Estudio del protooncogen Ret en neoplasia endocrina
multiple 2A y en carcinoma medular de tiroides familiar.
Hallazgos clínico-patológicos en
portadores asintomáticos
S. Belli1, 2, M. E. Storani3, R. J. Dourisboure1, E. J. Podestá4, A. R. Solano1, 4
1 Instituto
Alexander Fleming;
2 División de Endocrinología-Hospital
Durand;
3Servicio de Endocrinología, Hospital de San Isidro;
4 Laboratorio
HRDC, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de
Buenos Aires
Dirección Postal: Dra. Angela R. Solano, Laboratorio HRDC, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UBA, Paraguay 2155, 1121 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 4508-3672. E-mail: asolano@ciudad.com.ar
Resumen
El 25% de los
carcinomas medulares de tiroides son hereditarios. Se presentan en forma de
familiar (CMTF 5%) o como neoplasia endocrina múltiple (MEN) tipo 2A (17%) o 2B
(3%), y comparten la herencia,
autosómica dominante, de una mutación germinal
en el protooncogen RET en uno de 12 codones conocidos. Estudiamos 7
familias (5 CMTF y 2 MEN 2A) con el objeto de detectar la mutación familiar e
identificar a los portadores asintomáticos. Seis de las siete mutaciones (4
CMTF y 2 MEN 2A) fueron en el codón más frecuente, el 634, y una familia con
CMTF presentó una mutación germinal novel: una transición T>C en el
codón 630, resultando el cambio C630A. De los 57 individuos estudiados, 25
(43.85 %) fueron portadores de la mutación, 7 de éstos (28%) eran portadores
asintomáticos de los cuales 5 eran niños, con una edad X–=11±3.2 años y fueron
tiroidectomizados. Presentaron hiperplasia de células C y focos de
microcarcinoma en ambos lóbulos tiroideos aun cuando la calcitonina basal o
estimulada con pentagastrina fueron normales. En conclusión, describimos una
mutación germinal novel en el protooncogen RET: C630A y el hallazgo
de enfermedad de la célula C en los portadores asintomáticos, que enfatiza la
importancia de la tiroidectomía profiláctica tan
pronto como se confirma el diagnóstico molecular.
Palabras clave: Neoplasia endocrina múltiple tipo 2A; MEN 2ª; Protooncogen RET; Carcinoma medular de tiroides familiar.
Abstract
Analysis
of the RET protooncogene in multiple endocrine neoplasia 2A and in familial
medullary thyroid carcinoma. Clinical-pathological findings in asymptomatic
carriers. Twenty
five percent of the medullary thyroid carcinoma (MTC) is hereditary and 5% is
familiar (FMTC), or considered as multiple endocrine neoplasia (MEN) type 2A
(17%) or 2B (3%). These diseases are the result of the autosomic dominant inheritance
of a mutation in the RET protooncogene, in one out of 12 different known codons.
We analyzed 7 families (2 MEN 2A and 5 FMTC). Six mutations were detected in
the most frequent codon, 634 (2 MEN 2A y 4 FMTC) and one family with FMTC presented
a novel mutation: a transition T>C at codon 630, resulting a C630A change. Among 57
individuals studied, 25 (43.85%) presented the mutation. Seven (28%) were
asymptomatic carriers, including 5 children aged 11±3.2 years. The children
underwent total thyroidectomy. The histopathologic examination showed C cells
hyperplasia and microcarcinoma focus in both lobes, even in the presence of normal,
basal or pentagastrine stimulated, calcitonine levels. In conclusion, we describe
a germline novel
mutation in the RET protooncogene: C630A; and the corresponding findings of
C-cell disease in gene mutated carriers that emphasize the importance of
prophylactic thyroidectomy as soon as the molecular diagnosis is confirmed.
Key words: Multiple endocrine neoplasia type 2A; MEN 2A; RET protooncogene; Familial medullary thyroid carcinoma
El carcinoma medular de
tiroides se origina en las células C o parafoliculares y es una neoplasia poco frecuente,
que comprende a un 10% de los carcinomas
tiroideos1.
