Anticuerpos Anti-F2/3 como marcador de curación en niños con infección congénita por trypanosoma cruzi
J. Altcheh1, R. Corral2, M. A. Biancardi, H. Freilij1
Laboratorio de Parasitología y Chagas y Laboratorio de Virología, Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez, Buenos Aires.
1 Miembros
de la Carrera de Investigador Científico del Gobierno de la Ciudad
de Buenos Aires.
2 Miembro
de la Carrera de Investigador Científico del CONICET (Consejo Nacional
de Investigaciones Científicas y Técnicas)
Dirección postal: Dr. Jaime Altcheh, Laboratorio de Parasitología y Chagas, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Gallo 1330, 1425, Buenos Aires, Argentina. E-mail: jaltcheh@intramed.net.ar
Resumen
La fracción
antigénica F2/3 de tripomastigotes contiene epitopes detectables por
anticuerpos representativos de infección activa. Después del tratamiento con
benznidazol, se comparó la cinética de negativización de la serología
convencional (SC) y de los anticuerpos anti-F2/3 en 21 pacientes con Chagas
congénito. Los pacientes se dividieron en 2 grupos: A) Edad < de 8 meses al
diagnóstico; B) Edad > de 9 meses al diagnóstico; el grupo A negativizó la
SC a los 6.6 m (IC95 3.4-9.8 m) y anti-F2/3 a los 4 m (IC950.9-7.1
m) p = 0.18. El grupo B negativizó la SC a los 63.1 m (IC95
42.1-84.2 m) y anti-F2/3 a los 21.9 m (IC95 5.7-38.1 m) p = 0.0025.
El grupo A presentó una temprana negativización tanto de la SC como de los
anti-F2/3. En el grupo B la negativización de los anti-F2/3 anticipó
significativamente a la SC. La negativización de los anticuerpos anti-F2/3 es
un marcador temprano de curación, particularmente en pacientes con mayor tiempo de infección.
Palabras claves: Chagas congénito; Tratamiento; Curación; Anticuerpos anti-F2/3; Serología; Glicoconjugados.
Abstract
Anti-F2/3
serum antibodies as cure marker in children with congenital Trypanosoma
cruzi infection. The
F2/3 antigenic fraction isolated from Trypanosoma
cruzi trypomastigotes contains epitopes recognised by antibodies which are
representative of active infection. The kinetics of disappearance of
conventional serology (CS) and anti-F2/3 antibodies were compared in 21
patients with congenital Chagas´disease after receiving benznidazole treatment.
Patients were divided into 2 groups: (A) Age < 8 months at diagnosis; (B)
Age > 9 months at diagnosis. Group A presented negative outcome for CS at
6.6 mo. (CI95 3.4-9.8 mo.) and for anti-F2/3 at 4 mo. (CI95
0.9-7.1 mo.), p = 0.18. Group B exhibited non-reactive CS at 63.1 mo. (CI95
42.1-84.2 mo.) whereas anti-F2/3 antibody determination became negative at 21.9
mo. (CI95 5.7-38.1 mo.), p = 0.0025. In patients belonging to group
A, antibodies were undetectable by both CS and anti-F2/3 ELISA soon after
receiving chemotherapy. In infants included into group B, a negative result for
anti-F2/3 antibody detection significantly anticipated the disappearance of CS
reactivity. Consequently, an anti-F2/3 antibody assay becoming negative should
be considered as an early marker for assessment of cure, particularly in those
patients with prolonged time of infection.
Key words: Congenital Chagas’ disease; Chemotherapy; Cure; Mucin-like glycoconjugates; Anti-F2/3 serum antibodies; Serology.
La enfermedad de Chagas
ha cambiado su perfil epidemiológico a partir de la disminución de la transmisión
vectorial1 y
de fenómenos de migración de individuos infectados a las grandes ciudades. Esto
determina que en la ciudad de Buenos Aires se generen casos autóctonos por la
adquisición del Trypanosoma cruzi por transfusión, por vía
transplacentaria2 o por transplante de órganos.
Distintos trabajos muestran que entre el 2 y el 7% de los niños nacidos de
madres infectadas adquieren el parásito durante el embarazo. El estudio
sistemático para la detección del Chagas congénito es particularmente
importante porque hemos demostrado la curación de más del 97% de los niños
tratados en los primeros meses de vida2.
