CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES, INGENIERIAS Y TECNOLOGÍAS: INVESTIGACIÓN
Modelos experimentales de anuros para estudiar los efectos de piretroides*
Anuran experimental models to study pyrethroid effects*
María F. Izaguirre**; Liliana Marín; María N. Vergara; Rafael C. Lajmanovich***; Paola Peltzer***; Víctor H. Casco
*) Artículo elaborado en el marco del PID 6053-1: «Desarrollo de Modelos Experimentales
para el Estudio de los Efectos de los Piretroides sobre Vertebrados (Amphibia - Anura)»,
2000-2002, radicado en la Facultad de Ingeniería, UNER, financiado por la Universidad
Nacional de Entre Ríos. Director: Dr. V.H. Casco, vcasco@bioingenieria.edu.ar. Informe
Final aprobado por Res.CS Nº 171/05. Recibido en agosto 2005 y aceptado en marzo
2006.
**) Jefe de Trabajos Prácticos de la Cátedra Biología I, Carrera de Bioingeniería,
Investigadora del Laboratorio de Microscopía, Facultad de Ingeniería, UNER. E-mail:
fizaguirre@yahoo.com.ar
***) Instituto Nacional de Limnología (INALI-CONICET),E-mail: lajmanovich@hotmail.com
Resumen
Los ecosistemas acuáticos están cada vez más expuestos a numerosos contaminantes ambientales, como los agroquímicos. En los últimos años se ha observado que los tests de toxicidad sólo evalúan los efectos a corto plazo (mortalidad) y no son suficientes para evaluar los riesgos de los ecosistemas. Por esta razón, son muy importantes las evaluaciones a largo plazo, ya que permiten estimar la incidencia de estos cambios sobre la biodiversidad y la salud humana. En el presente artículo evaluamos estadísticamente, bajo condiciones de laboratorio, el efecto agudo (mortalidad - supervivencia), las dosis subcrónicas (tasa de crecimiento y desarrollo) y las alteraciones a nivel subcelular e histológico, producidos por el pesticida cipermetrina. Los bioensayos de toxicidad fueron realizados con embriones y larvas de estadios críticos de dos especies regionales de anuros: Physalaemus biligonigerus y Bufo arenarum. Estas especies fueron elegidas debido a su sensibilidad a los biocidas y a su importancia ecológica. Adicionalmente, se realizó un análisis morfológico de los órganos target por microscopía óptica y electrónica, para evaluar el desarrollo de mecanismos adaptativos a las nuevas condiciones desfavorables. Se realizaron en forma complementaria estudios de in situ TUNEL y morfometría.
Palabras clave: Cipermetrina; Anuros; Apoptosis; Histología; Ultraestructura.
Abstract
Aquatic ecosystems are increasingly exposed to numerous environmental contaminants, as agrochemicals. In recent years it has been observed that toxicity tests only span short time effects (mortality) but are not sufficient to evaluate the ecosystems risk. For that reason, long time estimations are very important as reference to estimate the incidence of those changes over the biodiversity and also on human health. In the present report we statistically analyzed, under laboratory conditions, the acute effect (mortality - survival) and subchronic doses (growth rate and development), as well as the alterations at histological and subcellular level produced by the cypermethrin pesticide. Bioassays on toxicity were carried out with embryos and tadpoles of critical stages of two regional anuran species: Physalaemus biligonigerus and Bufo arenarum. These species were chosen due to their biocides sensibility and ecological importance. Additionally, a morphological analysis of the target organs by optic and electron microscopy was carried on, to determine the development of adaptative mechanisms to the new adverse condition. Complementary studies of in situ TUNEL and morphometry were made.
Key words: Cypermethrin; Anurans; Apoptosis; Histology; Ultrastructure.
I. Introducción
Desde el punto de vista económico, el empleo de agroquímicos ha
significado un gran avance para el hombre, ya que con su utilización se han
podido salvar un importante porcentaje de las cosechas que periódicamente
se perdían por la acción de insectos, hongos, malezas, etc. Sin embargo,
en las últimas décadas, el creciente empleo de los mismos en todo el mundo
también significó la incorporación de sustancias xenobióticas a los
ecosistemas (Sugavanam, 1996), es decir, productos no naturales
sintetizados por el hombre, para los cuales, en general, la biota carece de
mecanismos metabólicos para su degradación. Anualmente, la industria
química mundial incorpora al mercado cientos de nuevos productos
sintéticos, por lo que resulta indispensable predecir sus posibles efectos en
los ecosistemas y en la salud humana.
Históricamente, las evaluaciones de riesgo para la biota acuática han
sido realizadas con ensayos de toxicidad, utilizando organismos sensibles
como algunas especies de plancton. En vertebrados, generalmente se han
utilizado como modelos experimentales los peces (Boudou y Ribeyre, 1989),
debido al mayor conocimiento sobre su biología general, fisiología
bioquímica, ecología y etología, en relación con otros vertebrados acuáticos.
En contraste, el estudio de la incidencia de la contaminación en los anfibios,
principalmente por el uso de pesticidas en las proximidades de los cuerpos
de agua en donde éstos se reproducen, es de reciente data y ha sido
encarado fundamentalmente en otros países. Mientras que la declinación en
las poblaciones de anfibios es un fenómeno global (Blaustein y Wake, 1990; Pechmann y col., 1991; Blaustein y col., 1994; Licht, 1996), sus causas
son desconocidas, considerándose la degradación y la polución ambiental
como factores importantes en la explicación del fenómeno. Esta tendencia
decreciente en sus poblaciones se considera altamente perjudi-cial ya que
afecta a los ecosistemas en su conjunto (Bury y col., 1980; Castanet y
Guyetant, 1984; Devillers y Exbrayat, 1992), con el riesgo de acentuar los
fenómenos de su extinción en gran escala (Carey y Bryant, 1995). En nuestro
medio es un tema prácticamente no explorado, a excepción de las
contribuciones realizadas por Salibián (1993), Lajmanovich y col. (1998) e Izaguirre y col. (2000, 2001).
