CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES: COMUNICACIONES
Microflora de naranja adaptada al frío y su actividad antagónica frente a Penicillium digitatum (Pers.) Sacc
Visintin, Griselda; García, Blanca; Cáceres, Carina; Ludi Barzante, Luciano; Befani, Romina
Autores: Cátedra de Fitopatología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, UNER (Oro Verde, Entre
Ríos, Argentina).
Contacto: gvisintin@fca.uner.edu.ar
Artículo derivado del PID Cód. 2142, Universidad Nacional de Entre Ríos -UNER- (Entre Ríos, Argentina);
ingresado en junio 2013;
admitido en noviembre 2013.
Resumen
Sobre las plantas existen poblaciones de microorganismos donde es posible encontrar antagonistas de patógenos. El presente artículo trata sobre la obtención de microorganismos que habitan la superficie de los cítricos y su preselección como potenciales antagonistas de patógenos poscosecha. Considera además, obtenerlos desde heridas en las frutas y su adaptación a condiciones de almacenamiento en frío. Diez aislamientos fueron evaluados como antagonistas potenciales de Penicillium digitatum (Pers.) Sacc mediante inoculación forzada, registrando su eficacia mediante el porcentaje de heridas que permanecían asintomáticas y calculando el área bajo la curva de progreso de la enfermedad. Las cepas bacterianas S5 y S9 retrasaron 14 días la aparición de síntomas de podredumbres, logrando una eficacia máxima de protección biológica del 47,65%.
Palabras clave: Fitopatología; Biocontrol; Podredumbre; Poscosecha.
Orange microflora adapted to cold and antagonistic activity against Penicillium digitatum (Pers.) Sacc
Abstract
The surface of plants is inhabited by populations of microorganisms in which it is possible to find pathogens antagonists. The present paper deals about the collection of microorganisms that inhabit the surface of citrus and their screening as potential postharvest pathogens antagonists. Protocols obtained in the study also considered microorganisms obtained from wounds in fruits and their adaptation to cold storage conditions. Ten isolates were evaluated as potential antagonists of Penicillium digitatum (Pers.) Sacc by forced inoculation, recording their effectiveness by the percentage of wounds that remained asymptomatic and calculating the area under the curve of disease progression. Under the conditions of this study, strains S5 and S9 delayed 14 days the onset of symptoms of decay, achieving a maximum wounds biological protection efficiency of 47.65%.
Keywords: Plant pathology; Biocontrol; Postharvest rots.
Microflora de laranja adaptada ao frio e sua atividade antagônica contra Penicillium digitatum (Pers.) Sacc
Resumo
Sobre a superfície das plantas existem populações de microrganismos nas que pode-se encontrar antagonistas de patógenos. Este artigo trata da obtenção de microrganismos que habitam a superfície dos citros e sua pré-seleção como potenciais antagonistas de patógenos que atuam em pós-colheita. Os protocolos obtidos no trabalho consideram também a obtenção a partir de ferimentos nas frutas e sua adaptação a condições de armazenamento refrigerado. Dez isolados foram testados como antagonistas potenciais de Penicillium digitatum (Pers.) Sacc por inoculação forçada, registrando sua eficácia mediante a porcentagem de feridas que permaneciam assintomáticas e calculando a área sob a curva de progresso da doença. De acordo com as condições deste trabalho, as cepas bacterianas S5 e S9 retardaram 14 dias a aparição de sintomas de podridão, atingindo no máximo uma eficácia de proteção biológica de ferimentos de 47,65%.
Palavras chave: Fitopatologia; Biocontrole; Podridões pós-colheita; Citros.
