MICOLOGIA
Comparación de técnicas para el aislamiento y recuento de levaduras y hongos dimórficos del filoplano de nothofagus pumilio
Mario Muñoz1, Martín Moliné1 y Diego Libkind1,*
Laboratorio de Microbiología Aplicada y Biotecnología, INIBIOMA: Universidad Nacional del Comahue – CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas). Bariloche, Argentina. *email: diego.libkind@gmail.com
Resumen: El floplano es un importante hábitat de microorganismos. Este trabajo tuvo como objetivo probar distintos métodos para el aislamiento de levaduras y hongos dimórfcos del floplano de Nothofagus pumilio, la especie arbórea dominante de Patagonia. Los métodos probados fueron la impresión sobre medio sólido, agitación vertical con agua durante distintos tiempos, con la adición de surfactante (Tween 80) o abrasivos (arena); macerado y ultrasonido. Se estableció un método que combina la agitación vertical con la aplicación de ultrasonido como metodología apropiada para el aislamiento y recuento. Con este método se determinó que la densidad de levaduras y hongos dimórfcos en el floplano de N. pumilio osciló entre las 10 y 103 unidades formadoras de colonias sobre cm2, valores entre 10 y 100 veces inferiores a los observados para otras especies arbóreas. También se estableció al hongo dimórfco Aureobasidium pullulans como la especie dominante de este ambiente.
Palabras clave: Aureobasidium, Alta montaña, Lenga, Levaduras, Patagonia.
Summary: Comparison of techniques for isolation and enumeration of yeast and yeast like fungi from Nothofagus pumilio phylloplane. The phylloplane is an important habitat for microorganisms. This study aimed to test different methods for the isolation of yeasts and dimorphic fungi from the phylloplane of Nothofagus pumilio, the dominant tree species in Patagonia. The tested methods included printing on agar, vertical agitation on water, with the addition of surfactant compounds (Tween 80) or abrasive material (sand), maceration and ultrasound treatment. A method that combines the vertical agitation, with application of ultrasound was established as the most appropriated for the isolation and enumeration. With this method it was determined that the density of yeasts and dimorphic fungi in the phylloplane of N. pumilio ranged between 10 and 103 colony forming units per cm2, values between 10 and 100 times lower than those observed for other tree species. Also, the dimorphic fungi Aureobasidium pullulans was determined as the dominant fungal species in this environment.
Key words: Aureobasidium, High altitudes, Lenga, yeasts, Patagonia.
Introducción
La superfcie de las hojas, también conocida como floplano, constituye la interfase biosfera-atmósfera más grande de nuestro planeta, con un área aproximada de 109 Km2 y representa un importante reservorio de las poblaciones microbianas totales del mundo (Phaff & Starmer, 1987; Kowalchuk et al., 2010). El floplano posee las condiciones necesarias para el desarrollo de diversos tipos de microorganismos, incluyendo levaduras (en sentido amplio: hongos con predominio de fase unicelular) y hongos dimórfcos (aquellos que alternan estadios unicelulares con estadios con hifas o pseudohifas). Distintas especies de levaduras y hongos dimórfcos ftopatógenos, han sido identifcadas y estudiadas en el floplano debido a su impacto económico sobre los cultivos agrícolas (Leben, 1965; Morris, 2001; Damm et al., 2008). Sin embargo, existen pocos estudios que identifquen y/o estudien las características de comunidades naturales de hongos epíftos. En las últimas décadas se ha visto un renovado interés en la biodiversidad de hongos sapróftos, debido a su rol en el ciclado de nutrientes y regulación de los tamaños poblacionales de microorganismos patógenos (Windels & Lindow, 1985; Fokkema, 1991; Andrews, 1992; Lindow & Leveau, 2002).
La principal especie arbórea de los bosques de los Andes es Nothofagus pumilio (lenga), un árbol deciduo de zonas frías y por lo general de altura (Cabrera, 1971; Martinez-Pastur et al., 2000). Tiene hojas caducas, coriáceas y lustrosas de unos 4 cm de largo por 2 de ancho (Dimitri & Milano, 1950). Los bosques de N. pumilio constituyen el 25% y 4% de la superfcie forestal nativa en Argentina y Chile respectivamente, constituyendo uno de los más importantes tipos de bosques en ambos países (Gonzalez et al., 2006).