Los anfibios son indicadores altamente sensibles del estrés ambiental, a
causa de su piel permeable y de su ciclo de vida (Schuytema y col., 1993). Es por este motivo que constituyen excelentes modelos experimentales para
evaluar los grados de contaminación ambien-tal y los efectos de los
agroquímicos sobre la tasa de mortalidad, las tasas de desarrollo y
crecimiento y los cambios morfo-estructurales que pueden ocasionarse.
Asimismo, resulta de importancia emplear estos organismos como modelos
de estudio, teniendo en cuenta que en la zona se encuentran especies que
estarían expuestas al riesgo potencial de extinción, a pesar de no figurar en
el Red Data Book International (Chebez, 1994).
En la evaluación de la carga tóxica que pueden soportar los ambientes
acuáticos se han desarrollado protocolos estandarizados por las
organizaciones internacionales de regulación y control como la U. S.
Environment Protection Agency (USEPA), la American Public Health Association
(APHA), la Comunidad Económica Europea (CEE) y la American Society for
Testing and Materials (ASTM), entre otras. Estos protocolos consisten en la
realización de bioensayos de toxicidad aguda y crónica. Adicionalmente,Herkovits y col. (1996) han propuesto a los estadios embrionarios y larvales
de los anfibios para realizar pruebas de toxicidad para el diagnóstico,
protección y monitoreo ambientales con fines de restauración.
El sistema del Valle Aluvial del Río Paraná posee una cuenca de gran
extensión que representa la mayor reserva de agua dulce de nuestro país.
Sus biomas poseen una alta riqueza faunística y florística, como la selva
paranaense y los bosques chaqueños. Este sistema es eje de desarrollo de
los principales centros industriales y agrícolas de Argentina y, en
consecuencia, se halla expuesto constantemente al impacto de contaminantes
del ambiente. Los datos proporcionados por la Dirección de Sanidad Vegetal
del Ministerio de Agricultura y Ganadería de la provincia de Santa Fe
(Argentina) resaltan el importante incremento en el empleo de piretroides, en
virtud de su bajo costo (Bulacio y Panelo, 1999).
La cipermetrina [alfa - ciano - 3 - fenoxibencil - 3 - (2, 2 diclorovinil) 2,
2- dimetilciclopropano carboxilato] es una mezcla racémica de ocho
isómeros. Hay dos grupos de isómeros, los que tienen el anillo ciclopropilo
del diclorovinilo y los grupos éster con orientación cis y los que poseen una
orientación trans. En particular, cipermetrina-α es una mezcla de dos de los
cuatro isómeros cis presentes en aproximadamente 25% de la cipermetrina,
es decir los isómeros (1R, cis)S y (1S, cis)R. Cipermetrina-α contiene más
del 90% del par enantiomérico más activo como insecticida (WHO, 1992).
Se cree que la cipermetrina-a es degradada en el agua tanto por procesos fotoquímicos como biológicos. El agua superficial y sub-superficial
en una charca rociada con 15 g/ha de ingrediente activo contiene de 5 a
19% de la dosis aplicada un día después del rociado, y 0,1% a 2% de la
dosis aplicada siete días después. Aproximadamente el 5% de la dosis
aplicada persiste como sedimento 16 días después de la aplicación (WHO,
1992). También se ha probado que cipermetrina-a se absorbe fuertemente
en las partículas del suelo y que los residuos en él permanecen por debajo
de 0,1 mg / Kg hasta un año después del tratamiento con 0,5 Kg de
ingrediente activo por hectárea (WHO, 1992).
Se sabe que cipermetrina-a es altamente tóxica para invertebrados
acuáticos. Los valores de la concentración efectiva 50 (CE50) (inmovilización)
a las 24 y 48 hs. para Daphnia magna son de 1,0 y 0,3 μg / L,
respectivamente, y a las 24 hs. para Gammarus pulex es de 0,05 μg / L. Así,
cipermetrina-α es altamente tóxico para numerosos taxa de artrópodos
acuáticos, pero posee una menor toxicidad en moluscos. Cipermetrina-a es
altamente tóxica también para peces, con valores de concentración letal 50
(CL50) a las 96 horas postratamiento entre 0,7 - 350 μg/L dependiendo de la
formulación. Las formulaciones emulsificables concentradas son más tóxicas
que las suspensiones concentradas. El peligro de cipermetrina-a en peces e
invertebrados acuáticos reside en su toxicidad aguda. No existen evidencias
de ocurrencia de efectos acumulativos como resultado de exposiciones a
largo término. En los ensayos de laboratorio, su toxicidad para lombrices
de tierra es baja, mientras que para abejas es altamente tóxica. La elevada
toxicidad de la cipermetrina-α para las abejas no se manifiesta en sí misma
en ensayos de campo, probablemente como resultado del efecto repelente
que ejerce este piretroide, causando una disminución en la actividad libadora
de las abejas y, así, en la exposición de estos insectos (WHO, 1992).
