GENÉTICA Y EVOLUCIÓN
Estudios citogenéticos en especies de Passiflora subgénero Passiflora (Passifloraceae)
Ana Laura Chiapero1, María Laura Las Peñas1*, María Teresa Amela García2 y Gabriel Bernardello1
1 Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal (UNC-CONICET).
2 DBBE, FCEyN (UBA), PROPLAME-PRHIDEB
(CONICET).
* laulaspenas@yahoo.com.ar
Resumen: Passiflora comprende alrededor de 525 especies con x = 9 ó 6. Se realizó un estudio citogenético de cuatro especies del subgénero Passiflora que crecen en la Argentina. Se utilizaron las técnicas de Giemsa, bandeo cromosómico fluorescente CMA/DAPI y FISH (sonda 18-5,8-26S y 5S) en cromosomas mitóticos. P. caerulea, P. tucumanensis y P. cincinnata resultaron diploides (2n = 18) mientras que P. mooreana, tetraploide (2n=36). Los cariotipos fueron altamente simétricos con la fórmula 8 m+ 1 sm, duplicada en P. mooreana. Con CMA/DAPI, todos los diploides presentaron dos o tres pares de bandas terminales CMA + /DAPI - , mientras que la especie tetraploide presentó cinco pares, asociadas a NOR. Con FISH, los loci 18-5,8-26S coincidieron en número y posición con las bandas CMA + /DAPI - . En cada especie, el número de sitios para los genes de 5S ADNr concordaron con el nivel de ploidía. Los datos de P. tucumanensis y P. mooreana se reportan por primera vez, siendo esta última el primer tetraploide conocido para el subgénero Passiflora. Los patrones de FISH y las bandas heterocrómaticas variaron entre las especies de Passiflora estudiadas, principalmente en el número y distribución de las señales.
Palabras clave: Passiflora; Cariotipos; Heterocromatina; ADNr 5S and 18-5,8-26S.
Summary: Cytogenetic studies in species of Passiflora subgenus Passiflora (Passifloraceae). Passiflora has nearly 525 spp. with x = 9 or 6. A cytogenetic study of four species from subgenus Passiflora that grow in Argentina was performed. Giemsa technique, fluorescent chromosome banding CMA/DAPI and FISH (probe 18-5,8-26S and 5S) were used in mitotic chromosomes. P. caerulea, P. tucumanensis and P. cincinnata resulted diploid (2n = 18) while P. mooreana tetraploid (2n = 36). The karyotypes were highly symmetrical, with the formula 8 m+ 1 sm, duplicated in P. mooreana. With CMA/DAPI, diploids showed 2-3 pairs of terminal bands CMA + /DAPI - , whereas the tetraploid five bands, associated to NOR in all cases. With FISH, the loci 18-5.8-26S coincided in number and position with the CMA + /DAPI - bands. In each species, the number of sites for 5S rDNA genes agreed with the ploidy level. Data of P. tucumanensis and P. mooreana are here reported for the first time, being this last species the first known tetraploid for subgenus Passiflora. FISH patterns and heterochromatic bands varied among the Passiflora species studied, mainly with respect to the number and distribution of the signals.
Key words: Passiflora; Karyotypes; Heterochromatin; DNAr 18-5.8-26S and 5S.
Introducción
Passifloraceae Juss. ex Roussell cuenta con
18 géneros y 630 spp. distribuidas en regiones
tropicales y subtropicales (Deginani, 2001).
Se encuentra dividida en dos tribus: Pariopsae,
africana, y Passiflorae, que crece en América,
Asia y Oceanía. En ésta se ubica Passiflora,
el género más representativo de la familia con
aproximadamente 525 spp. americanas y 240
especies nativas del sudeste asiático y Nueva
Zelandia (Killip, 1938; Feuillet & MacDougal,
2003, 2007). Son enredaderas herbáceas o leñosas,
usualmente trepadoras con zarcillos axilares. El
género es considerado monofilético, dividiéndose en
4 subgéneros (Deidamioides, Decaloba, Passiflora
y Astrophea), 15 supersecciones, 31 secciones y 13
series, sistema que se adopta en este trabajo.
Las especies de Passiflora pueden ser repartidas
en cuatro grupos cariológicos representados por x
= 6 (número básico ancestral para el género), 9, 10
y 12 (Melo & Guerra, 2003; Hansen et al., 2006).
