GENÉTICA Y EVOLUCIÓN
Análisis cromosómico del híbrido Arachis pintoi x A. repens (Leguminosae) mediante citogenética clásica y molecular
Ornella Pucciariello1, Alejandra M. Ortiz1, 2, Aveliano Fernández1 y Graciela L. Lavia1, 2
1 Laboratorio de Citogenética y Evolución Vegetal, Instituto
de Botánica del Nordeste (UNNE-CONICET), C.C. 209,
3400 Corrientes, Argentina.
2 Facultad de Cs. Exactas y Naturales y Agrimensura
(UNNE), Av. Libertad 5450, 3400 Corrientes, Argentina.
Resumen: El análisis cariotípico fue realizado en las especies parentales Arachis pintoi y A. repens, y el híbrido interespecífico. Las tres entidades presentan la misma fórmula cariotípica (18m+2sm) y un par de cromosomas satelitados. Este par satelitado presenta un par de bandas proximales CMA+ que corresponden a la heterocromatina asociada a NORs, en coincidencia con la localización de loci ADNr 45S. El número de bandas DAPI+ identificadas oscilan entre 3 y 5 pares. El número de sitios ADNr 5S fue variable, con 4 en A. pintoi, 2 en A. repens y un número intermedio de 3 en el híbrido. Los resultados obtenidos demuestran similitudes cromosómicas entre las especies parentales, indicando que constituyen un grupo natural. Por otro lado, las tres entidades mostraron comportamiento meiótico normal, con formación de diez bivalentes (10 II) en metafase I y segregación regular de homólogos en anafase I. Arachis pintoi, A. repens y el híbrido interespecífico presentaron un porcentaje de viabilidad del polen de 97.43%, 99.4% y 97.53%, respectivamente. Nuestros resultados indican que el apareamiento y segregación de cromosomas durante la meiosis y la formación de polen son normales, por lo tanto la falta de producción de semillas no es debido a irregularidades meióticas.
Palabras clave: Arachis; Caulorrhizae; Híbrido interespecífico; Análisis cariotípico; Grupo natural; Irregularidades meióticas.
Summary: Chromosome analysis of the Arachis pintoi x A. repens (Leguminosae) hybrid by classical and molecular cytogenetics. Karyotypic analysis was carried out in the parental species, Arachis pintoi and A. repens, and in the interspecific hybrid. The three entities presented the same karyotype formula (18m+2sm) and one satellited chromosome pair. This satellited pair presented one pair of proximal CMA+ bands which corresponded to heterochromatin associated with NORs, in coincidence with the localization of 45S DNAr loci. The number of identified DAPI+ bands ranged between three and five pairs. The number of 5S DNAr loci was variable, with four in A. pintoi, two in A. repens and an intermediate number of three in the hybrid. The results showed chromosome similarities between parental species, indicating that they constitute a natural group. On the other hand, the three entities presented a normal meiotic behavior, with the formation of ten bivalents (10 II) in metaphase I and regular segregation of homologs in anaphase I. Arachis pintoi, A. repens and the interspecific hybrid presented a percentage for pollen viability of 97.43%, 99.4% and 97.53%, respectively. Our results indicate that the pairing and segregation of chromosomes during meiosis and the pollen formation were normal, and thus that the lack of seed production is not due to meiotic irregularities.
Key words: Arachis; Caulorrhizae; Interspecific hybrid; Karyotypic features; Meiotic behavior; Natural group.
Introducción
El género Arachis L. comprende 80 especies,
todas ellas nativas de América del Sur y distribuidas
en nueve secciones taxonómicas (Krapovickas &
Gregory, 1994; Valls & Simpson, 2005). La sección Caulorrhizae Krapov. & W.C. Greg. incluye sólo
dos especies, nativas de los valles de los ríos Paraná,
San Francisco y Jequitinhonha (Brasil), Arachis
pintoi Krapov. & W.C. Greg. y A. repens Handro,
ambas diploides y estoloníferas.