En los últimos años se ha observado que las pruebas de toxicidad que
sólo estudian los efectos inmediatos (mortalidad) no son adecuadas en las
evaluaciones de riesgo de los ecosistemas en su conjunto. Por ello, también
se consideran importantes las evaluaciones de las alteraciones a largo plazo,
es decir subcrónicas y crónicas, que sirven de referencia para considerar la
incidencia de estos cambios sobre la biodiversidad y la salud humana. Debido
a estas razones se desarrollaron bioensayos de toxicidad agudos y crónicos
sobre estadios críticos de embriones y larvas de dos especies de anuros, Physalaemus biligonigerus y Bufo arenarum; los cuales por su sensibilidad a
los biocidas (Lajmanovich y col., 1998) tienen importancia ecológica. Además, se efectuó el análisis morfológico a nivel de microscopía fotónica
y electrónica, de los órganos blanco, con el fin de evaluar y conocer el
desarrollo de mecanismos de adaptación a las nuevas condiciones adversas.
Para corroborar los resultados y complementar los estudios se aplicaron
técnicas de in situ TUNEL y morfometría.
II. Materiales y Métodos
Luego de haber determinado que el piretroide cipermetrina-a provoca
una apoptosis masiva, dependiente tanto de la dosis como del tiempo de
exposición, de las células del sistema nervioso central embrionario y larval
de Physalaemus biligonigerus (Izaguirre y col., 2000, 2001), se realizaron
bioensayos de mortalidad en una segunda especie, Bufo arenarum, obtenida
por la inducción a ovoposición en laboratorio, seguida de fertilización in vitro.
Esta estrategia permitió contar con cohortes embrionarias y larvales
homogéneas, de fácil desarrollo en condiciones de laboratorio, en todas las épocas del año, facilitando la realización de un estudio más completo, a la
vez que permitió la profundización de las comprobaciones experimentales.
En esta segunda fase de la investigación se realizó el cálculo morfométrico
del número de células apoptóticas por cerebro y por dosis a las 96 hs. del
bioensayo. Además de las pruebas morfológicas a nivel de microscopía óptica y electrónica, hemos realizado un test de apoptosis aplicando la
técnica de TUNEL. La doble marcación inmunofluorescente de núcleos
normales (DAPI) vs. apoptóticos (fluoresceína) permiten comparar tanto la
especificidad como la magnitud del fenómeno apoptótico disparado por las
diferentes dosis de cipermetrina.
Adicionalmente, el desarrollo de bioensayos subletales permitió tanto
la investigación de efectos producidos a dosis menores a las que provocan
la muerte de los individuos, así como el posible efecto de cipermetrina-a
sobre el desarrollo embrionario.
II.1. Obtención de los especímenes
Los ensayos con Physalaemus biligonigerus se realizaron con nidos de
espuma colectados en una charca temporaria del valle de inundación del
Río Paraná (31° 43´ S; 60° 34´ O, Paraná, Argentina) y se mantuvieron en
condiciones de laboratorio. La eclosión se produjo entre el 5to y 7mo día y
los embriones y larvas obtenidos fueron aclimatados en tanques de vidrio de agua artificial de charca (APW: pH 8,1, conductividad 410 μohms/cm-1,
concentración de oxígeno disuelto 5,5mg/L, dureza 83 mg/L CaCO3), a 22± 2o C por 7 días.
Los ensayos con Bufo arenarum se realizaron con ovocitos obtenidos
de hembras adultas inducidas por inyección intraperitoneal de 2.500 UI de
gonadotrofina coriónica humana (GCh) (Endocorion, Elea, Buenos Aires). Los
embriones fueron obtenidos fertilizando los ovocitos con homogenatos de
tejido testicular e incubándolos en solución Holtfreter (Holtfreter, 1931). Los
embriones se mantuvieron en recipientes de 1.000 mL hasta que alcanzaron
el estadio 20 (Gosner, 1960) y luego se transfirieron a las condiciones
descriptas para el bioensayo. Las larvas fueron aclimatadas en las mismas
condiciones que las de P. biligonigerus.
II.2. Bioensayos
Los ensayos de toxicidad aguda de 96 hs. y subletales en Physalaemus
biligonigerus y Bufo arenarum fueron realizados de acuerdo a los métodos
estandarizados de USEPA (1975, 1989), por triplicado y a una densidad de
10 larvas/L. El producto ensayado fue SHERPA® (Rhone Poulenc), una
formulación comercial que contiene 25% de cipermetrina (CY) en xilol.
II.2.1. Bioensayos de toxicidad aguda durante 96 hs.
Las concentraciones de CY usadas para Physalaemus biligonigerus
(estadios 26 hasta el 36, peso promedio de 0,06 + 0,01 gr) fueron: 375, 750,
1.500, 3.000 y 6.000 μg CY/L, y para Bufo arenarum (estadio 27, peso
promedio de 0,008 + 0,002 gr.): 39, 156, 625, 2.500 y 10.000 μg de CY/L.
Los controles fueron conducidos en APW con o sin vehículo (xilol) durante
los mismos períodos de tiempo. Los tests fueron realizados a 22 ± 2° C y
12 hs luz - 12 hs oscuridad. Las soluciones fueron renovadas diariamente.
En ambos casos, la mortalidad fue registrada a las 24, 48, 72 y 96 hs y
se estimó la concentración letal 50 (CL50) con límites de confianza (p<0,05)
usando un programa de análisis Probit basado en Finney (1971). Los datos
de los grupos experimentales y control fueron analizados mediante un ANOVA
en conjunción con un test LSD (Sokal & Rohlf, 1979).
