 A1); primer repique del nido 2,
aislamientos 1 y 2 (PR2A1, PR2A2); primer repique del nido 4, aislamientos 1, 5 y 6 (PR4A1, PR4A5, PR4A6); primer repique del nido 5, aislamiento 2 (PR5A2); cepa original del nido 2, aislamiento 1 (O2A1).
Discusión
las hormigas podadoras (Formicideae, Attini)
han sido estudiadas por largo tiempo por su
interesante comportamiento "hortícola" y por el
simbionte fúngico que cultivan en sus nidos. En
las llamadas Attini superiores, representadas por
los géneros Atta y Acromyrmex, la formación de
gongilidios en nidos y cultivos axénicos fue ya
reportada por Möller en 1893 (Cherrett et al., 1989;
Fisher et al., 1994a). En general, la producción
de basidiocarpos en los nidos es infrecuente
(Mueller, 2002) y el simbionte fúngico no suele
fructificar en los nidos mientras es cultivado por las
hormigas, sino que lo hace cuando la reina muere,
la colonia se desorganiza o el nido es abandonado
(Fisher et al., 1994b). En hormigueros de Atta
cephalotes mantenidos en laboratorio, Fisher et
al. (1994b) lograron obtener basidiocarpos de Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer
y, a partir de éstos, colonias fúngicas en cultivo
en APD con características morfo-anatómicas
similares al hongo asociado a los nidos. Además,
estos autores (Fisher et al., 1994a), cultivaron en
APD secciones de las laminillas y del pie de los
basidiocarpos obtenidos, describiendo las colonias
fúngicas aisladas, los gongilidios (agrupados en
los bordes de las colonias) y el micelio afíbulado,
todas características macro- y microscópicas que
coinciden con las del simbionte fúngico aislado de Acromyrmex lobicornis de San Luis.
Otras especies de Leucoagaricus se han registrado
asociadas a hormigas cortadoras; así, L. weberi J. J.
Muchovej, Della Lucia & R. M. C. Muchovej se
descubrió en nidos mantenidos en laboratorio de Atta sexdens subsp. rubropilosa (Muchovej et al.,
1991) en Brasil y L. amazonicus A. Ortiz & Franco-
Mol. fue hallado en pilas de detritos o "basureros"
de Acromyrmex octospinosus de Colombia (Ortiz et
al., 2008). Ambas especies tienen características de
cultivo macroscópicas similares a L. gongylophorus y también carecen de fíbulas, pero en ellas los
gongilidios están ausentes y en consecuencia no
existen estáfilos en los márgenes de las colonias.
Además, los basidiocarpos de L. amazonicus poseen
queilocistidios capitados con contenido denso y
pardo, mientras que L. weberi carece de ellos.
Si bien Fisher et al. (1994a, b) demuestran la
similitud morfológica y la correspondencia entre
el basidiocarpo de Leucoagaricus gongylophorus y el hongo simbiótico con gongilidios cultivados
en el nido por Atta cephalotes; sólo recientemente
Pagnocca et al. (2001), demuestran esta similitud
a nivel molecular entre L. gongylophorus y el
hongo formador de gongilidios asociado a nidos de Acromyrmex hispidus fallax de Brasil. Además, se
ha demostrado la similitud en los cultivos fúngicos
de las Attini superiores cortadoras de hojas (Atta y Acromyrmex) y la capacidad única de estos
simbiontes fúngicos de producir gongilidios en
diversas especies en particular en Acromyrmex
heyeri, A. landolti y A. lundii de Argentina además
de otras especies sudamericanas (Folgarait et al.,
2011; Schultz & Brady, 2008). Por lo tanto, este
es el primer registro confirmado molecularmente
de L. gongylophorus como el simbionte fúngico de Acromyrmex lobicornis para Sudamérica.
En nuestro país, existen registros de varias
especies de vida libre del género Leucoagaricus (Lechner et al., 2006; Wright & Albertó, 2002), sin
embargo, no se habían reportado hasta el momento las
especies cultivadas en nidos de hormigas podadoras.
Anteriormente, fueron halladas fructificaciones en
basureros de hormigueros (Spegazzini, 1898, 1921)
de los hongos mirmecófilos Locellina mazzuchii Speg. (Cortinariaceae, Agaricales, Basidiomycota), Xylosphaera micrura (Speg.) Dennis (Xylareaceae,
Xylariales, Ascomycota) y el anamorfo de Discoxylaria myrmecophila J.C. Lindq. & J.E.