Sus dos linajes más importantes son los subgéneros Decaloba y Passiflora. Las especies de Decaloba son 214, en su mayoría enredaderas herbáceas con
flores y frutos pequeños; son llamadas el grupo
n = 6 (Snow & MacDougal, 1993), por ser este
su número básico (Melo et al., 2001; Hansen et
al., 2006). Dentro del subgénero Passiflora hay
236 spp., que se caracterizan por ser enredaderas
leñosas con flores vistosas y frutos comestibles,
siendo n = 9 su número cromosómico haploide más
representativo (Hansen et al., 2006).
Hasta el momento, se conocen los números
cromosómicos de 23% de las especies de Passiflora
(Souza et al., 2008) y el 58 % de las 19 citadas
para Argentina (Deginani & Cervi, 2008; Bugallo,
2010), siendo diploides en su mayoría. Por otra
parte, pocas especies han sido estudiadas con
técnicas citogenéticas modernas. Con la técnica
de bandeo fueron estudiadas apenas 8 spp. con
n = 6 y 9 (Melo et al., 2001; Cuco et al., 2005),
mientras que con la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH), analizaron la variación en los
sitios ADNr 18-5,8-26S y 5S en 20 spp. de Brasil
(Melo & Guerra, 2003).
Con estos antecedentes, el objetivo general de
este trabajo es estudiar los cromosomas mitóticos
de cuatro especies de Passiflora subgénero Passiflora que habitan en Argentina, con tinción
clásica, bandeo fluorescente CMA/DAPI y FISH,
atendiendo a sus características cualitativas y
cuantitativas a fin de establecer sus cariotipos y las
relaciones existentes entre ellas.
Materiales y Métodos
El material estudiado provino de localidades
de Argentina: P. caerulea L., Buenos Aires- Cap.
Fed., Amela García 517; La Rioja-Chilecito, Las
Peñas 515; P. cincinnata Mast., Córdoba- Capital,
Las Peñas 516; P. mooreana Hook. f., Córdoba- R.
García, Las Peñas 517; P. tucumanensis Hook.,
Catamarca-Londres Cocucci 4538. Los ejemplares
de herbario fueron depositados en el Museo
Botánico de Córdoba (CORD) y determinados por
Amela García, M. T.
Para la obtención de preparados cromosómicos
se utilizaron raíces pretratadas con
8-Hidroxiquinoleína 2 mM durante 24 horas en
heladera y fijadas posteriormente en solución
Farmer (alcohol etílico:ácido acético glacial, 3:1).
Las mismas fueron conservadas en freezer hasta
su uso.
Coloración convencional: Los preparados
se realizaron utilizando la técnica de HCl/
Giemsa (Guerra, 1983). Las raíces fijadas fueron
aplastadas en ácido acético 45%. Posteriormente,
los cubreobjetos se retiraron por congelamiento
con N2, y finalmente, los preparados fueron
coloreados con una solución de Giemsa al 2%
preparada en el momento. Los cariogramas
de cada célula se realizaron organizando los
cromosomas en grupos de acuerdo a su índice
braquial, siguiendo la terminología de Levan et al. (1964). La asimetría de los cariotipos fue estimada
usando los índices de asimetría intracromosómica
(A1) e intercromosómica (A2) propuestos por
Romero Zarco (1986) y el índice de asimetría
TF% propuesto por Huziwara (1962). Los satélites
fueron clasificados según Battaglia (1955).
Bandeo cromosómico fluorescente CMA/DAPI: Las preparaciones se llevaron a cabo mediante
digestión enzimática con celulasa 2% y pectinasa
20% a 37ºC durante 90 minutos, y fueron aplastadas
con ácido acético 45% y se retiró el cubreobjetos
por congelamiento con N2. El bandeo se realizó
utilizando los fluorocromos cromomicina A3 (CMA)
y 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), siguiendo el
protocolo descripto por Schwarzacher et al. (1980)
con pequeñas modificaciones: los preparados fueron
teñidos con CMA por 90 minutos, posteriormente
con DAPI por 30 minutos, y finalmente montados
con buffer MacIIvaine: glicerol (1:1).
FISH: Los preparados se llevaron a cabo de la
misma manera que para el bandeo. Se siguió el
protocolo de Schwarzacher & Heslop-Harrison
(2000), utilizando la sonda pTa71 (Gerlach &
Bedbrook, 1979) para la localización de los genes
ribosómicos 18-5,8-26S y la sonda de ADNr 5S
fue obtenida por PCR a partir de ADN genómico
de Pereskia aculeata (Cactaceae, Las Peñas et al.,
2010). El marcado de las sondas se realizó con
Biotina (Bionick, Invitrogen) y Digoxigenina (DIG
Nick translation mix, Roche) mediante la técnica
de nick translation. Las señales de hibridación
fueron detectadas utilizando Avidina-FITC (Sigma) y anti-DIG-Rodamina (Roche). Por último, los
cromosomas se colorearon con DAPI.