II.2.2. Bioensayos subletales con P. biligonigerus
Se realizaron respetando las condiciones precedentes, pero las
concentraciones de CY usadas fueron: 12,9; 21,6; 36, 60 y 100 μg CY/ L.
II.3. Evaluación del desarrollo de Bufo arenarum
Previo a la inclusión del material para su estudio histológico y
ultraestructural, los embriones de estadios 18-19 de B. arenarum
provenientes del test subletal fueron fotografiados con un
estereomicroscopio Nikon y evaluados en su desarrollo. Se estimaron
algunos parámetros del desarrollo embrionario como longitud total (desde
la boca hasta el final de la cola) y longitud de la cola (desde la cloaca
hasta el final de la cola). Las mediciones fueron realizadas con un calibre
digital micrométrico (precisión de 0,01 mm). Los resultados fueron
analizados con el test de Kolmogorov-Smirnov y se obtuvieron los
coeficientes de correlación de Bravais-Pearson a diferentes
concentraciones. El análisis estadístico fue realizado con el programa
Statgraphics (1994) con límites de confianza p ≤ 0,05.
II.3.1. Estudios histológicos y ultraestructurales
Larvas tratadas y control, sobrevivientes de los tests agudos y
subletales de toxicidad para Physalaemus biligonigerus y Bufo arenarum
a 24, 48, 72 y 96 hs fueron fijados en solución de glutaraldehído 3%,
formaldehído 3%, solución saturada de ácido pícrico en buffer fosfato
salino 0,1 M pH 7,4 por 4hs, a temperatura ambiente. A continuación de
la fijación, se disecaron bajo lupa estereoscópica el cerebro, la piel y los
ojos. Los tejidos fueron profusamente lavados en PBS, deshidratados en
una serie acetónica de concentraciones crecientes y embebidas en araldita
(Ladd®). Después de la polimerización los diferentes tejidos fueron
seccionados a 0,5 μm de espesor con un ultramicrótomo Reichert Ultracut-S y teñidos con azul de toluidina. Las secciones fueron fotografiadas con
un microscopio Olympus BX-50.
Las secciones de 80 nm de espesor para el análisis por microscopía
electrónica de transmisión fueron realizadas en áreas preseleccionadas de
cada tejido estudiado. Las secciones fueron doblemente teñidas con acetato
de uranilo y citrato de plomo y examinadas con un TEM Phillips 201.
II.3.2. Estudios Morfométricos
Un grupo de larvas de B. arenarum sobrevivientes del test agudo de
toxicidad fueron fijadas en Carnoy (60% etanol, 30% de cloroformo y 10%
de ácido acético glacial) para IHQ, y en formaldehído 4% en tampón fosfato 0,1M pH 7,2 para morfometría; deshidratadas en una serie alcohólica de
concentraciones crecientes, clareadas en xilol e incluidas en parafina
(Cicarelli, San Lorenzo, Sta. Fe, Argentina). Los especímenes fueron
seccionados a 5 μm de espesor en sentido sagital con un micrótomo de
deslizamiento Reichert Hn 40 y montados en portaobjetos tratados con
gelatina 1%, para los estudios de morfometría.
Para estos estudios se utilizaron larvas de Bufo arenarum sobrevivientes
del test de 96 hs (n = 5), por cada concentración bioensayada. Las
secciones fueron clareadas en xilol 100%, rehidratadas en una serie alcohólica
de concentraciones decrecientes y teñidas con hematoxilina-eosina. Luego
fueron deshidratadas y montadas con bálsamo de Canadá. Finalmente, para
la identificación morfológica de las células apoptóticas versus las células
normales, se utilizaron los criterios definidos por Izaguirre y colaboradores
(2000) (Fig. 1). Brevemente, las células se consideraron apoptóticas cuando
exhibían un núcleo condensado y muy picnótico, rodeadas por un halo claro
característico.
Figura 1: Tipos de células que se consideraron apoptóticas en el análisis morfométrico
El recuento de células apoptóticas fue realizado en la totalidad de los
cortes de cerebro, por dos operadores distintos y en forma manual con un
microscopio óptico Leitz a 400X.
Para cada uno de los cerebros se calculó el siguiente índice apoptótico:
Ia = Na / Dc
Donde: Ia: índice apoptótico
Na: Nº total de células apoptóticas
Dc: diámetro cerebral
Cada punto experimental comprende el promedio de 5 animales y fue
expresado como media ± desviación estándar. Estos valores fueron sometidos al análisis de la varianza mediante el test de Kruskal-Wallis
(ANOVA no-paramétrico), utilizando el test de comparaciones múltiples de
Dunn como test a posteriori. Diferencias encontradas a niveles de significación
menores o iguales a 0,05 fueron consideradas estadísticamente significativas.
Adicionalmente, los datos morfométricos fueron transformados (1/x) para
calcular la concentración efectiva 50 (CE50) a las 96 horas de tratamiento. La
concentración efectiva 50 (CE50) fue estimada con un límite de confianza
(p<0,05) usando un programa de análisis probit basado en Finney (1971).
Todos estos análisis fueron procesados con el programa estadístico
(GraphPad Instat Software® 1994 Versión 3.1. Número de Serie: 50533-353).