I. Introducción
Una de las finalidades primordiales de la aplicación de tratamientos de
poscosecha es el control efectivo de las podredumbres, que limitan la
vida útil de los productos frutihortícolas y reducen considerablemente su
potencial de conservación frigorífica [1]. En los cítricos, la mayoría de las
pérdidas poscosecha de origen infeccioso, producidas durante la globalidad
del proceso de comercialización, son debidas a Penicillium digitatum
(Pers.) Sacc. y P. italicum Wehmer, causantes de las podredumbres verde
y azul respectivamente [1,2,3,4,5]. El control de estas enfermedades
contempla desde normas de cosecha cuidadosa hasta la aplicación de
tratamientos antifúngicos, entre los que se encuentran los fungicidas de
síntesis tradicionales. Como alternativas, existen sustancias naturales o
de síntesis, con efectos residuales sobre el medio ambiente y toxicológicos
sobre personas y animales, conocidos y muy bajos. Por esta razón,
la mayoría de los candidatos ensayados son sustancias presentes en
forma natural en las plantas, microorganismos o aditivos alimentarios [6].
El control biológico de fitoenfermedades considera la utilización controlada
de microorganismos que antagonizan con los patógenos, y una
estrategia para obtener efectivos agentes biocontroladores es hallarlos
en aquellos lugares donde coincidan la planta hospedera, el patógeno
y el ambiente favorable al desarrollo de la enfermedad [7,6]. Si bien
en Argentina es muy escasa la información sobre los microorganismos
que componen la microflora de los cítricos y su forma de interactuar con
los patógenos de poscosecha, la cátedra Fitopatología de la Facultad
de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Entre Ríos
-UNER-, ha realizado investigaciones sobre el tema desde hace diez
años [4]. Estos estudios han incluido la extracción de microorganismos
presentes sobre frutos y hojas de citrus, y su actividad antagónica sobre
Penicillium spp., aunque sin considerar su adaptación a las condiciones
de almacenamiento de frutas en cámaras frigoríficas.
En la naturaleza, las plantas viven en permanente interacción con
poblaciones de microorganismos cuya presencia es constante a pesar
de las oscilaciones de temperatura, vientos, exposición a la luz ultravioleta
o la disponibilidad limitada e intermitente de agua. En dichas poblaciones, existe una interacción continua entre los potenciales
patógenos capaces de producir enfermedad en las plantas y otros
microorganismos cuya acción antagónica evita o disminuye los niveles
de enfermedad [1]. La superficie de hojas y frutas cítricas contiene una
abundante microflora, compuesta principalmente por bacterias y levaduras,
entre las que es posible obtener cepas antagónicas de patógenos
poscosecha. Entre éstos, Penicillium digitatum (Pers.) Sacc penetra e
infecta heridas ocasionadas sobre las frutas, las cuales posteriormente
serán almacenadas en cámaras frigoríficas. Esto nos llevó a suponer, en
primer lugar, que podría obtenerse un biocontrolador de dichas heridas,
que es el ambiente al que está destinado a proteger biológicamente,
y por otro lado, que se requeriría que el mismo estuviera adaptado a
condiciones de almacenamiento en frío [8,2,3,4,5].
Según estas premisas, nuestro objetivo en el trabajo que se expone
fue extraer la microflora de heridas y frutoplano de naranjas y evaluar
su antagonismo potencial frente a P. digitatum.
II. Materiales y métodos
II.1. Extracción de microorganismos
En junio de 2010, se realizó el aislamiento de microorganismos desde
naranjas de la variedad Salustiana. En un lote implantado en la Estación
Experimental Agropecuaria -EEA- Concordia del Intituto Nacional
de Tecnología Agropecuaria -INTA- se realizaron heridas en frutas de
distintas plantas en estado de madurez comercial. Las heridas fueron
circulares, superficiales, de aproximadamente 1x2 mm, y otras más profundas,
de 1x3-4 mm. Las frutas heridas permanecieron en los árboles
durante una semana considerando que sobre ellas podrían desarrollarse
microorganismos benéficos con posibilidad de ser antagónicos de patógenos
poscosecha [7]. Después de 7 días, las frutas fueron cosechadas
y se almacenaron en cámaras de la Sección poscosecha de INTA EEA
Concordia durante 30 días a 5º y 90-95% de HR.