Arachis pintoi, n.v. maní forrajero perenne,
tiene una alta producción de semillas y persiste en
pasturas consociadas con gramíneas de crecimiento agresivo como Brachiaria y Cynodon. Además,
por su hábito de crecimiento postrado y tolerancia
a la sombra, se considera como alternativa para
la cobertura del suelo y control de la erosión en
cultivos perennes, como el café, los cítricos y la
palma africana (Rincón et al., 1992). Esta especie
fue coleccionada originalmente en Bahia (Brasil), y
se ha distribuido a muchas regiones del Neotrópico
por ser una buena fijadora de N y por adaptarse
bien a suelos ácidos de mediana fertilidad, con alto
contenido de hierro y aluminio y pobres en P y Ca
(Argel & Pizarro, 1992; Pizarro & Rincón, 1994).
Con adecuado sistema de manejo, la producción de
carne por hectárea en pasturas en base a A. pintoi es
mayor que en la mayoría de las forrajeras tropicales
cultivadas en suelos ácidos (Lascano & Thomas,
1988; Lascano & Estrada, 1989). La plasticidad de A. pintoi le permite crecer en diferentes tipos de
suelo, además la característica de producir semilla
bajo tierra le otorga la ventaja de no necesitar
resiembra. Las características mencionadas hacen
de esta forrajera la leguminosa ideal para las
regiones tropicales y subtropicales de América
(Pizarro, 2001).
Por su parte, A. repens, que también posee
atributos como forrajera, presenta resistencia a
algunas enfermedades (Herbert & Stalker, 1981) y
plagas (Stalker & Campbell, 1983), características
que la convierten en un recurso genético muy
interesante para ser utilizado en programas de
mejoramiento que incluyan la transferencia de
genes de interés agronómico.
Por lo expuesto y debido a la carencia de
leguminosas forrajeras adaptadas a los sistemas
pastoriles subtropicales, en los últimos años ha
crecido el interés y se ha puesto mayor énfasis en
la evaluación agronómica y mejoramiento genético
de las especies de la sección Caulorrhizae (Cook &
Crosthwaite, 1994; Valls & Simpson, 1994).
La realización de cruzamientos artificiales,
originando nuevas combinaciones híbridas es de
gran interés para el mejoramiento genético del
maní forrajero, no sólo por la potencialidad de
explorar el vigor híbrido en la generación F1 sino
también por la introducción de características de
interés agrícola. Con ese objetivo se obtuvieron
varias combinaciones híbridas entre A. pintoi y A.
repens (Oliveira & Valls, 2003; Castro et al., 2003),
pero lamentablemente los híbridos obtenidos no
producen semillas (Oliveira & Valls, 2002, 2003).
Hasta el momento no hay evidencias del origen de
la falta de producción de semillas.
La deficiencia en la producción de semillas puede
ser originada, entre otras causas, por irregularidades
meióticas ocurridas en las células madre del grano de
polen por falta de homología entre los genomas. Por
lo tanto, el análisis del comportamiento meiótico de
los mencionados híbridos, determinando el número
y los tipos de asociaciones cromosómicas (uni, bi,
tri, tetravalentes, etc.) y las irregularidades que
se presentan en las células estudiadas, constituye
una valiosa herramienta para la determinación del
origen de la no producción de semillas.
Por otra parte, la determinación del número
y morfología de los cromosomas de las especies
parentales, mediante técnicas de citogenética
clásica y molecular (hibridación con genes
ribosomales por FISH), brinda información
relevante en cuanto a la homología de los genomas.
La localización de genes ribosomales por FISH
en otras especies de Arachis ha incrementado el
número de marcadores cromosómicos permitiendo
establecer las homologías en un mayor número de
pares cromosómicos (Seijo et al., 2004; Ortiz et al.,
2008), particularmente en los citotipos diploide y
triploide de A. pintoi (Lavia et al., 2011).