II.3.3. In situ TUNEL
Un grupo de larvas de Bufo arenarum bioensayadas durante 96 horas,
fijadas en Carnoy, procesadas y seccionadas sagitalmente como se describió precedentemente fueron usadas para corroborar la presencia de células
apoptóticas usando el In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein (Boehringer- Mannheim). Dicho test se basa en la adición a los extremos libres 3'-OH de
los fragmentos de ADN generados durante el proceso de apoptosis, con
nucleótidos modificados -con fluoresceína- catalizada por la enzima terminal
desoxinucleotidil transferasa (TdT).
Las secciones fueron desparafinadas en xilol y rehidratadas usando una
serie alcohólica de concentraciones decrecientes. Luego fueron incubadas
con proteinasa K (20 mg/mL en 10 mM Tris / HCl, pH 7,4 - 8) por 15 - 30
min, a 37ºC. Las secciones fueron irradiadas con microondas (370 W durante
5 min en 200 mL de tampón citrato 0,1M pH 6), lavadas en PBS dos veces
e incubadas a 37ºC durante 60 min y en oscuridad con la mezcla de reacción
TUNEL -preparada de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Posteriormente, las muestras fueron lavadas tres veces en PBS, montados
con Vectashield® Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories,
Burlingame CS, USA) y evaluados con un microscopio de fluorescencia
Olympus. Como controles negativos las secciones fueron incubadas sólo con
la solución de nucleótidos marcados con fluoresceína, sin la enzima terminal
transferasa. Como controles positivos las secciones desparafinadas y
rehidratadas fueron tratadas con DNasa I (100 μg / mL en Tris-HCl 50mM, pH
7,5, MgCl2 1 mM, 1 mg / mL BSA) por 10 min a temperatura ambiente, para
inducir rupturas en las hebras de ADN.
IV. Resultados
IV.1. Bioensayos con Physalaemus biligonigerus
En el rango de 375 a 750 mg CY/L, la mortalidad de las larvas a las 96
hs fue alta y mostró diferencias significativas, comparada con las larvas
control. Desde 1.500 a 3.000 mg CY/L la tasa de supervivencia fue de
aproximadamente el 10%. A las 24 hs todas las larvas tratadas con 6.000 μg
CY/L murieron (Fig. 2).
Figura 2: Curvas de supervivencia de larvas de Physalaemus biligonigerus (izquierda)
y de Bufo arenarum (derecha) expuestas a distintas concentraciones de cipermetrina
La CL50 a las 96 hs fue 7,9 veces menor que a las 24 hs (Tabla 1). Esto significa que se produce un incremento de la toxicidad de la CY conforme se incrementan los tiempos de exposición.
Tabla 1: Toxicidad aguda (CL50) de larvas de Physalaemus biligonigerus y de Bufo
arenarum expuestas a distintas concentraciones de cipermetrina
Las pruebas de subletalidad permitieron verificar síntomas equivalentes
a las fases I y II del comportamiento neurotóxico a cipermetrina. Las larvas
incubadas en concentraciones tan bajas como 12,9 mg CY/L mostraron claros
síntomas de intoxicación. En las pruebas agudas de 96 hs, las larvas En Bufo
arenarum, dentro del rango de 39 a 156 μg CY/L se observó una alta tasa de
mortalidad (30%) a las 96 hs. Estos porcentajes resultaron significativamente
diferentes en comparación con las larvas control (p≤ 0,05). Entre 625 y 2.500μg CY/L, la tasa de supervivencia fue de aproximadamente 15%. A las 24 hs
todas las larvas tratadas con 10.000 g CY/L murieron (Fig. 2). En relación
con el tratamiento de 24 hs, la CL50 fue 6, 13 y 30 veces menor a: 48, 72 y
96 hs, respectivamente (Tabla 1). Por lo tanto, se produce un marcado
incremento de la citotoxicidad conforme aumenta el tiempo de tratamiento.
Dicho incremento tiene un comportamiento prácticamente lineal y es de mayor
magnitud que para P. biligonigerus.
En forma proporcional al incremento de la concentración de cipermetrina,
en ambas especies se pudo verificar síndrome de hiperactividad y
comportamiento aberrante (larvas exhibiendo cola curvada lateralmente,
deformidad en el eje céfalo-caudal y actividad natatoria giratoria).
IV.2. Estudios histológicos y ultraestructurales
En el presente estudio se examinaron a nivel microscópico, secciones
transversales teñidas con azul de toluidina, del cerebro de larvas de Physalaemus biligonigerus (estadios 26-36) y de Bufo arenarum (estadio 27) a nivel del telencéfalo, tanto de animales control como tratados (100, 375,
1.500 y 3.000 mg CY/L para P . biligonigerus; 39, 156, 625 y 2.500 mg CY/L
para B. arenarum) sobrevivientes del test de toxicidad aguda para todos los
tiempos bajo estudio.
Las láminas celulares ventricular, marginal e intermedia del cerebro se
visualizaron diferencialmente afectadas, mostrando arrugamiento volumétrico,
pérdida de las uniones celulares, pérdida evidente del número y organización
celular y aumento de los espacios intercelulares. Figuras apoptóticas típicas
(masas redondeadas u ovales de núcleos y citoplasmas picnóticos) se
verificaron en los cerebros en todas las dosis y tiempos analizados, aunque
se verificó un gradiente dependiente de la dosis y tiempo de exposición al
biocida (Figs. 3a-d). No se observaron cambios en otros tejidos aun a las
dosis más altas (datos no mostrados).