Esta especie posee una amplia distribución altitudinal y latitudinal, variando desde árboles de unos 30 m al pie de la montaña, a arbustos achaparrados en el límite altitudinal superior, donde soportan cortas estaciones de crecimiento, bajas temperaturas, elevados vientos y gran exposición a la luz solar (Premoli & Mathiasen, 2011).
La mayoría de los estudios de levaduras y hongos dimórfcos del floplano, han sido realizados en Norteamérica y Europa, sobre especies arbóreas con características foliares distintas a las de las especies arbóreas de Patagonia. Por esto resultó necesario para iniciar el estudio de la diversidad fúngica del floplano de N. pumilio, analizar la efcacia de los métodos de aislamiento recomendados por la bibliografía.
Una característica determinante en el método de aislamiento a emplear, es cuan fuerte es la adhesión existente entre las levaduras y hongos dimórfcos a la superfcie de la hoja, la cual es requisito para una exitosa colonización (Andrews & Harris, 2000). En este contexto se plantean como objetivos de este trabajo, la comparación de diferentes técnicas de aislamiento de levaduras y hongos dimórfcos, a fn de permitir el primer análisis de la abundancia fúngica del floplano de N. pumilio y poder establecer la especie dominante en este ambiente.
materiales y métodos
Sitio de muestreo y toma de muestras
El presente estudio fue realizado en el mes de diciembre de 2008, en el cerro Otto (San Carlos de Bariloche, Provincia de Río Negro, Argentina), el cual posee una altura máxima de 1405 msnm, con una precipitación media anual de 800 mm (Conti, 1998). Los muestreos se realizaron a 1340 msnm, donde predominan los bosques de N. pumilio con cubierta discontinua (Puntieri et al., 2001).
Los árboles de los cuales se tomaron las muestras pertenecían a un mismo grupo, localizado en la ladera sur del cerro y se encontraban cubiertos por pisos de vegetación superiores. Se colectaron hojas sanas, utilizando pinzas desinfectadas con alcohol 70% V/V y colectadas en bolsas de polietileno estériles. En el laboratorio se desinfectó la cara abaxial de las hojas, mediante un hisopo con alcohol 70% V/V (estudios previos permitieron la puesta a punto de este trabajo de desinfección, el cual no afecta las levaduras y hongos dimórfcos a cuantifcar). Las hojas fueron distribuidas al azar para la aplicación de los distintos métodos.
Técnicas de aislamiento
Se compararon 6 métodos de aislamiento de levaduras y hongos dimórfcos y se determinó la cantidad de unidades formadoras de colonias por unidad de área de superfcie foliar (UFC/cm2) (Rose, 1975). Para los métodos 2-6 se sembró 100 µl del extracto acuoso en medio MYP agar (Extracto de malta 7 g L-1; extracto de levadura 0,5 g L-1; peptona de soja 2,5 g L-1 y agar 15 g L-1).
1. Aislamiento por impresión de superfcie foliar: se frotó la cara adaxial de cada hoja contra la superfcie del medio de cultivo MYP agar con una espátula de Drigalski. Dicho procedimiento se realizó durante 3, 5 y 10 min utilizando 1 hoja para cada placa y 3 placas para cada tiempo.
2. Aislamiento por agitación vertical: Las hojas fueron colocadas en tubos de ensayo (? = 16 mm) conteniendo volúmenes de 2, 3, 5 y 10 mL de agua destilada estéril. Los distintos tubos se agitaron durante 10 min en agitador vertical, vortex CK-Tech V1-2. El ensayo se realizó por triplicado.
3. Aislamiento por agitación vertical con agente abrasivo (arena): se agregó 2 g de arena lavada estéril a 3 tubos conteniendo 8 hojas en 3 mL de agua destilada. Los tubos se agitaron durante 10 min y se sembraron 3 placas de MYP agar por tubo.
4. Aislamiento por agitación vertical con surfactante (Tween 80): Se prepararon 3 tubos de ensayo conteniendo 4 hojas en 2 mL de una solución de Tween 80 al 0,05% V/V. Los tubos se agitaron durante 10 min y se sembraron 3 placas.
5. Aislamiento por maceración: Los distintos tubos utilizados en los protocolos de agitación vertical y agitación vertical con Tween 80 se mantuvieron durante 24 hs a 5ºC. Transcurrido ese período los tubos se agitaron durante 3 min para homogeneizar la muestra y se procedió a sembrar en medio sólido. Se sembraron 3 placas provenientes de la agitación vertical con agua durante 10 min y 3 de la agitación vertical con Tween 80.