En este contexto, en el presente trabajo se realizó:
1) la caracterización cromosómica de las especies
parentales y del híbrido mediante citogenética
clásica y molecular con el objetivo de determinar
el grado de homología cromosómica existente entre
las especies parentales y la constitución genómica
del híbrido, y 2) el análisis meiótico del híbrido
interespecífico a fin de aportar información sobre el
origen de la falta de producción de semillas.
Materiales y Métodos
Material. En el banco de germoplasma del
IBONE se mantienen plantas vivas de A. pintoi cv. maní forrajero perenne, derivado de la
población original -BRASIL, BA, IPEAL, Cruz
das Almas, 31-III-1967, Gregory & Krapovickas
12787 (CEN, CTES)-, una accesión de A. repens -BRASIL, MG, Sete Lagoas, 2-V-1961, Gregory et al. 10538 (CEN, LIL)- y el híbrido originado
del cruzamiento artificial entre ambas especies
(Gregory & Gregory, 1979).
Análisis mitóticos. Para la confección de los cariotipos se realizó el aplastado de ápices de
raíces obtenidas de estolones, pretratados
en 8-hidroquinoleína 2mM durante 3h, fijados
en alcohol etílico absoluto:ácido láctico (3:1)
durante 12h a 4 ºC y conservados en etanol 70%
a 4 ºC (Fernández & Krapovickas, 1994). Para
la coloración se siguió la técnica de Feulgen.
Las mediciones de los cromosomas se realizaron
utilizando el programa MicroMeasure 3.3 y la
clasificación de los pares de cromosomas SAT
se realizó sobre la base del tamaño relativo del
satélite y la posición del centrómero (Fernández &
Krapovickas, 1994). A partir de estos resultados se
confeccionó el idiograma para cada una de las tres
entidades en estudio utilizando el programa Corel
Draw versión 12.
Bandeo CMA/DAPI. Los preparados cromosómicos se realizaron siguiendo los mismos pasos que para la hibridación in situ hasta el secado al aire. Se utilizó la técnica de doble tinción con CMA (cromomicina A3) y DAPI (4'-6-diamidino- 2-fenilindol), siguiendo el protocolo descrito por Schweizer (1976) con modificaciones.
Hibridación in situ fluorescente
- Preparados cromosómicos. Se siguieron los
mismos pasos que en el ítem anterior hasta la
fijación. Los meristemas de ápices de raíces
fueron sometidos a digestión enzimática antes
de su aplastado, posteriormente despegados por
congelamiento y secados al aire según Gerber &
Schweizer (1988).
- Sondas de genes ribosomales. Los loci
para las secuencias repetidas ADNr 45S y 5S se
localizaron usando como sonda: pA18S y pA26S,
dos fragmentos de 1573 y 3296pb, respectivamente,
correspondientes a las secuencias de los ARNr 18S
y 26S de A. hypogaea var. fastigiata Waldron; y
pA5S, un fragmento de ~400pb correspondiente
a una unidad repetida del gen ADNr 5S de A.
hypogaea var. fastigiata, incluyendo el espaciador
intergénico adyacente (Robledo & Seijo, 2008).
- Microscopía de fluorescencia y análisis de
imágenes. Las preparaciones cromosómicas
fueron observadas y fotografiadas utilizando un
microscopio Leica DMRX asistido con una cámara
digital Leica DC 350. Las imágenes digitales fueron
posteriormente pseudocoloreadas y combinadas
utilizando los programas Leica Q-FLUO y Leica
IM 1000. El procesamiento final de las mismas se
realizó utilizando el programa Adobe Photoshop
versión 7.0.
Análisis meióticos. Los preparados se realizaron a partir de material fresco o de botones florales fijados en alcohol:ácido acético (3:1) y conservados en alcohol 70%. Para la coloración se utilizó orceína lactopropiónica 2% (Dyer, 1963). Se estudió el comportamiento meiótico de los cromosomas (formación de bivalentes y/o multivalentes, puentes, cromosomas rezagados) en las células madre del polen (CMP). Los datos de comportamiento meiótico de A. pintoi fueron extraídos de Lavia et al. (2011).