Figura 3: Secciones transversales del telencéfalo de larvas de Physalaemus
biligonigerus teñidas con azul de toluidina (330X). a. Larva control, mostrando las capas
celulares normales: ventricular, intermedia y marginal. b. 100 mg CY/L a las 48 hs. Se observa
incipiente contracción celular y pérdida de uniones intercelulares. c. 100 mg CY/L a las 96
hs. Aumentan la contracción del volumen celular y los espacios intercelulatres con el mayor
tiempo de exposición a CY. Se observan numerosas células apoptóticas y pérdida de
organización de las capas celulares. d. 1.500 mg CY/L a las 48 hs. Observe que el aumento
de la dosis a cortos tiempos de exposición causa neuroalteraciones similares a las mostradas
en c. V: capa ventricular; I: capa intermedia; M: capa marginal; Ap: figura apoptótica.
A nivel ultraestructural, las células cerebrales inmaduras de los animales control poseen las características típicas de las células de los tejidos normales (Fig. 4 a), incluyendo esporádicas figuras apoptóticas. A su vez, en todas las larvas tratadas se pudo verificar un gradiente -dosis y tiempo dependiente- de células apoptóticas, caracterizadas por la formación de ampollas o burbujas en la membrana plasmática y la explosión celular en una serie de cuerpos rodeados de membrana, mientras que las organelas citoplasmáticas permanecen en gran parte intactas (Fig. 4b). El retículo endoplasmático está dilatado y posee una serie de cavidades similares a cráteres donde las cisternas se unen con la superficie celular. La estructura de las mitocondrias y ribosomas es normal a diferencia de lo que ocurre en los procesos necróticos. Como es usual en los procesos apoptóticos, los cambios más significativos ocurren en el núcleo (Figs. 4a-b). La cromatina forma agregados densos bordeando la membrana nuclear, resultando finalmente en núcleos segmentados. La célula se separa en grupos de vesículas limitados por membrana, denominados «cuerpos apoptóticos», los cuales a menudo contienen mitocondrias y otras organelas subcelulares morfológicamente normales (Fig. 4b). También se observaron cuerpos apoptóticos fagocitados por macrófagos u otras células neuronales viables adyacentes (no mostrado). Debido a la preservación de las organelas celulares no se produce liberación del material celular al espacio circundante o bien, ésta es escasa.
Figura 4: Ultraestructura de las células telencefálicas de larvas de Physalaemus
biligonigerus. a. Detalle de células normales y de una célula apoptótica en una larva
control (7.000X). b. Detalle del telencéfalo después de un tratamiento de 96 hs con 100
Tabla 2: Índices apoptóticos en cerebros de larvas de Bufo arenarum tratadas con distintas dosis de cipermetrina
IV. 3. Morfometría
Se encontraron diferencias significativas en el índice apopotótico de los -dosis y tiempo dependiente- de células apoptóticas, caracterizadas
por la formación de ampollas o burbujas en la membrana plasmática y
la explosión celular en una serie de cuerpos rodeados de membrana,
mientras que las organelas citoplasmáticas permanecen en gran parte
intactas (Fig. 4b). El retículo endoplasmático está dilatado y posee una
serie de cavidades similares a cráteres donde las cisternas se unen con la
superficie celular. La estructura de las mitocondrias y ribosomas es normal a diferencia de lo que ocurre en los procesos necróticos. Como es usual
en los procesos apoptóticos, los cambios más significativos ocurren en
el núcleo (Figs. 4a-b). La cromatina forma agregados densos bordeando
la membrana nuclear, resultando finalmente en núcleos segmentados.
La célula se separa en grupos de vesículas limitados por membrana,
denominados «cuerpos apoptóticos», los cuales a menudo contienen
mitocondrias y otras organelas subcelulares morfológicamente normales
(Fig. 4b). También se observaron cuerpos apoptóticos fagocitados por
macrófagos u otras células neuronales viables adyacentes (no mostrado).
Debido a la preservación de las organelas celulares no se produce
liberación del material celular al espacio circundante o bien, ésta es
escasa.
Figura 5: Histograma de los índices apoptóticos en larvas de B. arenarum (Media± DE) control (Xilol). * P<0,05 ** p<0,01.
IV.4. In situ TUNEL
Se observó un incremento significativo del número de núcleos
apoptóticos conforme se incrementaba la dosis de cipermetrina (Figs. 6a-d), corroborando el efecto proapoptótico de CY . La escasez de núcleos
fluorescentes con bajas dosis del piretriode (39 µg CY/L) muestra que los
estadios tempranos de la apoptosis no están acompañados por una
importante fragmentación internucleosomal de ADN. La detección de eventos
apoptóticos sufre un incremento muy importante en los cerebros de los
animales tratados con 2.500 µg CY/L.
Figura 6: In situ TUNEL (a-b) vs. DAPI (c-d) de secciones sagitales de cerebro de
larvas de B. arenarum. a y c. 39 µg CY/L; b y d. 2.500 µg CY/L.
IV.4.1. Influencia de cipermetrina en el desarrollo embrionario
Si bien se detectaron alteraciones morfológicas macroscópicas de los
embriones a partir de 625 mg CY/L - 48 hs (Figs. 7a-h), el efecto parece
ser dosis-dependiente a las 96 hs (Tabla 3). Se observó arqueamiento del
eje corporal, reducción del tamaño del cuerpo y de la cabeza (Figs. 6a-h).
Figura 7: Efectos de la CY en el desarrollo de Bufo arenarum. a. Control de estadio
18 a las 24 hs del bioensayo. b. 156 µg CY/L-24 hs. c. Control de estadio 21 a las 48 hs
del bioensayo. d. 625 µg CY/L-48 hs. e. Control de estadio 25 a las 72 hs del bioensayo.
f. 156 µg CY/L-72 hs. g. Control de estadio 25 a las 96 hs. del bioensayo. h. 625 µg CY/
L-96 hs.