Wright y Hypocreodendron sanguineum Henn. (= Poroniopsis bruchi Speg.) (Xylareaceae, Xylariales,
Ascomycota).
En cuanto a su ubicación taxonómica y sistemática, Leucoagaricus es un género controvertido. Si
bien Leucoagaricus fue considerado un género
artificial por Johnson (1999), este autor al tratar
la filogenia dentro de Lepiota no incluyó en su
análisis las especies de Leucoagaricus cultivadas
por las hormigas podadoras. Posteriormente,
Moncalvo et al. (2000, 2002) sí incorporan estos
simbiontes fúngicos en el análisis filogenético,
agrupándolos junto con géneros morfológicamente
muy diferentes como Battarraea, Chlorophyllum, Cystolepiota, Lepiota, Melanophyllum, Podaxis y Tulostoma (entre otros), que fueron asignados
a Agaricaceae. Además, la revisión de los
hongos lepiotáceos (actualmente, Agaricaceae)
considerando su ecología, distribución y filogenia
(Vellinga, 2004a, b), mostró el agrupamiento de
los representantes de Leucoagaricus cultivados
por las Attini y los de vida libre, junto con Sericeomyces y Leucocoprinus, aunque Vellinga
(op. cit.) rechazó la monifilia de Leucoagaricus y planteó la necesidad de estudios intensivos y
extensivos en las zonas tropicales para poder
dilucidar si es un sólo género o puede separarse
en varios. Por lo tanto, Leucoagaricus permanece
como género por sus caracteres morfológicos
hasta el momento en que su filogenia se resuelva;
mientras que, por ahora, hay consenso en su
inclusión en Agaricaceae, Agaricales (Matheny et
al., 2006), tanto de las especies de vida libre como
las simbióticas asociadas a hormigas podadoras.
El crecimiento lento y escaso de estos simbiontes
fúngicos es bien conocido para aislamientos de Leucoagaricus gongylophorus obtenidos de Acromyrmex hispidus fallax (Pagnocca et al., 2001) y coincide con nuestras observaciones. Estos
hongos simbiontes degradan maltosa (Cherrett et
al., 1989) y otras sustancias (entre ellas almidón)
y recientemente se determinó la producción
extracelular de α-amilasa y maltasa por el simbionte
fúngico L. gongylophorus asociado a Atta sexdens (Silva et al., 2006). Estas enzimas intervienen en la
degradación del almidón a glucosa y la particular
capacidad para producir maltasa explicaría el
mayor crecimiento en EM de los hongos obtenidos
de nidos de Acromyrmex lobicornis de San Luis.
Sólo se aisló un simbionte fúngico en cada nido
de Acromyrmex lobicornis de San Luis; además, el
simbionte fúngico cultivado fue morfológicamente
similar en las poblaciones. En nidos de Atta
cephalotes de Trinidad, además de Leucoagaricus
gongylophorus se aislaron 16 taxones de
micromicetes epífitos o endófitos, a partir de las
hojas recolectadas por las hormigas para cultivar
al simbionte (Fisher et al., 1996). Leucoagaricus
gongylophorus presenta baja capacidad para
reconocer y actuar como antagonista frente a otros
hongos y depende en gran medida del cuidado
de las hormigas para suprimir el crecimiento de
éstos en el nido. Para ello, las hormigas producen
en las glándulas metapleurales de las obreras una
secreción con actividad biológica que suprime la
germinación de esporas fúngicas, sumadas a las
prácticas de remoción de partículas extrañas fuera
del nido (Orthius-Lechner et al., 2000) y también se asocian con actinobacterias que las protegen de
patógenos específicos (Cafaro et al., 2011). Sin
embargo, Bot et al. (2001), Doherty et al. (2003),
Silva-Pinhati et al. (2004) y Mikheyev et al. (2006), solo aislaron a L. gongylophorus de nidos
de Acromyrmex octispinosus y A. echinator de
Panamá, de Atta cephalotes de Trinidad y Panamá,
de cuatro especies de Atta y seis de Acromyrmex de Brasil, de Acromyrmex octospinosus de la
Isla Guadalupe y de especies de Atta (datos
moleculares de Brasil y Panamá) respectivamente.