6. Aislamiento por sonicación: 6 tubos, cada uno de los cuales contenía 3 hojas sumergidas en 3mL de agua destilada estéril, fueron agitados verticalmente durante 10 min tras lo cual se procedió a la siembra en placa (MYP agar) de 100 µL, para recuento de unidades formadoras de colonias (UFC). Luego los tubos fueron sonicados de a pares en un baño ultrasónico (Ultrasonik 28X NEY) durante 2 y 10 min. Cada par de tubos, recibió una potencia distinta de sonicación, para el primer par fue de 96 Watts (W), para el segundo de 128W y para el tercero de 160W. La frecuencia de sonicación se mantuvo constante en 45 KHz. A los 2 y 12 minutos de sonicación se sembraron alícuotas del extracto en MYP agar de todos los tubos para recuento de UFC.
Las placas de cultivo fueron incubadas a 20ºC en oscuridad durante 3 a 7 días. Se registró el número de UFC por placa mediante observación con lupa Olympus XZX-90. Las colonias obtenidas fueron clasifcadas por su morfología; color, textura, brillo, tipo de borde, viscosidad y tamaño, en grupos denominados morfotipos (Lebaron et al., 1998).
En una primera instancia se comparó las distintas modalidades de cada método y se seleccionó la que permitió los mayores recuentos de levaduras y hongos dimórficos. Este valor fue utilizado posteriormente para la comparación entre métodos.
Determinación de la superfcie foliar
Las hojas fueron digitalizadas con escáner (HP1410) y la superfcie fue determinada con el software SigmaScan Pro5, esto permitió referenciar el número de UFC registrado a la superfcie foliar utilizada, formato en el que se expresan todos los resultados.
Análisis estadísticos
Se utilizó el análisis estadístico no paramétrico de Kruskal-Wallis, Análisis de variancia en rangos de una vía con un a=0,05 y como test a posteriori, se aplicó el método de comparaciones múltiples de Dunn's. En las comparaciones de dos muestras, se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney Rank Sum. En el caso particular del método 6, se utilizó el test de Wilcoxon para comparar la estimación de densidad antes y después de los procesos de sonicación. Los análisis se realizaron con el software SigmaPlot Versión 11.0.
resultados
Los distintos métodos de aislamiento aplicados en este trabajo, comparados mediante el test de Kruskal-Wallis, mostraron diferencias signifcativas en su capacidad de desprender levaduras y hongos dimórfcos de la superfcie de las hojas (p=0,03). Los resultados más destacados se muestran en la Fig. 1.
Fig. 1: UFC totales/cm2 obtenidas por las distintas técnicas de aislamiento. La potencia del proceso de sonicación fue registrada en Watts (W).
El método de impresión aplicado sobre medio sólido durante 3, 5 y 10 min, produjo 12,35; 14,89 y 12,02 UFC/cm2 respectivamente, no existiendo diferencias significativas entre los 3 tiempos (p=0,76) según el test de Kruskal-Wallis. Se utilizó el mayor valor obtenido mediante este método en la recuperación de levaduras y hongos dimórfcos, es decir 14,89 UFC/cm2 correspondiente a la aplicación de este método durante 5 minutos, para compararlo con los demás métodos. Las comparaciones múltiples de Dunn`s muestran que la impresión fue el menos efectivo para el aislamiento de levaduras y hongos dimórfcos del floplano diferenciándose signifcativamente de la agitación vertical utilizando sólo agua destilada, la que presento valores de de 67,12 ± 34,48 UFC/cm2 (p=0,02), agitación vertical con arena (p=0,003) y de la maceración (p=0,019).
El agregado de arena a la agitación vertical (Método 3) no produjo cambios signifcativos en el recuento de UFC/cm² (p=0,213) según el test de Mann-Whitney. Se obtuvieron recuentos menores a los observados para agitación vertical, con una media de 34,96 ± 1,72 UFC/cm2. La adición de arena a los tubos donde fueron agitadas las hojas, produjo daños en la superfcie de éstas y liberación de clorofla al agua.
El agregado de Tween 80 permitió obtener un recuento absoluto mayor al método de agitación vertical, con un promedio de 96,97 ± 130,35 UFC totales/cm2, sin embargo el aumento observado no fue estadísticamente signifcativo.