Los embriones mostraron inhibición del desarrollo a las 72 hs de
exposición a CY (Tabla 4). Se encontraron correlaciones significativamente
negativas en los parámetros morfométricos entre los animales control y
los tratados con CY, fundamentalmente a partir de 156 µg CY/L y 72 hs
de exposición.
Los estudios histológicos demostraron la inducción masiva de apoptosis cerebral y de las vesículas oculares (origen neural) a partir de
concentraciones de 625 µg de CY/L y 96 hs de tratamiento con CY (Figs.
8a-b).
Tabla 3: Desarrollo de embriones de Bufo arenarum control y expuestos a CY. St:
estadio de desarrollo (Gosner, 1960). LT: longitud total; LCo: longitud de la cola (media ± DE). Kolmogorov Smirnov (p KS) > 0,05 para valores normales. rs: coeficiente de
correlación de Bravais-Pearson, (ns) = no significativo, * = p < 0,05, ** p < 0,01.
Figura 8: Sección transversal teñida con azul de toluidina, de un embrión de Bufo
arenarum después de 96 hs de tratamiento con 625 µµ µµ µg CY/L (333X). a. Tubo neural
notablemente desorganizado y con numerosas figuras apoptóticas (flechas). b. Detalle
del ojo, mostrando la coexistencia de células viables con células apoptóticas (flechas).
V. Discusión
Los piretroides han incrementado su popularidad para el control de los
insectos en sistemas acuáticos y agrícolas (Smith y Straton, 1986). Entre
ellos, la cipermetrina es un piretroide sintético tipo II altamente activo y
efectivo contra un amplio rango de pestes que afectan la agricultura, la salud
pública y a los animales domésticos (WHO, 1989). Los derivados a-ciano
(tipo II) con el grupo CN en la configuración S del 3-fenoxibencil alcohol
(Ej.: cipermetrina, deltametrina, cihalotrina, fenvalerato, fenpropatrina) tienen el doble de potencia sobre los insectos que los piretros del tipo I (Ej.:
permetrina, alfametrina, bioalletrina).
Aunque se cree que los piretroides son relativamente no tóxicos para
aves y mamíferos, se ha probado que son extremadamente tóxicos para los
organismos acuáticos (Jolly y col. 1978; Smith y Stratton, 1986). En
particular, los peces son altamente sensibles (Holcombe et al., 1982; Eshleman y Murria, 1991; Little y col., 1993). En pruebas de laboratorio
con peces, la CL50 a 96 hs está en el rango de 0,4-2,8 µg CY/L (WHO, 1989).
Sin embargo, la atención alrededor del mundo se ha enfocado en los anfibios
debido a que sus poblaciones se encuentran en franca declinación (Hedges
y col., 1993; Wake, 1991; Donnelly y Crump, 1998). Las posibles razones
de tal proceso incluyen la destrucción del hábitat, los cambios del uso de la
tierra, la radiación ultravioleta, la introducción de competidores no nativos,
la lluvia ácida, la sobrecolección, el cambio climático y los contaminantes
ambientales (Vos y Phillips, 1990; Pounds y Crump, 1994; Berill y col.,
1994). Algunos estudios han demostrado que los anfibios son altamente
sensibles a casi todos los piretroides examinados (Cole y col., 1983;Salibián, 1992; Salibián y Marazzo, 1995; Izaguirre y col., 2000, 2001).
Los piretroides se caracterizan por una actividad insecticida de amplio
espectro basada en su neurotoxicidad (Salibián, 1992; Salibián y Marazzo,
1995). Se cree que actúan interfiriendo la permeabilidad iónica de las
membranas celulares y en la generación y conducción de los impulsos
nerviosos del sistema nervioso central y periférico. En los mamíferos, se ha
probado que actúan sobre el mecanismo de entrada de los iones sodio,
produciendo ralentización del cierre de los canales de sodio (Kaloyanova y
col., 1991). Salibián y Marazzo (1995) notaron que la acción biocida de la
mayoría de los piretroides se basa en la alteración de la conductancia iónica
de la membrana nerviosa. Adicionalmente, Berlin y col. (1984) demostraron
que los tejidos nerviosos incrementan el influjo de sodio transmembrana e
inhiben la ATPasa dependiente de iones en insectos, calamares y sapos.
Los resultados del presente trabajo demuestran que las larvas dePhysalaemus biligonigerus, especie que vive tanto en aguas corrientes como
pantanos temporarios asociados con regiones agrícolas sujetas a aplicación
de pesticidas, resulta un modelo experimental sensible para testear
contaminación ambiental. Sin embargo, a la hora de cuantificar
morfométricamente el grado de afectación, no resultó un buen modelo
experimental por lo que en una segunda fase del estudio se recurrió al uso de otra especie de anfibios, el sapo Bufo arenarum. Este anuro permite la
obtención de especímenes en el laboratorio, a través de la inducción a
ovoposición seguida de fertilización in vitro, lo que genera cohortes
homogéneas en todas las épocas del año, permitiendo así la realización de
un estudio más completo y la profundización de las comprobaciones
experimentales.