Además, otro grupo de naranjas del mismo lote, cosechadas en
madurez comercial y sin lavar, se almacenaron durante 30 días en las
mismas cámaras y bajo iguales condiciones [7].
Previa adaptación a estas condiciones de almacenamiento en cámaras
frigoríficas, la extracción se efectuó desde la superficie de las
naranjas (frutoplano) y desde heridas provocadas.
II.2. Aislamiento de microorganismos presentes en heridas de frutas,
adaptados a incubación en frío
La extracción de la microflora presente en las heridas se realizó en
laboratorio con base en el siguiente protocolo, readaptado de [4].
1. En las frutas heridas y asintomáticas, localizar las heridas y extraer
una porción de epicarpio y albedo de 0,5 cm de diámetro que las
contenga (n=50).
2. Formar muestras compuestas de 10 secciones. Colocar en erlenmeyer
con 10 mL de solución tampon fosfato peptona.
3. Agitar en agitador orbital durante 30 min. a 300 rpm.
4. Del agua de lavado, previa agitación en vortex, preparar diluciones
decimales.
5. Sembrar alícuotas de 0,1 mL de la suspensión original, D1 y D2,
por duplicado en APG 2%.
6. Incubar las cajas en heladera a 5 ºC durante 15 días.
7. Repicar colonias bacterianas y levaduriformes, y mantener en
heladera a 5ºC.
II.3. Aislamiento de microorganismos presentes en el frutoplano
de naranjas, adaptados a incubación en frío
La extracción de la microflora presente sobre su superficie se realizó
lavando las frutas enteras en bolsas de cierre hermético con 100 ml
de solución tampon fosfato peptona, según el siguiente protocolo readaptado
de [4]:
1. Seleccionar frutas sin heridas visibles y asintomáticas.
2. Colocarlas individualmente en bolsa de cierre hermético, con 100
mL de solución tampon fosfato peptona.
3. Agitar 45 min. a 1200 rpm.
4. Del agua de lavado, preparar diluciones decimales.
5. Sembrar alícuotas de 0,1 mL de la suspensión original, D1 y D2,
por duplicado en APG 2%.
6. Incubar las cajas en heladera a 5 ºC durante 15 días.
7. Repicar colonias bacterianas y levaduriformes, y mantener en
heladera a 5ºC.
La incubación en heladera de las cajas de petri sembradas con las
suspensiones procedentes de frutas y heridas permitió el crecimiento
de distintas colonias diferenciables a simple vista por su morfología
y color. Desde las cajas con las distintas diluciones, se seleccionaron
algunas colonias para mantenerlas en tubos pico de flauta conteniendo
APG 2%, a 5ºC en heladera. Cada aislamiento codificado se observó
microscópicamente, lo que permitió clasificarlo en bacterias o levaduras.
Las estrategias de aislamiento de los microorganismos consideraron
entonces la facultad de colonizar las frutas como epífitos, de crecer en
el sitio de acción (las heridas de las frutas) como biocontroladores y
la capacidad de proliferar en condiciones de almacenamiento a bajas
temperaturas [7].
II.4. Evaluación de antagonismo mediante inoculación forzada de heridas
Después del aislamiento de los microorganismos, y con el objetivo
de preseleccionar algunos de ellos por su capacidad para inhibir las
podredumbres causadas por P. digitatum, se realizaron inoculaciones
forzadas de la mezcla de cada microorganismo y el patógeno. Para
ello, se cosecharon frutas de naranja Valencia Late en lotes de la EEA
Concordia de INTA, y se utilizó la cepa patógena de P. digitatum P160,
resistente al fungicida Imazalil y a la mezcla Imazalil+Tiabendazol. Los
microorganismos evaluados por inoculación de heridas fueron seis
bacterias y cuatro levaduras (Tabla 1).
Tabla 1 . Código, tipo y procedencia de microorganismos
Destinados a inoculación forzada de heridas
Proponiendo una metodología fácil y rápida, se produjeron siete heridas
en la zona ecuatorial de las frutas, considerándose cada una como una
repetición [9]. En seis de ellas, se inoculó cada microorganismo junto al
patógeno, mientras que en la herida control sólo se inoculó el patógeno.