Viabilidad de polen. La tinción de granos de polen se realizó con carmín glicerina (Pittenger & Frolik, 1951), en anteras extraídas de flores abiertas. Los granos de polen no teñidos se consideraron inviables.
Resultados
Las características cromosómicas analizadas se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Características cromosómicas de las especies Arachis pintoi, A. repens y el híbrido
interespecífico A. pintoi x A. repens.
Análisis mitóticos. El número cromosómico observado en los tres taxones analizados es 2n=20 (Fig. 1). La fórmula cariotípica determinada es la misma para las tres entidades, la cual está compuesta por 9 pares de cromosomas metacéntricos y un par de cromosomas submetacéntricos (18m+2sm), observándose entre los metacéntricos un par con satélite. En A. pintoi el tamaño cromosómico varió entre 1,68 y 2,34 mm con un promedio de 2,01 mm y los cromosomas SAT (par 6) presentan el satélite de menor longitud que el brazo 1 y el segmento proximal diminuto, por lo que correspondería a un cromosoma SAT tipo 2. Para A. repens se determinó un tamaño de cromosomas de 1,43 a 2,11 mm con un promedio de 1,77 mm y un par de cromosomas SAT (par 3) que corresponden al tipo 3 en el cual el satélite es más o menos igual al brazo 1 más el segmento proximal que es diminuto. El híbrido A. pintoi x A. repens presenta cromosomas cuyo tamaño cromosómico oscila entre 1,55 y 2,41 mm con un promedio por cromosoma de 1,98 mm y, dos cromosomas SAT, uno tipo 2 y otro tipo 3 ambos satélites ubicados en el par cromosómico 3.
Fig. 1 A-C. Cromosomas mitóticos de especies de
la Sección Caulorrhizaeteñidos con Feulgen. A: A. repens: 2n=2x=20. B: A. pintoi: 2n=2x=20. C: A. pintoi x A. repens: 2n=2x=20. Las flechas indican
los satélites. Barra= 5 μm.
Bandeo CMA/DAPI. En las tres entidades se
identificaron entre 3 y 5 pares de bandas DAPI+ en
posición paracentromérica, no pudiéndose determinar
el número exacto en cada una de ellas. En cuanto a las
regiones heterocromáticas CMA+ se identificó un par
en cada una de las entidades analizadas.
Hibridación in situ fluorescente. En cuanto
a los sitios ADNr 45S, todas las entidades
presentan un par ubicado en la región proximal
del cromosoma SAT, y se corresponden con las
regiones heterocromáticas CMA+. El número de
sitios correspondientes a los loci ADNr 5S fue
variable en cada una de las entidades analizadas,
identificándose cuatro en A. pintoi, dos en A. repens y tres en el híbrido interespecífico, siempre en
posición paracentromérica; teniendo en cuenta el
tamaño y la morfología de los cromosomas, y el
tamaño del sitio ADNr 5S, se estima que dos de los
sitios presentes en el híbrido serían aportados por el
parental A. pintoi y un sitio aportado por A. repens.
Comportamiento meiótico. El análisis de
las CMP de A. repens, A. pintoi y el híbrido
interespecífico en metafase I mostró que presentan
comportamiento meiótico normal, con
formación de 10 bivalentes. La segregación de
los cromosomas es regular en anafase I. Sin
embargo, en el híbrido interespecífico se observó
la formación de puentes sin fragmento.
Por otro lado, en las tres entidades se observó el
fenómeno de citomixis en profase, metafase y telofase
de la meiosis I. Como resultado de la transferencia
de material cromosómico, se observan células con
material cromosómico extra y células vacías.
Viabilidad de polen. El porcentaje de granos de
polen viables determinado para A. pintoi, A. repens y el híbrido interespecífico es de 97,43%, 99,4% y
97,53%, respectivamente.