A pesar de la variedad de especies de Atta y Acromyrmex involucradas en estos análisis y las
distancias geográficas entre los sitios estudiados,
la variabilidad génica observada mediante
técnicas moleculares ("AFLP", "RAPDs", "ITS1"
y "ITS2", y síntesis de proteínas, "DMC1" y
"RAD51", respectivamente) de los aislamientos
de L. gongylophorus (obtenidos de los nidos y
basidiocarpos crecidos en los nidos), demuestran
que el hongo cultivado en los nidos es una única
especie (L. gongylophorus) que presenta una
sexualidad críptica, lo que sugiere podría basarse en
la "parasexualidad" o la transmisión horizontal del
hongo lo que, consecuentemente, incrementaría la
variabilidad intraespecífica, mostrando un sistema
coevolutivo hongo-hormigas podadoras bien
establecido (Mikheyev et al. op. cit.). En nuestro
país, la variabilidad génica en los simbiontes de A. lobicornis y otra cinco especies del género fue
estudiada por Abril & Bucher (2007) aplicando el
marcador génico de secuencias internas simples
repetidas ("ISSR"), pero la variabilidad observada
por estos autores fue interpretada como la existencia
de distintos hongos simbióticos y no como la
variabilidad intrínseca de un sola especie fúngica.
Este resultado contradictorio a los obtenidos en
este estudio, en apariencia, podría deberse al
método de aislamiento de los hongos analizados,
ya que Abril y Bucher (2007) no realizaron los
aislamientos con el micelio cultivado en los nidos,
como en el presente estudio y en los anteriormente
citados (Bot et al., 2001; Doherty et al., 2003,
Silva-Pinhati et al., 2004; Mikheyev et al., 2006),
sino que los obtuvieron a partir de los fragmentos
de las hojas trasladadas por las hormigas para el
cultivo del hongo simbiótico. Así, Abril y Bucher
(2007), habrían aislado micromicetes epífitos y
otros endófitos, además de L. gongylophorus,
coincidiendo con Fisher et al. (1996).
Si bien no se encontraron diferencias en la
posición taxonómica del simbionte fúngico
hallado en ambas poblaciones de A. lobicornis de San Luis, los aislamientos difirieron en su
crecimiento en los medios de cultivo, dependiendo
de su nido de origen. El simbionte aislado de nidos
de Sierra de las Quijadas tuvo mayor diámetro
en EM, mientras que en el de Juana Koslay el
diámetro no difería con el medio de cultivo.
Estos resultados refuerzan las observaciones
obtenidas del simbionte fúngico asociado a Atta y Acromyrmex de Brasil y el Caribe (Silva-Pinhati et al., 2004; Mikheyev et al., 2006), que muestran
que el simbionte fúngico cultivado presenta
diferencias génicas según la zona de origen del
nido. De tal forma, estas diferencias génicas
podrían redundar en capacidades fisiológicas
diferenciales entre los cultivos fúngicos, como las
halladas en el presente trabajo. Además, nuestros
resultados refuerzan desde la morfología y la
fisiología fúngica, la propuesta de Mikheyev et
al. (2006), quienes postulan que esta simbiosis
hongos-hormigas podadoras no sería un caso
de coevolución uno-a-uno, sino varios-a-uno y
que habría transmisión horizontal del simbiontes
fúngico entre las Attini superiores.
Conclusiones
Las características microscópicas y genómicas de los cultivos aislados de nidos de Acromyrmex lobicornis Emery coinciden con las de Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Basidiomycota, Agaricales, Agaricaceae). Esta es la primera cita de la especie L. gongylophorus aislada de nidos de A. lobicornis para Sudamérica y Argentina. Además, este trabajo demuestra que l. gongylophorus es la única especie fúngica cultivada en los nidos de A. lobicornis de poblaciones de San Luis. Este simbionte presenta leves diferencias funcionales entre poblaciones de hormigas, que se reflejarían en su capacidad diferencial en degradar maltosa, mientras que dichas diferencias podrían sugerir cierta variabilidad génica en la especie. Nuestros resultados acuerdan, en base a los datos obtenidos desde la morfología y la fisiología, con la propuesta de varios-a-uno del mutualismo entre hongo-hormigas podadoras pertenecientes a las Attini superiores.
Agradecimientos
Este trabajo de investigación se realizó en el marco del proyecto PROICO 2-0203, financiado por la FQByF (UNSL).
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Recibido el 3 de enero de 2011,
aceptado el 14 de
noviembre de 2011.