El método de maceración no produjo cambios signifcativos en la densidad estimada de levaduras y hongos dimórfcos. Cuando se aplicó maceración a hojas en agua destilada, la densidad estimada aumentó de 67,12 ± 34,48 a 137,14 ± 96,15 UFC/ cm2 (p=0,67) mientras que cuando se aplicó sobre las hojas tratadas con Tween 80, las densidades estimadas disminuyeron de 96,97 ± 130,35 a 64,46 ± 62,35 (p=0,7)
La combinación de agitación vertical con procesos de sonicación a 96, 128 y 160 W durante 2 y 12 min no produjo cambios signifcativos en el promedio de UFC/cm2 según el test de Wilcoxon. Sin embargo la mayor cantidad de UFC y el mayor incremento porcentual con respecto a sólo agitación vertical, se obtuvo con la aplicación de 96W durante 12 min. La aplicación de potencias superiores a 96 W resultó en menores recuentos de levaduras y hongos dimórfcos. A 160 W se puede observar una disminución en la cantidad de levaduras y hongos dimórfcos recuperados, al pasar de 2 min a 12 min de sonicación.
Mediante la aplicación de todas estas técnicas se logró el aislamiento de numerosas colonias, a las cuales fue posible clasifcar en 48 morfotipos. De todos los morfotipos, el más abundante correspondió en sus características al de la especie Aureobasidium pullulans, siguiendo la descripción morfológica de Zalar et al. (2008).
discusión y conclusiones
Efciencia de los métodos de aislamiento
El método tradicional de aislamiento de microorganismos del filoplano, consistente en agitar la muestra, en ocasiones sonicarla y diluir la suspensión resultante (Vinovarova & Babjeva, 1987; Robbs et al., 1989; de Jager et al., 2001; Buck & Burpee, 2002; Fonseca & Inácio, 2006). De los distintos métodos utilizados en este trabajo, la sonicación de 3 hojas a 96 W en volúmenes de 3 mL de agua (3 veces menor al utilizado comúnmente) (de Jager et al., 2001) y con un inóculo de 100 µl sin realizar diluciones decimales (5 a 10 veces mayor al utilizado habitualmente) (de Jager et al., 2001; Inácio et al., 2002; Fonseca & Inácio, 2006), fue el más efectivo para aislar levaduras de N. pumilio. Se propone este método para estudios posteriores que evalúen la diversidad y abundancia de microorganismos en este ambiente.
El método de impresión, permitió obtener un número de levaduras y hongos dimórfcos inferior al alcanzado con las otras técnicas. Este método requirió del empleo de mayor cantidad de tiempo y fueron frecuentes la generación de grietas sobre el medio agarizado, las que difcultaron el crecimiento y el recuento de las unidades formadoras de colonia. Por otra parte se observó que con este protocolo se aisló mayor número de hongos con micelio, los cuales, al poseer una mayor velocidad de crecimiento que las levaduras y hongos dimórfcos, previenen su desarrollo y/o ocultan su presencia. Por estas razones el método de impresión es desaconsejado para la caracterización de levaduras y hongos dimórfcos en medio de cultivo MYP agar.
La adición del surfactante Tween 80, de arena como agente abrasivo y de un periodo de maceración, tampoco permitió aumentar la cantidad de levaduras y hongos dimórfcos aislados y presentaron efectos que podrían resultar negativos. Gunasekera et al., (1997), de Jager et al., (2001) y Deak (2003), incrementaron sus estimaciones de levaduras de floplano al utilizar Tween 80 como surfactante, sin embargo en este trabajo la adición de Tween 80 no produjo cambios. Por otra parte el Tween 80 produjo abundante espuma en los tubos agitados, la cual afectó la homogeneidad de la muestra. El agregado de arena redujo las estimaciones de las densidades de levaduras y hongos dimórfcos sobre las hojas y además produjo daño sobre su superfcie que se observó por la liberación de clorofla al sobrenadante. Las plantas producen y acumulan distintas sustancias antimicrobianas con actividad biológica como alcaloides, cumarinas, fenoles, favonas y taninos (Wagner et al., 1985). Es posible que el daño celular producido con este método haya ocasionado la liberación de compuestos de la hoja que pueden afectar el desarrollo de los hongos en el medio de cultivo lo que permitiría explicar las menores densidades estimadas, observadas en estas condiciones. El método de maceración duplicó la densidad estimada de levaduras y hongos dimórfcos, al ser aplicado sobre hojas con agua destilada. Cuando se aplicó la maceración sobre hojas tratadas con Tween 80 se observó una disminución del 30% en la estimación de levaduras y hongos dimórfcos, es posible que la exposición de estos microorganismos al producto Tween 80 durante 24 hs produzca una disminución de su viabilidad, sin embargo las concentraciones utilizadas en este estudio son consideradas inocuas para este tipo de organismos (Link, 2000).