Las fotomicrografías fueron tomadas en
microscopio Zeiss Axiophot y cámara digital
Leica DFC300FX. Para la adquisición de fotos
de coloración convencional se utilizó contraste de
fases, en tanto que para las de bandeo cromosómico
y FISH se utilizó epifluorescencia con los filtros
correspondientes para cada fluorocromo. Para
el análisis morfométrico del cariotipo luego del
bandeo y FISH, se efectuaron mediciones de los
marcadores (bandas heterocromáticas) en 2-5 placas
metafásicas correspondientes a 2-5 individuos
de cada taxón, respectivamente. Estos datos se
adicionaron a los idiogramas construidos en base a
las mediciones cromosómicas de metafases teñidas
convencionalmente, donde la medida de cada
marcador está representada como porcentaje de
la longitud del brazo cromosómico. Se calculó el
porcentaje de heterocromatina asociada a regiones
organizadoras nucleolares (% HC-NORs) en
relación al largo total del genoma.
Resultados
Se encontró que ambas poblaciones de P. caerulea contaron con 2n =18, al igual que P. cincinnata y P. tucumanensis (Fig. 1 A, B); por otro lado, P. mooreana resultó tetraploide, con 2n = 36 (Fig. 1 C). La longitud promedio cromosómica fue de 1,73 μm, la longitud de mayor valor (2,43 μm) fue encontrada en el par 1 de P. caerulea y la de menor valor (1,13 μm) en el par 8 de P. tucumanensis. La longitud del genoma haploide varió entre 17,92 μm en P. caerulea y 13,00 μm en P. tucumanensis, siendo 15,46 μm su promedio. La relación entre el par cromosómico de mayor y de menor tamaño de las especies de Passiflora analizadas varió en un rango de 0,20-0,27 (Tabla 1).
Fig. 1. Fotomicrografías de cromosomas mitóticos
de Passiflora teñidos con Giemsa: A: P. caerulea, B: P. tucumanensis, C: P. mooreana. La escala
representa 5 μm.
Tabla 1. Características cariotípicas de las especies de Passiflora analizadas. Números cromosómicos
(2n), nivel de ploidía (X), fórmula cariotípica (FC), presencia de pares cromosómicos con satélites
(Sat), largo total del genoma haploide (Lt), largo cromosómico promedio (C), la relación entre
el par cromosómico de mayor y menor tamaño (R), Índice de asimetría intracromosómico (A1)
e intercromosómico (A2) (Romero Zarco 1986), índice TF% (Huziwara 1962) y porcentaje de
heterocromatina asociada a NORs (%HC NOR). Lt y C están expresados en μm.
P. caerulea y P. tucumanensis mostraron la misma fórmula cariotípica haploide (8 m+ 1 sm), en tanto que la especie tetraploide P. mooreana, presentó una fórmula cariotípica duplicada (16 m + 2 sm) (Fig. 3). En la Tabla 1, se observa que las especies estudiadas cuentan con cariotipos simétricos, lo cual se ve reflejado en los índices de asimetría calculados, con un rango de A1+A2 = 0,29-0,34 y TF % entre 43,16% y 44,73% para P. caerulea y P. tucumanensis, respectivamente. En todas las especies analizadas se encontraron microsatélites, siendo su visualización dificultosa con la técnica clásica, probablemente debido a su tamaño reducido (Figs. 1 y 2).
Fig. 2. Cromosomas metafásicos de Passiflora teñidos con doble tinción fluorescente CMA/DAPI (A-D) y
FISH (E-H). A y E: P. caerulea, B y F: P cincinnata, C y G: P. mooreana y D y H: P. tucumanensis . Las
flechas indican las bandas CMA+/DAPI-y las escalas representan 5 μm.
Fig. 3. Idiogramas de Passiflora. Los bloques negros
indican las regiones de ADNr 18-5,8-26S (CMA+/
DAPI -asociadas a NORs) y los bloques grises
representan los sitios 5S. La escala representa
3μm.
Con la técnica de bandeo fluorescente CMA/
DAPI, en todas las especies se detectaron bandas
CMA+/DAPI- asociadas a regiones organizadoras
nucleolares (NORs). En las dos poblaciones de P. caerulea estudiadas y en P. tucumanensis fueron observados tres pares cromosómicos con
bandas CMA+/DAPI- (Fig. 2 A, C), en tanto que P. cincinnata presentó sólo 2 pares (Fig. 2 B).