El protocolo de inoculación desarrollado previamente por nuestro equipo
en esta misma línea de investigación [4] fue el siguiente:
1. Lavar las frutas con agua corriente y desinfectarlas por inmersión
en hipoclorito de sodio 5% y alcohol 70º.
2. Dejar secar las frutas.
3. Marcar 7 círculos (6 tratados y un testigo) en la zona ecuatorial
de cada fruta.
4. Destacar uno para herida testigo con una marca especial.
5. En el centro de cada círculo producir una herida de 2x2mm.
6. Preparar 6mL de suspensión mezcla de patógeno y microorganismo:
P. digitatum (2 ml (3x105 con/mL) + 4 mL de suspensión del
microorganismo al 10%T.
7. Testigo: Preparar 6mL de suspensión del patógeno (2 mL (3x105
con/mL) + 4 mL de solución tampon)
8. Inocular las heridas con 10 µL de la suspensión mezcla del microorganismo+
Penicillium.
9. En la herida testigo inocular 10 µL de suspensión de Penicillium
solo (8x104 con/mL)
10. Realizar cuatro repeticiones.
11. Una vez secas las heridas, embolsar individualmente las frutas
en bolsas de cierre hermético creando una cámara húmeda.
12. Incubar en heladera durante 28 días, a 5ºC.
Semanalmente se registró el porcentaje de heridas tratadas con cada
microorganismo que permanecieron asintomáticas, sanas, protegidas
frente a la acción del patógeno, y la incidencia de heridas sintomáticas
como porcentaje de heridas con hidrosis y podredumbre húmeda. A los
28 días desde la inoculación, este porcentaje fue expresado como eficacia
de protección biológica (en %) relativa al testigo según la fórmula:
[(Incidencia enfermas en Testigo - Incidencia enfermas
tratamiento biológico)
/Incidencia enfermas testigo]*100.
Estos registros permitieron detectar los microorganismos de mejor comportamiento
como protectores de heridas y construir curvas de progreso
de la enfermedad (CPE), de los aislamientos considerados promisorios
como antagonistas y de las podredumbres en heridas testigo, en función
del tiempo.
Los valores de incidencia de heridas sintomáticas, expresados en
proporción, fueron transformados a ln (y/(1-y)). Mediante un análisis
de regresión lineal simple (Programa InfoStat) [10] entre los valores
transformados como variable dependiente y el tiempo como variable independiente,
se obtuvieron las ecuaciones de ajuste al modelo Logístico
y las tasas de progreso de la enfermedad (rl). El programa DeriveTM6 trial
edition, version 6.0, Texas Instruments, Inc., permitió calcular las áreas
bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE) como integrales
definidas entre los 7 y los 28 días de tratamiento.
Se realizó un análisis de los tratamientos biológicos de mayor eficacia
respecto al testigo Penicillium considerando: la exploración gráfica de
las CPE, las incidencias finales de enfermedad, las eficacias de protección
biológica, los días libres de enfermedad, las tasas de progreso y
las ABCPE.
III. Resultados y discusión
III.1. Microorganismos aislados desde heridas
De un total de 50 heridas, se obtuvieron 12 aislamientos, de los cuales
10 (83,33%) correspondieron a bacterias y dos (16,66%) a levaduras.
III.2. Microorganismos aislados desde el frutoplano de naranjas
Del procesamiento de 26 naranjas Salustiana, se obtuvieron 33 aislamientos,
de los cuales 20 (60,6%) correspondieron a bacterias y
13 (39,4%) a levaduras. Al igual que los microorganismos obtenidos
desde heridas de frutas, se almacenaron a 5ºC. En ambos casos, el
crecimiento y supervivencia de colonias a 5ºC permite suponer su
adaptación al ambiente de las cámaras de almacenamiento de frutas
una vez cosechadas. Este es uno de los factores considerados centrales
dentro de las investigaciones realizadas con biocontroladores, debido
a que su adaptación a las bajas temperaturas garantizaría mantener
su bioactividad y, por ende, su eficacia antagónica en aplicaciones bajo
condiciones de comercialización externa [7,1,4].