Puede presentarse en forma esporádica (75%) o
familiar (25%). La variedad hereditaria puede expresarse con tres cuadros
diferentes: sólo a través del tumor tiroideo (5%) y se la denomina carcinoma
medular familiar (CMTF), o asociada a otras patologías constituyendo un
síndrome poliglandular, la neoplasia endocrina múltiple tipo 2 (MEN 2) con dos
subtipos: A (17%) y B (3%)2. En el MEN
2A se asocia al carcinoma medular, hiperparatiroidismo (10-20%), feocromocitoma
(30-50%) y en algunas familias liquen amiloidótico cutáneo. En el MEN 2B además
del carcinoma medular, los pacientes presentan hábito marfanoide,
feocromocitoma, ganglioneuromas difusos en labios, ojos, lengua y tracto
gastrointestinal e hipertrofia de nervios corneales3.
El carcinoma
medular de tiroides familiar, el MEN 2A y el MEN 2B son enfermedades
hereditarias autosómicas dominantes, resultado de una mutación
germinal del protooncogen RET, que está localizado en la región
proximal del brazo largo del cromosoma 10, banda q11.2. El protooncogen RET codifica
para un receptor de la familia de las tirosina quinasas y está compuesto
por tres dominios: el extracelular, el transmembrana y la porción intracelular
que contiene el dominio tirosina quinasa4.
Se han detectado mutaciones germinales en el protooncogen RET en el 95% de los
MEN 2B, en el 98% de los MEN 2A y en el 88% de los carcinomas medulares familiares5.
Las mutaciones involucran cisteínas del dominio extracelular identificadas
en el exón 10 (codones 609, 611, 618, 620) y en el exón 11(codones
630 y 634), y otras mutaciones en los dominios tirosina quinasa: en el exón
13 (codones 768, 790, 791), en el exón 14 (codón 804) y en el exón
15 (codón 883 y 891). El
análisis directo del ADN nos da la
oportunidad de detectar a los sujetos con riesgo, aun antes de que se expresen
bioquímicamente, eliminando los falsos positivos de la prueba de pentagastrina6,
que hasta hace poco era utilizada como el marcador precoz de la hiperplasia de
las células C.
La cirugía es el único tratamiento
curativo en el CMTF por lo que la identificación temprana de los portadores
es crucial. En el presente estudio evaluamos nuestra experiencia en la detección
de la mutación en el protooncogen RET en los casos índice y en
los portadores asintomáticos de familias con carcinoma medular familiar
y MEN 2A. Correlacionamos la mutación genética con la expresión
fenotípica y en los
portadores asintomáticos que fueron tiroidectomizados, correlacionamos
los niveles de calcitonina con los hallazgos anatomopatológicos y evaluamos
si la edad en que se indicó la cirugía era la adecuada.
Fueron estudiadas 7 familias con carcinoma
medular familiar: 2 con MEN 2A y 5 con carcinoma medular familiar. Las familias
con CMTF presentaban como mínimo 4 miembros afectados con una evolución
entre 10 y 35 años. Se descartaron el feocromocitoma y el hiperparatiroidismo
con dosajes de catecolaminas urinarias seriadas, calcio iónico y PTH.
Evaluamos un total de 57 individuos, de los cuales 33 eran mujeres y 24 varones,
con una edad X–=23.3±13.9 años (rango de 2 a 55). Treinta y dos individuos
eran asintomáticos pero en su evolución 25 de los 57 habían presentado
carcinoma medular de tiroides, 5 (20%) feocromocitoma (2 bilaterales) y 1 (4%)
hiperparatiroidismo.
Para el estudio del protooncogen
RET, se aisló ADN de sangre periférica
recogida con EDTA y se amplificó con la reacción en cadena de la
polimerasa en cinco amplicones. Se amplificaron los exones 10, 11, 13, 14 y 15
del protooncogen RET7.
Se realizó la secuenciación
directa de los productos amplificados, utilizando los reactivos de Sequenase
(Amersham)
para productos de PCR y se analizaron las secuencias de bases.
Seis de las
siete mutaciones germinales fueron detectadas en el codón 634, 2
pertenecen a familias con MEN 2A y 4 con CMTF. La séptima mutación se detectó
en el codón 630. Se detectaron dos transversiones (cambio de una base purínica
por una base pirimidínica) T>A en las familias RE06 (CMTF) y G>T en la
familia RE07 (CMTF), resultando una cisteína
reemplazada por serina y por fenilalanina, respectivamente, en la
proteína codificada por el protooncogen RET. Las demás mutaciones fueron
transiciones (cambio de bases purínicas o pirimidínicas entre sí): G>A en la
familia RE01 (MEN 2A) y en RE02 y RE05 (CMTF), resultando un cambio de cisteína
por tirosina; T>C en la familia RE03 (MEN 2A) y RE04 (CMTF), resultando el
cambio cisteína por arginina. La familia RE04 que mencionamos, presentó una
mutación novel en el codón 630, transición T>C, (Tabla 1).