Finalmente, en P. mooreana se identificaron 5 pares
cromosómicos con bandas CMA+/DAPI- (Fig. 2
D). Cabe destacar que en todos los casos pudieron
observarse al menos un par de bandas de mayor
tamaño, mientras que las restantes siempre fueron
pequeñas. A partir de las fotografías obtenidas
fue calculado el porcentaje de heterocromatina
asociado a NORs, en relación al largo total del
genoma. El valor más elevado fue 5,18% en P.
caerulea y el menor fue 3,69% en P. mooreana (Tabla 1).
Por último, con la técnica de FISH se observó
la localización de los genes ribosómicos. El ADNr
18-5,8-26S se colocalizó con el patrón de bandas
CMA+/DAPI- asociadas a NORs (Figs. 2 E-H, 3).
Los genes 5S se encontraron en número variable y
posición paracentromérica en las distintas especies: P. caerulea, P. tucumanensis y P. cincinnata presentaron señales en un par cromosómico,
mientras que en P. mooreana pudieron observarse
cuatro sitios 5S. Dichas señales fueron siempre de
tamaño muy reducido (Figs. 2 y 3) y estuvieron
siempre localizados en pares cromosómicos
distintos a los que contenían señales 18-5,8-26S
(Fig. 3).
Discusión
Passiflora caerulea y P. cincinnata (2n = 18)
fueron examinadas previamente, coincidiendo los
números cromosómicos aquí hallados con recuentos
previos en otras poblaciones (Janaki Ammal, 1945;
Guerra, 1986; Melo et al., 2001; Bugallo, 2010).
A la vez, se dan a conocer por primera vez los
números cromosómicos de P. tucumanensis (2n =
18) y P. mooreana (2n = 36). Esta última resulta
una novedad dentro del subgénero Passiflora ya que
es la segunda especie poliploide conocida luego de Passiflora sp. con 2n = 72 proveniente del Estado
de Pernambuco en Brasil (Melo et al., 2001). Los
resultados obtenidos en este trabajo confirman x = 9
como el número básico característico del subgénero
(Melo et al., 2001; Melo & Guerra, 2003; Souza et
al., 2008).
Las especies con x = 9 (subgénero Passiflora)
presentan cariotipos simétricos con 7 m+ 2 sm ó 8 m + 1 sm (Melo & Guerra, 2003; Hansen et al., 2006).
Melo et al. (2001) reportan grandes diferencias
entre los cariotipos; éstos difieren tanto en posición,
como en número de constricciones secundarias,
presentándose principalmente en posición terminal
o sub-terminal en el brazo largo de dos o tres pares
cromosómicos. Nuestros resultados indican que los
caracteres cariológicos se ajustan a los descriptos
para dicho subgénero (excepto P. mooreana, tetraploide).
La asimetría de los cariotipos fue calculada a
través del índice TF% (Huziwara, 1962) en pocas
especies de Passiflora. Del subgénero Passiflora previamente fueron analizadas sólo trece especies,
con valores entre 46,78% para P. edmundoi y
38,68% para P. quadrangularis (Souza et al., 2003),
rango dentro del cual se encontraron las especies de
este estudio.
En los estudios previos de bandeo en Passiflora, se
hallaron bloques de HC CMA+/DAPI- en las regiones
terminales de uno a tres pares cromosómicos,
coincidiendo generalmente con la posición y número
de satélites (Guerra, 2000; Cuco et al., 2005; Melo et
al., 2001; Souza et al., 2008). En nuestros resultados, se observa que las especies diploides, efectivamente
presentaron 2-3 pares cromosómicos con bloques
de HC CMA+/DAPI- ubicados en las constricciones
secundarias. Asimismo, no se encontraron diferencias
entre las poblaciones de P. caerulea y P. cincinnata de Argentina y Brasil. Por otro lado, P. mooreana (poliploide) presentó cinco bloques coincidentes con
el número de satélites. La única especie poliploide
(2n = 8x = 72) estudiada hasta el momento, cuya
identidad específica se desconoce, mostró quince
bandas CMA+/DAPI-, observándose que el número
de satélites aumenta junto al nivel de ploidía (Melo et al., 2001). Además, en este trabajo por primera
vez en Passiflora se calculó el porcentaje de HC,
observándose que dentro de las especies diploides
no se observan grandes diferencias, mientras que en
la especie poliploide, el porcentaje de HC fue menor.