Fig. 2: Comparación de los distintos tiempos e intensidades de sonicación, como métodos de aislamiento de levaduras y hongos dimórfcos, a partir de hojas de N. pumilio.
Los métodos que combinaron la agitación vertical por 10 min y sonicación a 96W y 128W por otros 12 min, fueron 2 veces más efcientes en la liberación de levaduras y hongos dimórfcos del floplano, con respecto al método de agitación vertical. Es importante destacar que el aumento de potencia produjo menores estimaciones de densidad, lo cual puede ser resultado de una reducción en la viabilidad de las células, ocasionada por el proceso de sonicación. Algunos autores indican que la sonicación de hongos dimórfcos y levaduras, en elevadas intensidades y potencias resulta un método efectivo para ocasionar la lisis celular (Picard et al., 1992; Yeates et al., 1998). Sobre el floplano existen especies pertenecientes a diferentes grupos flogenéticos, las cuales pueden presentar diferentes susceptibilidades al proceso de sonicación. Por esta razón se propone la utilización de un procedimiento con sonicación máxima de 96W durante 12 min, como la estrategia que permite estimar de forma más efectiva, la abundancia de levaduras y hongos dimórfcos, mientras que se sugieren tiempos menores para una mejor estimación de la diversidad.
Determinación de la especie dominante
El análisis de morfotipos, realizado según Zalar et al. (2008) permitió establecer que sobre el floplano de los N. pumilio del cerro Otto, Aureobasidium pullulans es la especie dominante, representando el 60% de los aislamientos (El 40% restante de los aislamientos, será identifcado molecularmente en estudios posteriores). Aureobasidium pullulans es un hongo dimórfco perteneciente a la familia Dothioraceae, dentro del subflum Pezizomycotina, la cual comprende hongos principalmente asociados con plantas (de Hoog, 1997). La inclusión de los hongos dimórfcos como objeto de estudio, resulta importante para una mejor comprensión del ambiente de floplano ya que muchas veces la representatividad de este grupo y en particular de la familia Dothioraceae es subestimada, por su exclusión en la mayoría de los estudios (Inácio et al., 2002; Fonseca & Inácio, 2006). Esta especie ya ha sido citada sobre el floplano de N. antarctica en turberas de la provincia de Tierra del Fuego donde también resultó ser la especie dominante (Searles et al., 2001).
Rol ecológico de la adhesión de las células
En este trabajo se determinó que las levaduras y hongos dimórfcos se encuentran fuertemente adheridos al floplano de N. pumilio y que la fortaleza de esta adhesión es similar entre todas las especies. Por esta razón métodos con distinto nivel de agresividad, recuperaron las mismas proporciones entre los tipos de levaduras y hongos dimórfcos. Si bien la adhesión de las células fúngicas, es requisito para una exitosa colonización del floplano, como para cualquier otra superfcie (Andrews & Harris, 2000), existe una gran controversia acerca de la fortaleza de esta adhesión. Andrews & Buck (2002) determinaron que la unión de las especies adaptadas al ambiente de floplano, resulta principalmente de tipo temporal y que la mayoría de las células pueden ser fácilmente removidas por el lavado de las hojas, por lo cual su habilidad para adherirse no pareciera jugar un rol importante en la colonización de la hoja y si lo haría la capacidad de desprenderse y migrar para una rápida recolonización. Por el contrario numerosos estudios ofrecen evidencia a favor de una fuerte adhesión entre el hongo y el floplano. Una fuerte adhesión, le evita al hongo ser arrastrado por el agua de lluvia o viento (Epstein & Nicholson, 1997). La adhesión entre el hongo y la superfcie de la planta permite al hongo dimórfco o la levadura establecer interacciones químicas que aseguran la compatibilidad. También facilita la interacción química entre la planta y el hongo (Jones & Epstein, 1990) e induce el tigmotropismo y la tigmodiferenciacion (Epstein et al., 1987; Kuo & Hoch, 1996, Chaky et al., 2001). Los resultados obtenidos en este trabajo indican que las levaduras y hongos dimórfcos asociados al floplano de N. pumilio son capaces de adherirse fuertemente. Algunos autores sugieren que esto puede ser una respuesta a las inclemencias climáticas o ser parte de un proceso de reconocimiento entre las levaduras y hongos dimórfcos y la especie arbórea.