De los 32 pacientes asintomáticos, 7 presentaron
la mutación familiar del protooncogen RET. De estos últimos, 5
eran niños con
una edad X–=11±3.2 años (rango de 5 a 15), los que fueron tiroidectomizados
profilácticamente; los padres de los 2 niños restantes (de 15 y
9 años) se
negaron a la cirugía. A los 5 portadores asinto-máticos, previo
a la cirugía,
se les dosó la calcitonina plasmática. A 2 de ellos, se les realizó la
prueba de pentagastrina administrándoles 0.5 U/kg/peso EV en bolo de PeptavlonNR con
dosajes plasmáticos a los 2', 5' y 10' post estímulo. A los
3 restantes se les midió sólo la calcitonina basal porque se negaron
a realizar la prueba por temor a la intolerancia digestiva. Se consideró normal
una concentración basal
de calcitonina entre 0-10 pg/ml con una respuesta máxima hasta 36 pg/ml.
La calcitonina fue medida por IRMA (DSL tubo recubierto).
La concentración basal de
calcitonina, su respuesta a pentagastrina y la correlación con los hallazgos
anatomopatológicos se detallan en la Tabla 2. Los
niños
operados profilácticamente evolucionaron adecuadamente durante 3 años de
control clínico con calcitoninas por debajo del límite de detección del método.
En todas las familias evaluadas, 2 MEN 2A y 5 CMTF, se identificó la mutación del protooncogen RET en el exón 11, en la región que codifica para el dominio extracelular. La mutación en el residuo cisteína del codón 634 fue el hallazgo más frecuente comprendiendo a 6 de las 7 familias estudiadas. La familia restante (Fig. 1), con CMTF y 35 años de evolución, presentó una mutación novel T>C en el codón 630. Estos hallazgos coinciden con la extensa revisión de Eng y col.5, en la cual la mayoría de los casos presentaron la mutación en el codón 634 (85% de los MEN 2A y el 30% de los CMTF). En esta misma revisión5 las bases del codón normal TGC, cambiaron en orden de frecuencia de la siguiente manera: 52.1% presentaron la mutación CGC y el 26% TAC; las mutaciones AGC y TTC sólo comprendieron al 1.8 y al 5%, respectivamente. En el presente estudio, nosotros hallamos las siguientes mutaciones: 3 TAC (42.8%), 2 CGC (28.57%), una AGC y una TTC (14.2%). Estas diferencias estarían justificadas por el bajo número de familias que nosotros estudiamos, o por diferencias étnicas aun por definir.
Es interesante subrayar
que la mutación CGC en el codón 634 correspondió a la única
familia con MEN 2A con hiperparatiroidismo. Para Mulligan8 y
la revisión del Consorcio de RET5 la mutación en el codón 634 fue la más
frecuente y reveló una asociación significativa con cambio a CGC
en 57 de 93 pacientes con hiperpa-ratiroidismo. Sin embargo, Schuffenecker9 no
observó
ninguna prevalencia de hiperparatiroidismo para una mutación dada, ya que el
23.1% de las familias tenían CGC, el 17.5% TAC y el 16.3% otras mutaciones en
el codón 634. Esto evidenciaría que cualquier mutación activante en el codón
634 generaría o predispondría para la hiperplasia paratiroidea, aunque no
podemos descartar la asociación posterior con otros eventos genéticos.
Describimos
además, la primera
familia de la que tengamos conocimiento con carcinoma medular familiar que
presenta la mutación germinal C630A (Fig. 1). Esta
mutación
había sido descripta5 en
la sangre periférica de un
paciente con carcinoma medular familiar que no tuvo seguimiento posterior y
cuya familia no fue analizada. También fue descripta como mutación
somática10,
pero nunca como mutación germinal en una familia, que además resultó numerosa
(Fig. 1). En el codón 630 se describieron otras mutaciones
germinales11, pero no
la transición T>C; en efecto, es un codón
que se encuentra mutado en baja frecuencia y algunos autores marcan la
necesidad de conocer datos de las familias con mutación en 63012. La
descripción de nuevas mutaciones es de
gran importancia para incorporarlas al análisis de ADN, lo que aumenta
su eficacia para detectar la mutación familiar, especialmente cuando se
utilizan métodos indirectos (hibridación, análisis de sitios
de restricción). Esto
ocurrió con la familia RE06, portadora de la mutación AGC para
el codón 634,
que cuando fue evaluada previamente en otra institución por métodos
indirectos (análisis por cambios en sitios de restricción) resultó normal
y nosotros detectamos, por secuenciación, esta mutación de muy
baja frecuencia.