El criterio
actual de curación es
la negativización postratamiento de la serología convencional (SC), esto
significa que el individuo tratado no posee parásitos ni restos antigénicos que
estimulen el sistema inmune. El momento en que se negativiza la SC está
relacionado directamente con el tiempo de evolución de la infección previa al
tratamiento. Los niños en la fase aguda (vectorial o transplacentaria),
negativizan la SC entre los 2 y 12 meses postratamiento3,
especialmente en la infección congénita4.
En el período indeterminado se suele negativizar varios años después de finalizada la
medicación5. La
persistencia de la SC reactiva en los pacientes tratados y curados podría deberse a la estimulación
del sistema inmune por anticuerpos anti-idiotipo generados por el T. cruzi y/o
por antígenos en
común entre el protozoario y agentes saprófitos6.
En los últimos años se demostró que
los anticuerpos líticos (AL) evaluados mediante la lisis mediada por
complemento (LMCo) están asociados a la presencia del estadio tripomastigote
del T. cruzi 7,
8. Un grupo de investigadores de Brasil observó
en pacientes tratados en el período indeterminado que después de 10 años de
seguimiento presentaban estudios parasitológicos reiteradamente negativos,
negativización de la LMCo y persistencia de la SC reactiva7.
A partir de estas observaciones se propuso a la desaparición de los AL como un nuevo
marcador de curación9.
Los AL pueden
evidenciarse también
por técnicas inmunoenzimáticas utilizando antígenos del
estadio tripomastigote (F2/38, ESAg, GPs 160, 75/90, T-DAF y 57/51)10.
Estas técnicas presentan menor complejidad y menor costo que la LMCo.
La fracción antigénica
F2/38 está
constituida por glico-conjugados, anclados a la membrana por
glicofosfati-dilinositol, con características de mucinas: - alto contenido de
aminoácidos hidrofílicos (T, S, K, G), - ácido siálico, y - oligosacáridos con
unión O-glicosídica a la proteína. Estos oligosacáridos representan el 60% de
la masa de esta glicoproteína del T. cruzi y son ricos en residuos
a-galactopiranosil11.
El objetivo
del presente trabajo es evaluar la cinética de los anticuerpos anti-F2/3 en pacientes con Chagas
congénito curados.
Criterios de infección: a) paciente
menor de 6 meses con parasitemia presente por técnica de microhematocrito, b)
paciente mayor de 6 meses con SC reactiva al menos por 2 de las siguientes
técnicas: hemaglutinación indirecta (Polychaco), ELISA (Wiener)
y aglutinación de partículas (Bayer). La vía congénita se definió si el
paciente no recibió transfusiones de sangre, no concurrió a área endémica
y la madre presentaba SC reactiva.
Se estudiaron 156 sueros de 21
pacientes con infección congénita por T. cruzi, que concurrieron
al Laboratorio de Parasitología y Chagas del Hospital de Niños
Ricardo Gutiérrez para su
diagnóstico y tratamiento (edad media al diagnóstico: 2 años
y 7 meses, rango: 15 días-10 años).
Todos ellos completaron el
tratamiento (benznidazol (RADANIL®, Roche),
5-8 mg/kg/día en 2-3 dosis diarias por 60 días) y negativizaron
la SC en distintos lapsos postratamiento.
Como controles
se incluyeron 20 niños no infectados nacidos de madres con enfermedad de Chagas y 20 niños
con otras parasitosis tisulares (toxoplasmosis, malaria, toxocariasis,
leishmaniasis)
Se determinaron los niveles de
anticuerpos séricos contra T. cruzi por SC y anti-F2/3 a partir
de las muestras almacenadas a -20 °C obtenidas al inicio, a los 30 días, al fin del
tratamiento y luego cada 3 a 6 meses, con un seguimiento promedio de 75 meses
(rango: 24-156 meses) hasta la negativización de la SC en dos muestras
sucesivas.
Para la obtención del antígeno F2/3
se cultivaron tripomastigotes de la cepa RA en células Vero y se purificaron
por pasaje a través de una columna de DEAE-Sepharose (Pharmacia)12.
La obtención y purificación de las
fracciones antigénicas F2 (74-96 kDa) y F3 (120-200 kDa) se muestra en
la Figura 1(adaptado de Almeida IC et al; 199411).
Los eluatos obtenidos con propanol 20-25% contenían los antígenos
F2/38, 11.