Con la técnica de FISH, Melo & Guerra (2003)
analizaron la variación en los sitios ADNr 5S y 18-
5,8-26S en 20 especies de Passiflora, observando
que las diploides con x = 6 presentaron generalmente
dos sitios ADNr 5S y dos o cuatro ADNr 18-5,8-26S,
en relación con su grado de ploidía. Las especies con
x = 9 frecuentemente mostraron más de dos locus
5S y 18-5,8-26S. De acuerdo con estos autores,
en general, el número y localización de sitios 5S y
18-5,8-26S es consistente con la hipótesis de x = 6,
como el grupo ancestral del género, mientras que los
grupos con x = 9, 10 y 12 serían de origen tetraploide
con disploidía descendiente y silenciamiento de
genes de sitios redundantes, principalmente de
ADNr 5S.
Las 11 spp. pertenecientes al subgénero Passiflora estudiadas por Melo & Guerra (2003) fueron
diploides y mostraron 2-3 sitios 18-5,8-26S. A la
vez, en todas las especies que estudiaron, tanto
el número como posición de sitios 18-5,8-26S
detectados por FISH, coincidió con las bandas
CMA+/DAPI- (Melo et al. 2001, Melo & Guerra,
2003) y constricciones secundarias observadas
en los cariotipos. Estos antecedentes concuerdan
con los resultados obtenidos aquí para las 3 spp.
diploides. Por otro lado, P. mooreana presentó diez
loci 18-5,8-26S, también coincidentes con el número
de satélites.
En varios géneros de angiospermas se hallaron
correspondencias entre el número de locus ADNr 5S
y el nivel de ploidía (Moscone et al., 1999; Adams et al., 2000; Taketa et al., 2005). En Passiflora, las
especies diploides estudiadas por Melo & Guerra
(2003) mostraron un par de loci 5S, que coincide con
lo encontrado en P. caerulea, P. tucumanensis y P.
cincinnata. Por otro lado, P. mooreana (tetraploide)
presentó cuatro sitios 5S, número que se corresponde
con su nivel de ploidía. A la vez, los poliploides tienen
una tendencia a reducir los sitios duplicados debido
a mecanismos de diploidización y silenciamiento
génico (Leitch & Bennet, 1997; Levin, 2002). La
presión de selección por reducir el número de sitios
ADNr parece ser menor en los loci 18-5,8-26S, dada
la existencia de mecanismos de homogeneización
inter-loci más eficientes para esta secuencia que para
la ADNr 5S (Cronn et al., 1996). Por este motivo, la
probabilidad de hallar sitios 5S duplicados es mayor
en poliploides infraespecíficos o en neopoliploides
que en paleopoliploides. Estos antecedentes sugieren
que la ploidización de P. mooreana sería de origen
reciente.
Las especies del subgénero Passiflora analizadas
hasta la fecha, incluyendo las de este estudio,
mostraron que los cromosomas portadores de señales
ADNr 5S fueron distintos de aquellos con señales
ADNr 18-5,8-26S. Los patrones de FISH de genes
ribosomales varían en Passiflora principalmente en
referencia al número y distribución de las señales
(Melo et al., 2001; Melo & Guerra, 2003; Souza et al., 2010). A la vez, la variación en el número
de loci ADNr entre angiospermas es atribuida a
rearreglos cromosómicos, eventos de transposición
y silenciamiento génico (Moscone et al., 1999). De
esta manera, mecanismos similares podrían estar
actuando dentro del subgénero.
Passiflora tucumanensis fue estudiada por primera
vez mostrando características comunes con P.
caerulea, sin embargo se diferencian principalmente
en el largo total del genoma haploide (Lt) y la
posición de bandas de heterocromatina y genes
ADNr 18-5,8-26S y 5S. Además, en este trabajo
se encontró una especie tetraploide (P. mooreana)
siendo este hallazgo raro para el género.
Todas las especies aquí analizadas pudieron ser
distinguidas por sus características cariotípicas,
distribución y porcentaje de heterocromatina y
posición y número de loci ADNr. De esta manera,
los hallazgos de este trabajo ponen en evidencia la
importancia de la citogenética, tanto clásica como
molecular, en la tarea de dilucidar las afinidades
sistemáticas de las especies estudiadas, así como
también para establecer tendencias evolutivas dentro
de Passiflora en general.
Agradecimientos
Los autores desean expresar su agradecimiento a Andrea Cocucci por el material otorgado. Este trabajo ha sido financiado con subsidios otorgados por CONICET (PIP- 185) y SECYT- UNC.
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Recibido el 3 de febrero de 2012,
aceptado el 20 de
septiembre de 2012.