Los cinco niños portadores
asintomáticos que fueron tiroidectomizados, mostraron hiperplasia de células C
y focos de microcarcinoma en ambos lóbulos tiroideos, aun en presencia
de calcitonina basal o respuesta a la pentagastrina normales. Algunos autores13 consideran
que los portadores de la mutación en el protooncogen RET presentan una prueba
de pentagastrina normal cuando la concentración de calcitonina post estímulo es
menor de 10 pg/ml, en lugar del límite de 36 pg/ml que se utiliza para la
población general. Utilizando este criterio, dos de nuestros pacientes eran
hiperrespondientes (calcitonina post estímulo de 18 y 130 pg/ml) lo que se
correlacionaba con el hallazgo histopatológico. Se ha referido13,
una correlación directa entre el nivel de calcitonina plasmática y el grado de
extensión de la enfermedad; sin embargo, se han observado concentraciones
normales de calcitonina aun en pacientes con macrometástasis ganglionares13.
Esto sugiere que la tiroidectomía no debería demorarse hasta que la calcitonina
fuese anormal porque estaríamos frente a un estadio avanzado de la enfermedad.
El estudio directo del ADN es el método de elección para seleccionar a los
portadores en estadio preclínico, reservando la evaluación bioquímica sólo
para el seguimiento14.
Una vez identificados
los portadores de una mutación se sugiere realizar la tiroidectomía lo más
precoz-mente posible ya que existe una correlación directa entre la edad, la
extensión histopatológica y el pobre pronóstico evolutivo. La mayoría
de los autores15 la
recomiendan entre los 4 y 6 años, pese a que otros
ya han observado focos de carcinoma medular en niños entre 1.7 y 4 años13, 16, 17,
lo que sugiere que la edad no sería un parámetro confiable con el cual decidir el
momento más oportuno para la cirugía, sino el hallazgo de la mutación. En
disidencia con lo referido por todos los autores y con nuestros propios hallazgos,
Hansen y col.18 refieren
que en Dinamarca la mutación más frecuente
fue en el exón 10 (8/10 familias). Proponen una conducta conservadora
porque dos miembros de una familia con
más de 70 años portadores de la mutación presentaron un test de pentagastrina
normal, especulando con una evolución más «benigna» de esa mutación en
particular, aunque soslayan el hecho de que el caso índice desarrolló
metástasis ganglionares al 1.5 años de la cirugía y que otro familiar de 15
años presentó microcarcinoma e hiperplasia de células C, lo que pone en duda la
validez de la conducta conservadora y resalta otros factores ambientales y/o
individuales como interacciones entre genes que modifican la expresión en locus distantes resultando
manifiestaciones fenotípicas distintas (epistasis).
El RET codifica
para un receptor de factores de crecimiento neurotrófico (GNDF) que se
expresa en tejidos neuroectodérmicos (células C de la tiroides;
médula suprarrenal; paratiroides).
Las mutaciones del mismo generan una activación permanente sin que haya
unión
del ligando6.
Dado que éste es un defecto genético, el individuo
está expuesto desde la vida intrauterina al estímulo permanente
del crecimiento celular en el órgano blanco, lo que avala el hallazgo
de enfermedad de la célula C en todos los pacientes que fueron tiroidectomizados
por el hallazgo de la mutación. El asesoramiento de la familia antes de
realizar el estudio genético y reafirmarlo con un consentimiento del procedimiento,
facilita la comprensión del resultado del estudio molecular y favorece
la decisión de
avalar la tiroidectomía de un niño aparentemente sano.
Agradecimientos: Este trabajo se realizó con subsidios de CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas), Universidad de Buenos Aires y Ministerio de Salud de la Nación. Gisella Dihartce prestó una ayuda eficaz en el manejo de la base de datos genéticos para el análisis de las familias con cáncer hereditario.