Discusión y Conclusiones
Se confirman los números cromosómicos
de A. pintoi y A. repens, ambas especies son
diploides con número básico x=10 (Fernández
& Krapovickas, 1994; Conagin 1962); y además el número de sitios ribosomales ADNr 45S
y 5S en A. pintoi (Lavia et al., 2011). Por su
parte, el híbrido interespecífico obtenido entre
ambos taxones también ha presentado 2n=2x=20.
Las características cromosómicas observadas en
el híbrido interespecífico tales como: longitud
cromosómica intermedia entre las dos especies
parentales, el par heteromórfico de cromosomas
SAT y el número de sitios de ADNr 5S confirman
su condición de híbrido interespecífico.
Los cromosomas de las tres entidades estudiadas
pertenecen a la categoría de pequeños de acuerdo
a la clasificación de Lima de Faría (1980), ya
que la media por cromosoma varió entre 1,77 y
2,01 μm (Tabla 1). Los cromosomas de los tres
taxones son en su mayoría metacéntricos y sólo
un par lleva satélite, estos resultados están de
acuerdo con la mayoría de las especies de Arachis (Stalker & Dalmacio, 1981; Singh & Moss, 1982;
Cai et al., 1987; Singh et al., 1990; Fernández
& Krapovickas, 1994; Lavia 1998, 2000, 2001;
Lavia et al., 2009).
Una característica cromosómica que constituye un marcador cromosómico básico en muchas especies pero particularmente en el género Arachis, es el tipo de cromosoma SAT (Fernández & Krapovickas, 1994). En el presente trabajo las especies parentales presentaron cromosoma SAT tipo 2 y 3, mientras que en el híbrido se ha observado un par de cromosomas SAT heteromórfico, ya que los miembros del par son diferentes, uno del tipo 2 y otro del tipo 3 (Fig. 2). Por lo tanto, el cromosoma SAT tipo 2 habría sido heredado de A. pintoi, mientras que el tipo 3 de A. repens.
Fig. 2. Idiograma de las especies de la sección Caulorrhizae. A: Arachis repens. B: A. pintoi. C: A. pintoi x A. repens. satélite.
Fig. 3. Cromosomas somáticos teñidos con CMA (A, C y E) y localización de sitios ribosomales ADNr 45S
y 5S mediante hibridación in situ fluorescente (B, D y F). Las señales fluorescentes amarillas corresponden
a regiones CMA+, las señales verdes a sitios ADNr 5S y las señales rojas a sitios ADNr 45S. A-B: Arachis repens. C-D: A. pintoi. E-F: A. pintoi x A. repens. Barra= 5μm.
Los resultados cariotípicos obtenidos por
medio de técnicas convencionales en A. pintoi coinciden con los resultados previos (Fernández &
Krapovickas, 1994; Lavia et al. 2011), en cuanto al
número cromosómico, la fórmula cariotípica y el tipo
de satélite. Sin embargo, se hallaron diferencias en
lo que respecta al tamaño cromosómico -Fernández
& Krapovickas (1994) 2,33 μm, presente trabajo
2,01 μm-, que podrían deberse a la diferente
metodología utilizada para realizar los cariotipos,
ya que los primeros efectuaron las mediciones
sobre cromosomas dibujados con cámara clara y en
el presente trabajo se utilizaron imágenes digitales. Las tres entidades analizadas han presentado
bandas DAPI+ siempre localizadas en la región
paracentromérica del cromosoma, esto permite
establecer un patrón de bandeo para la sección Caulorrhizae -bandas heterocromáticas ricas en AT en
regiones paracentroméricas-. Esta misma localización
ha sido observada por Seijo & Lavia (2004) en A.
pintoi. En este aspecto, a diferencia de lo expuesto
para las especies estoloníferas, las especies de la
sección Arachis presentan bandas pericentroméricas
(Robledo et al., 2009; Robledo & Seijo, 2010).