Los ensayos permitieron constatar que la microflora que se adapta
más fácilmente al ambiente de las heridas está constituida por bacterias,
y a la vez fue la que predominó en el frutoplano de naranjas
Salustiana. Sin embargo, en otros estudios se ha podido constatar que
es posible obtener composiciones microbianas diferentes al utilizar otras
especies cítricas, con madurez en distintas épocas del año, y condiciones
ambientales diferentes que pueden influir sobre la constitución y
dinámica poblacional de los microorganismos presentes [2,4].
En principio, esto permitiría considerar a las bacterias como las principales
antagonistas potenciales de patógenos de poscosecha presentes
en heridas, en naranjas cosechadas en Entre Ríos.
III.3. Evaluación de microorganismos por su capacidad para inhibir las podredumbres causadas por Penicillium digitatum
III.3.1. Progreso de heridas asintomáticas en función del tiempo
A los 21 días desde la inoculación forzada, el 80% de los microorganismos
evaluados resultó ineficaz como protector biológico, con valores que
variaron entre 0 y 37,5% de heridas protegidas. Pero se logró detectar
un notable comportamiento diferencial de los tratamientos S5 y S9
como microorganismos protectores. Considerando las heridas testigo,
inoculadas sólo con el patógeno, solamente el 25% se mantuvo como
asintomáticas. En ese momento, la levadura S5 protegía biológicamente
el 66,70% de las heridas, mientras que la bacteria S9 mantuvo 79,17%
de las heridas asintomáticas (Tabla 2, Figura1).
Tabla 2. Porcentaje de heridas asintomáticas protegidas con S5 y S9 respecto al
testigo Penicillium, y eficacia de protección a los 28 días desde la inoculación
Figura 1 . CPE causadas por P.digitatum en heridas de naranjas tratadas biológicamente
con S5 y S9. Diferencias respecto a heridas testigo
A los 28 días desde la inoculación, el porcentaje de heridas asintomáticas
disminuyó a 37,50% en el tratamiento con S5, a 54,20% con
S9, y a 12,50% en el testigo.
La eficacia final de protección biológica de cada tratamiento relativa al
tratamiento testigo fue de 28,57% aplicando la levadura S5 y de 47,65%
aplicando la bacteria S9 (Tabla 2).
La exploración gráfica de las CPE de los tratamientos S5 y S9 respecto
al testigo y en función del tiempo (Fig. 1) muestra, en primer lugar
,el progreso de los síntomas de hidrosis y podredumbres en heridas
testigo sin la protección biológica de antagonistas. Por otro lado, revela
un proceso diferente de la enfermedad al tratar las heridas con S5 y
S9 interactuando con el patógeno. Gráficamente, en este proceso se observa un evidente retraso en el inicio de la incidencia de heridas
sintomáticas, protegiendo las heridas durante los primeros 14 días de
almacenamiento en frío. Esto significaría disponer de 14 días libres de
enfermedad para comercializar las frutas en el mercado. La exploración
muestra, además, que los tratamientos biológicos disminuyen la incidencia
final respecto al testigo, lo que implica, a su vez, la disminución
de las ABCPE.
El tratamiento estadístico y matemático de los datos permitió obtener
las ecuaciones de ajuste al modelo logístico para cada tratamiento, las
tasas rL, los coeficientes R2 y las funciones (y) resueltas, para la incidencia
de heridas sintomáticas (Tabla 2).