ELISA de quimioluminiscencia13 (ELISA-CL):
Se utilizaron 2 ng de la fracción F 2/3, para sensibilizar los
pocillos de microplacas de poliestireno opaco (Nunc). Las muestras se
utilizaron a una dilución de 1:2000. Se emplearon controles positivos
y negativos para anti-F2/3 provistos gentilmente por el Dr. IC. Almeida,
(Universidad de San Pablo, Brasil). Se utilizaron como conjugado anticuerpos
contra IgG humana biotinilados (1:2000) (Amersham) y estreptavidina
marcada con fosfatasa alcalina (1:2000) (Gibco-BRL) y como sustrato
Lumiphos-530 (1:10) (Gibco-BRL). Para evitar depender de un luminómetro,
se expusieron las placas por 30 segundos a película Kodak TMAT-S en un ambiente
oscuro. Se reveló con soluciones estándar para películas radiográficas y se
determinó la densitometría a 492 nm en un lector de ELISA (Labsystems).
Se realizó el
test t de Student para dos grupos no apareados utilizando GraphPad InStat 3.00,
San Diego California USA, 1992-1998. El nivel de significación estadística fue de p <
0.05. Todos los pacientes con Chagas congénito presentaron SC y anti-F2/3
positivos al diagnóstico y los controles estudiados presentaron ambos
resultados negativos.
Se dividieron los pacientes en 2
grupos: A) Edad < de 8 meses al diagnóstico, B) Edad > de 9 meses al
diagnóstico. Se compararon las cinéticas de desaparición de los anticuerpos detectados
por SC vs. los anticuerpos anti-F2/3. El grupo A (n:
8, edad media: 2.8 meses, rango: 15 d-8 m); presentó una media de
negativización de la SC de 6.6 m (IC95: 3,4-9.8)
y de 4 m (IC95: 0.9-7.1) para los anticuerpos anti-F2/3, P= 0.18, Figura 2-A.
En el grupo B (n: 13, edad media: 49 m, rango 9-120 m), presentó una media de negativización
de la SC de 63,1 m (IC95: 42.1-84.2 m) y de 21.9 m (IC95: 5.7-38.1
m) para los anticuerpos anti-F2/3, P=0,0025, Figura 2-B.
Con el fin de acortar el
período
para definir curación se están desarrollando técnicas para detectar anticuerpos
que reconozcan solo al tripomastigote a diferencia de la SC que emplea el
parásito entero o un lisado del estadio epimastigote.
Son escasos hasta el presente los
trabajos realizados con pacientes tratados empleando estos marcadores. Los
primeros en evaluarse fueron los mismos AL mediante la LMCo6.
Un estudio de seguimiento durante 3 años postratamiento utilizando el mismo
antígeno que el empleado en este trabajo, fue realizado en Brasil en niños de 7
a 12 años de edad. Los autores observaron la negativización de los anticuerpos
anti-F2/3 en el 58% de los niños y una caída significativa de los títulos
de anticuerpos de la SC14.
Un trabajo realizado
en Argentina en niños de 6 a 12 años, evaluó al cabo de 2 años la respuesta terapéutica
empleando un antígeno recombinante perteneciente al flagelo (F29). El resultado
mostró que el 62.1% de los pacientes negativizaron los anticuerpos anti-F29
y el 11.3% la SC15.
Estos ensayos
demostraron la negativización de anticuerpos contra antígenos no convencionales en parte de
los pacientes, pero no pudieron ser validados como marcador de curación, pues
la mayor parte de los pacientes mantenían la SC reactiva.
En cambio, esta es la primera
experiencia en la que se demostró con certeza que los anticuerpos contra
F2/3 son marcadores precoces de curación dado que todos los pacientes
negativizaron la SC.
En conclusión, nuestro trabajo
demuestra que la negativización de los anticuerpos anti-F2/3 es un marcador
temprano de curación, particularmente en aquellos que tienen mayor tiempo
de infección. En los pacientes menores de 8 meses de edad esta diferencia
no fue significativa. No hemos encontrado trabajos previos que utilicen esta
metodología en paciente congénito, con Chagas, seguidos fuera de área
endémica,
lo que excluye la posibilidad de reinfección.
La Organización Mundial de la Salud
sugirió el tratamiento a todos los individuos con enfermedad de Chagas,
independientemente del estadio de la infección3.
Una de las dificultades de la evaluación del tratamiento en pacientes con muchos años
de infección es el largo tiempo que se debe esperar para asegurar la curación.
Contar con estos marcadores sería una herramienta esencial que alentaría el
empleo de la medicación en la fase indeterminada y crónica de la infección.
Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado con un subsidio de la Fundación Alberto J. Roemmers.
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Recibido: 28 de
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