Las diferencias en la localización de las bandas
heterocromáticas ricas en AT sugiere la existencia
de discrepancias cromosómicas estructurales entre
especies de diferentes secciones. En cuanto a las
bandas CMA+, en los tres taxones éstas coinciden
con los sitios ADNr 45S revelados por FISH, lo cual
sugiere que estos sitios serían ricos en GC.
La posición paracentromérica de los clusters de
ADNr 5S de las especies de la sección Caulorrhizae coincide con los reportes realizados de estos sitios
en posiciones cercanas al centrómero para todas las
especies del género Arachis hasta ahora analizadas
(Seijo et al., 2004; Robledo et al., 2009; Ortiz et
al., 2008). Este patrón de distribución conservado
de los loci ADNr 5S podría ser consecuencia de la
posición cercana al centrómero, por el hecho de que
estas regiones en cromosomas pequeños raramente
sufren rearreglos y que la mayoría de los quiasmas en Arachis ocurren distalmente (Robledo et al., 2009).
Las similitudes encontradas en el análisis
cromosómico realizado, tanto mediante técnicas
de citogenética clásica como de hibridación in
situ fluorescente confirman que las especies de la
sección Caulorrhizae, A. pintoi y A. repens y el
híbrido entre ambas conforman un grupo natural,
como fue propuesto por Krapovickas & Gregory
(1994) quienes las agruparon en la misma sección
en base a caracteres exomorfológicos. Asimismo,
dichas semejanzas cariotípicas permiten establecer
que comparten el mismo tipo genómico y de
acuerdo a la nomenclatura utilizada por Smartt &
Stalker (1982), la fórmula genómica de las tres
entidades sería CC.
Uno de los objetivos de este trabajo fue realizar
el análisis meiótico del híbrido interespecífico a
fin de aportar información sobre el origen de la
falta de producción de semillas. La deficiencia
en la producción de semillas puede ser originada,
entre otras causas, por irregularidades meióticas
ocurridas en las células madre del grano de polen
Diao et al., 2009, 2010). El análisis meiótico del
híbrido interspecífico realizado mostró la formación
de 10 bivalentes en metafase I lo cual constituye una
evidencia de que los genomas de ambos parentales
presentan un alto grado de homología. Por otro
lado, la ocurrencia de irregularidades meióticas
como citomixis y la formación de puentes durante
la segregación cromosómica en metafase I se dan en
frecuencias muy bajas por lo que no contribuirían
significativamente a la esterilidad del híbrido, ya
que el porcentaje de viabilidad del polen es muy
elevado y ambos fenómenos ocurren regularmente
en ambos parentales que tienen elevada fertilidad.
Por lo tanto, el comportamiento regular en meiosis
I y la alta viabilidad del polen indican que la falta
de producción de semillas no tendría su origen en
irregularidades meióticas.
En este sentido, algunos autores proponen que la
falta de producción de semillas en ciertas especies del
género Arachis podría atribuirse a la morfología del
estigma ya que la longitud de los pelos epidérmicos
del mismo evitarían el acceso del grano de polen al
estilo y por ende al ovario (Lu et al., 1990, Oliveira
& Valls, 2003). En consecuencia, el esclarecimiento
de las causas de la falta de producción de semillas
en el híbrido interespecífico no estaría resuelto y es
un objetivo a alcanzar mediante el planteo de nuevas
hipótesis en futuros estudios.
Las especies de la sección Caulorrhizae presentan características que las han ubicado entre
las leguminosas forrajeras más importantes para
las regiones tropicales y subtropicales de América.
Por ello, la información obtenida en este estudio
constituye un invalorable aporte para el diseño
de planes de mejoramiento genético con mayor
eficiencia ya que las hibridaciones y transferencias
génicas son más exitosas entre especies que
presentan genomas semejantes.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo financiero de: Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas -CONICET, PIP 6265-, la Secretaría General de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional del Nordeste -SGCyT UNNE, PI 038-2008- y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica -ANPCyT, PICTO 2007-00099.
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Recibido el 24 de febrero de 2012,
aceptado el 17 de
septiembre de 2012.