Tabla 2. Ajuste de las CPE de los tratamientos Testigo, S5 y S9 al Modelo Logístico,
Coeficientes R2, tasas rL y funciones obtenidas
Referencias:
y: Incidencia de heridas sintomáticas; función matemática obtenida
(1-y): deriva de logit: Ln(y/(1-y))
t: tiempo
R2:
Coeficiente de ajuste al modelo logístico
rL: tasa de infección según el modelo logístico
El ajuste al modelo logístico permitió obtener las tasas de progreso de la
enfermedad (rL) desde los 7 a los 28 días. Los resultados muestran que,
en las heridas tratadas biológicamente, las velocidades de progreso de
las podredumbres (0,46 para S5 y 0,45 para S9) en promedio, fueron
1,75 veces mayores que en las heridas testigo (0,26), donde el patógeno
ejercía su patogenicidad sin interactuar con otros microorganismos.
Cabe destacar que S9 y S5 fueron totalmente eficaces protegiendo las
heridas durante los primeros 14 días de tratamiento en los que interactuaban
con la población del patógeno. Durante esos 14 días, las
tasas de progreso fueron nulas, y recién desde allí prácticamente se
duplicaron respecto a las del testigo.
La técnica de inoculación realizada implicó provocar heridas y, de
este modo, la liberación de aceites esenciales y ácidos, sustancias
favorables para la germinación y colonización del patógeno en ellas.
Por otro lado, consideró la penetración de una elevada concentración
de propágalos del patógeno (3x104con/mL) y el mantenimiento de un
ambiente húmedo. Estas características nos permiten considerarla
como una técnica de inoculación agresiva, ante la cual se rescata
la importancia de poder contar con dos semanas para comercializar
frutas sanas [11].
La aplicación de integrales definidas entre los 7 y 28 días para cada
una de las funciones y obtenidas permitió calcular las ABCPE para S5
y S9 y sus diferencias porcentuales respecto al tratamiento testigo
(Tabla 3).
Tabla 3. Áreas bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE) aplicando dos
antagonistas protectores de heridas y su diferencia porcentual respecto al testigo
El cálculo de las ABCPE permitió constatar que ambos tratamientos biológicos disminuyeron la incidencia acumulada de la enfermedad en el tiempo respecto al testigo Penicillium. Aplicando la levadura S5, el ABCPE representó 27,48% del área del testigo, mientras que la obtenida con S9 fue del 20,69% respecto al testigo (Tabla 3, Figura 2).
Figura 2. Áreas bajo la curva de progreso de la enfermedad de dos antagonistas
protectores de heridas (S5 y S9) respecto al área testigo P. digitatum
El efecto protector de los tratamientos biológicos se constató, además,
a través de la disminución de la incidencia final de heridas sintomáticas
a los 28 días. No obstante, considerando que una cepa eficaz debería
proteger el 85-90% de las heridas en aplicaciones comerciales, las
eficacias logradas incorporando S5 (28,57%) y S9 (47,65%) están muy
alejadas de esos valores [8,2,5].
La verificación del retraso en el inicio de las infecciones justifica la
elección de esta táctica de manejo como una estrategia para disminuir
o retrasar la actividad del inóculo primario de esta enfermedad y
la duración total de la epifitia [11]. Considerando, entonces, los días
libres de enfermedad, la disminución porcentual del ABCPE respecto
al testigo, y de las incidencias finales de heridas con podredumbre,
ambos microorganismos podrían ser considerados como antagonistas
promisorios para ser utilizados en mezclas entre ellos y/o con otros
microorganismos, estimando la posibilidad de lograr una bioactividad
sinérgica o complementaria en el control de Penicillium digitatum.
En función de considerar las incidencias de enfermedad acumuladas
en función del tiempo, bajo las condiciones de este ensayo, S9 fue
el microorganismo de mayor eficacia protectora logrando reducir un
79,31% el ABCPE del testigo (Tabla 3).
IV. Conclusiones
La superficie de las frutas cítricas contiene una abundante microflora, compuesta principalmente por bacterias y levaduras entre las que es posible obtener cepas de antagonismo variable frente a patógenos de poscosecha. Bajo las condiciones de este trabajo, las cepas S5 y S9 retrasaron 14 días la aparición de síntomas de podredumbres, logrando como máximo una eficacia de protección biológica de heridas del 47,65%.
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