El trabajo realizado demuestra que tanto las poblaciones naturales de
larvas de Physalaemus biligonigerus como las de Bufo arenarum obtenidas
por fertilización in vitro serían afectadas por la aplicación de CY, aun en valores
de concentración menores que la correspondiente a la CL50 obtenida en el
laboratorio. Se verificó que las células nerviosas indiferenciadas de las larvas
en desarrollo, son vulnerables a los disturbios ambientales y sufren muerte
celular programada - dosis y tiempo-dependientes. Se probó, además, que
el efecto de cipermetrina es específico para las células nerviosas.
Adicionalmente, se distinguieron las fases de neurotoxicidad típicas de la
intoxicación con CY descriptas por Salibián (1992).
A las 96 hs, la CL50 para larvas de Physalaemus biligonigerus fue de 129
mg CY/L y para Bufo arenarum de 110 μg CY/L, valores mucho mayores que
los hallados para peces. Sin embargo, comparando los límites de confianza
de nuestra prueba aguda y el análisis morfológico de la prueba subletal,
puede inferirse que aún menores concentraciones que las de la CL50 a 96 hs,
pueden causar neuroalteraciones. Nuestro rango de valor estimado fue similar
al de α-cipermetrina (0,7 y 350 μg CY/L, WHO, 1992), dependiendo de las
formulaciones.
Los experimentos de fumigación con CY (Crossland, 1982) a
concentraciones iniciales de 24.000 μg CY/L, demuestran que después de la
primer semana la concentración cae a 50 μg CY/L. Suponiendo una
degradación progresiva, después de 96 hs la concentración en el agua
debería ser de aproximadamente 10.000 μg CY/L. Estos valores son
extremadamente superiores a los usados en el presente bioensayo y a los
obtenidos para las CL50 96 hs en las dos especies bajo estudio. De acuerdo
con Ruzo y col. (1977) la CY es uno de los piretroides tipo II más estables
a la luz. Roberts y Standen (1981) mostraron que las tasas de degradación
de CY observadas tanto en condiciones de laboratorio como de campo no
difieren significativamente.
Los cambios morfológicos observados en el telencéfalo, tanto por
microscopía óptica como electrónica, aparecen como una respuesta aguda a las agresivas dosis de CY. Esta reacción disminuye con la disminución de
cipermetrina y el tiempo de exposición. Principalmente, un fenómeno
apoptótico a nivel neural se observó a concentraciones superiores a 100 µg
CY/L para las dos especies estudiadas. Se ha demostrado en este estudio
que la CY dispara una muerte celular programada masiva, de manera
dependiente de la dosis y el tiempo. Está bien establecido que la muerte
celular programada juega un rol muy importante durante la maduración del
sistema nervioso central (Xiao y Nikodem, 1998). Usualmente el proceso de
apoptosis es contrastado con el de muerte por necrosis, porque este último
a menudo está asociado con muerte celular inducida por toxinas (Wyllie y
col., 1980; Kerr y col., 1987). Basados en nuestros resultados de laboratorio,
concluimos que una simple exposición de las larvas a CY entre 12,9 y 100µg CY/L puede causar efectos subletales en el comportamiento, mientras que
las concentraciones por encima de 100 µg CY/L pueden provocar mortalidad
y una onda apoptótica masiva.
En el presente modelo no se detectaron alteraciones en otros órganos,
concluyendo que el efecto es específico del sistema nervioso.
Si bien este artículo no expone el mecanismo molecular ni el
patofisiológico de la toxicidad de la cipermetrina, sus resultados están en
concordancia con reportes previos. Está bien establecido que la mayoría de
las células realizan y mantienen el balance osmótico a través de la continua
actividad de la bomba de Na+/K+ ~ ATPasa, la cual crea y mantiene un
ambiente intracelular alto en potasio y bajo en sodio. En contraste, el
ambiente extracelular típicamente contiene bajos niveles de potasio y altos
niveles de sodio. A pesar del potencial transmembrana negativo, se establece
un gradiente electroquímico neto que favorece el movimiento pasivo de
potasio fuera de la célula. Probablemente el movimiento de iones de potasio
sea el responsable de la pérdida de volumen celular durante el proceso
apoptótico (Hoffmann, 1986; al-Habori, 1994; Hoffmann y Dunham, 1995).
Debido a que la evidencia disponible indica que la acción de los piretroides
altera principalmente el proceso de transporte de Na+ a través de la
membrana, sugerimos que el efecto de la CY sobre el mecanismo de
transporte iónico puede ser el responsable de la onda apoptótica masiva.
Sin embargo, estudios recientes han postulado la inducción de apoptosis
por los piretroides vía el óxido nítrico, así como por otras especies de oxígeno
reactivo (El-Gohary y col., 1999).
Desde un punto de vista ecológico, aun cuando la sensibilidad de los peces a los piretroides es más alta que en anfibios, el hecho de que las larvas
habiten charcas temporarias podría hacerlas más vulnerables a la cipermetrina
que los habitats lóticos. Por ello, se propone a las larvas de Physalaemus
biligonigerus y de Bufo arenarum como organismos indicadores sensibles para
bioensayos acuáticos de piretroides. A su vez, los estudios realizados con
las larvas de Bufo arenarum permitieron corroborar los resultados obtenidos
con P. biligonigerus (Izaguirre y col., 2000; 2001). Los resultados de la
presente investigación serían los primeros en demostrar un mecanismo de
respuesta apoptótica al efecto tóxico de cipermetrina en larvas de anfibios
anuros. A su vez, permiten establecer que la exposición de embriones de
estadios tempranos (estadio 18) a CY, por arriba de 72 hs, provoca la
inhibición de su desarrollo, un efecto independiente de su neurotoxicidad.
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