Diferencias con otros ambientes de floplano y posibles explicaciones
La densidad de levaduras y hongos dimórfcos determinada sobre el filoplano de N. pumilio mediante el método de aislamiento más efectivo, es hasta dos órdenes de magnitud menor que la registrada por otros autores en otras especies vegetales (Tabla 1). Especies vegetales en condiciones consideradas iguales o más hostiles que la cima del cerro Otto, presentan mayores densidades de levaduras y hongos dimórfcos en sus floplanos. Esto permite pensar que la baja densidad de estos microorganismos podría ser resultado de características intrínsecas de la hoja de N. pumilio. Existen poblaciones bacterianas en hojas de leguminosas y cucurbitáceas que pueden alcanzar densidades de 107 células/cm2, en tanto que en hojas de cítricos y coníferas cultivadas en ambientes similares pueden alcanzar poblaciones máximas de 103 células/cm2 (Lindow et al., 1978; Lindow, 1982). Una de las características intrínsecas de la hoja de N. pumilio pude ser la producción de favonoides particulares de este género, siendo conocido que estos compuestos poseen un rol antimicrobiano (Cushnie & Lamb, 2005). Los favonoides pueden generar adicionalmente una disminución en la herbivoría por parte de insectos (Rousseaux et al., 2004), una de las principales vías de dispersión de levaduras y hongos dimórfcos. También un exudado de nutrientes particular, en la hoja de N. pumilio, puede ser uno de los factores que determinan la baja abundancia de estos microorganismos (Dik et al., 1991; Wilson & Lindow 1994).
Tabla 1: Comparación de la densidad de levaduras y hongos dimórfcos del floplano de N. pumilio con el de otras especies a nivel mundial.
Especie País Cantidad/cm2* |
Género dominante |
Referencias |
|
N. pumilio Malus spp. Gramíneas de estepa Mangifera indica Ananas comosus Agrostis palustris |
Argentina 10-103 Nueva Zelanda 104-105 Rusia 105-106 Sudáfrica 104-105 Brasil 103-104 USA 104-105 |
Aureobasidium Cryptococcus- Rhodotorula Aureobasidium Cryptococcus Cryptococcus- Rhodotorula Cryptococcus |
Presente trabajo Pennycook & Newhook, 1981. Vinovarova & Babjeva, 1987 de Jager et al., 2001. Robbs et al., 1989. Buck & Burpee, 2002. |
*Se compara la densidad de levaduras y hongos dimórfcos sobre la superfcie de toda la hoja, se considero que en N. pumilio la densidad de estos microorganismos es 2.5 veces superior en la cara abaxial (que en este caso fue isopada con etanol 70%) que en la adaxial. Esto se desprende de análisis previos y concuerda con los resultados obtenidos por Pennycook & Newhook, (1981).
Otra explicación para la baja abundancia de levaduras y hongos dimórfcos sobre el floplano del N. pumilio puede originarse en la capacidad de adherencia a la superfcie de las hojas, lo cual en períodos de fuertes vientos y precipitaciones resulta una ventaja, que sin embargo limita la colonización de estos floplanos en el periodo de brotación de las hojas, constituyendo una comunidad con migración limitada (Kinkel et al. 1989; Kinkel 1997; Hughes, 1990). En este sentido Kinkel et al. (1989), determinaron que Aureobasidium pullulans, la especie dominante en este trabajo, posee migración limitada sobre las hojas de manzana y que sus densidades aumentaban en gran medida cuando inoculaba las hojas recién salidas de las yemas.
El presente trabajo sienta las bases metodológicas para el estudio de la superfcie de las hojas en especies pertenecientes al género Nothofagus, ubicadas en Patagonia. Se establece a Aureobasidium pullulans como la especie dominante en este ambiente. Asimismo se plantean nuevos interrogantes sobre el equilibrio existente entre la capacidad de adherirse y dispersarse por parte de las levaduras y hongos dimórfcos del floplano.
Bibliografía
Recibido el 19 de marzo de 2012, aceptado el 28 de septiembre de 2012.