1. Hazard
JB, Hawk WA, Crile G Jr. Medullary
(solid) carcinoma of the thyroid: a clinicopathologic entity. J Clin
Endocrinol Metab 1959; 19: 152-61.
2. Raue
F. Multiple endocrine neoplasia type 2 and medullary thyroid carcinoma. In: PJ
Jenkins R, Sheaves, Wass JA (eds). Clinical Endocrine Oncology, Blackwell
Science, Oxford 1996, p 445-52.
3. Raue
F, Frank-Raue K, Grauer A. Multiple endocrine neoplasia type 2. Clinical
features and screening. Endocrinol Metab Clin North Am 1994; 23:137-56.
4. Santoro
M, Carlomagno F, Melillo RM, Billaud M, Vecchio G, Fusco A. Molecular
mechanisms of RET activation in human neoplasia. J Endocrinol Invest 1999;
22: 811-9.
5. Eng C,
Clayton D, Schuffenecker I, et al. The relationship between specific ret
proto-oncogene mutations and disease phenotype in multiple endocrine neoplasia
type 2. International RET consortium analysis. JAMA 1996; 276: 1575-9.
6. Barbot
N, Calmettes C, Schuffenecker I, et al. Pentagastrin stimulation test and early
diagnosis of medullary thyroid carcinoma using an immunoradiometric assay of
calcitonin: comparison with genetic screening in hereditary medullary thyroid
carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 1994;
78: 114-20.
7. Hofstra
RMW, Fattoruso O, Quadro L, et al. A novel point mutation in the
intracellular domain of the ret Protooncogen in a family with medullary thyroid
carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 4176-8.
8. Mulligan
LM, Eng C, Healey CS, et al. Specific mutations of the RET protooncogene are
related to disease phenotype in MEN 2A and FMTC. Nat Genet 1994; 6:
70-4.
9. Schuffenecker
I, Virally-Monod M, Brohet R, et al. Risk and penetrance of primary
hyperparathyroidism in multiple endocrine neoplasia type 2 A families with
mutations at codon 634 of the RET proto-oncogene. J Clin Endocrinol Metab
1998; 83: 487-91.
10. Bugalho
MJ, Frade JP, Santos JR, Limbert E, Sobrinho L. Molecular analysis of the RET
proto-oncogen in patients with sporadic medullary thyroid carcinoma: a novel
pint mutation in the extracellular cistein-rich domain. Eur J
Endocrinol 1997; 136: 423-6.
11. Komminoth
P, Kunz EK, Matias-Guiu X, et al. Analysis of RET protooncogene
point mutations distinguished heritable from no heritable medullary thyroid
carcinomas. Cancer 1995; 76: 479-89.
12. Simon
S, Pavel M, Hensen J, Berg J, Hummer HP, Carbon R. Multiple endocrine neoplasia
2A syndrome: Surgical management. J Pediatr Sur 2002; 37: 897-900.
13. Wells
SA, Skinner MA. Prophylactic thyroidectomy, based on direct genetic testing,
in patients at risk for multiple endocrine neoplasia type 2 syndromes. Exp Clin
Endocr Diab 1998; 52: 455-60.
14. Heshmati
HM, Gharib H, van Heerden JA, Sizemore GW. Advances and controversies in the
diagnosis and management of medullary thyroid carcinoma. Review. Am J Med 1997;
103: 60-9.
15. Wells
Sa, Chi DD, Toshima K, et al. Predictive DNA testing and prophylactic
thyroidectomy in patients at risk for multiple endocrine neoplasia type 2A. Ann
Surg 1994; 220: 237-50.
16. Niccoli-Sire
P, Murat A, Baudin E, et al. Early or pro-phylactic thyroidectomy
in MEN 2/FMTC gene carriers: results in 71 thyroidectomized patients. The
French Calcitonin Tumours Study Group (GETC). Eur J Endocrinol 1999;
141: 468-74.
17. Sanso
GE, Domene HM, Garcia Rudaz MC, et al. Very early detection of RET
proto-oncogene mutation is crucial for preventive thyroidectomy in multiple
endocrine neoplasia type 2 children. Cancer 2002; 94: 323-30.
18. Hansen
HS, Terring H, Godballe C, Jäger AC, Nielsen FC. Is thyroidectomy necessary in
RET mutations carriers of the familial medullary thyroid carcinoma syndrome? Cancer 2001; 89: 863-907.
Recibido: 7 de Marzo de 2002
Aceptado: 28 de Noviembre de 2002