La proteína asociada a SLAM (SAP) regula la expresión de IFN-g en lepra*
María F. Quiroga, Gustavo J. Martínez, Virginia Pasquinelli, Verónica E. García
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología y Laboratorio de Inmunogenética, Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires
Dirección postal: Dra. Verónica García, Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Paraguay 2155, 1121, Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 5950-8758. E e-mail: vgarcia@fmed.uba.ar
*Este trabajo mereció el Premio Leonardo Satz durante la Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología, Mar del Plata, noviembre 2003.
Resumen
La inmunidad protectora contra Mycobacterium
leprae requiere IFN-g. Los
pacientes con lepra tuberculoide producen localmente
citoquinas Th1, mientras que los pacientes lepromatosos producen citoquinas
Th2. La molécula linfocitaria activadora de señales (SLAM) y la proteína
asociada a SLAM (SAP) participan en la diferenciación celular que conduce a
producción de patrones específicos de citoquinas. A fin de investigar la vía
SLAM/SAP en la infección por M. leprae, determinamos expresión de ARN
mensajero (ARNm) de SAP, IFN-g y SLAM
en pacientes con lepra. Observamos que la expresión de SLAM correlacionó en
forma directa con la expresión de IFN-g,
mientras que la expresión de SAP correlacionó inversamente con la expresión de
ambas proteínas. Así, nuestros resultados indican que SAP interferiría con las
respuestas de citoquinas Th1 mientras que SLAM contribuiría con la respuesta
Th1 en lepra, señalando a la vía SLAM/SAP como potencial blanco modulador de
citoquinas en enfermedades con respuestas Th2 disfuncionales.
Palabras clave: Th1; SLAM; SAP; IFN-g; Coestimulación; Infección intracelular.
Abstract
The SLAM-associated protein (SAP) regulates IFN-g expression in leprosy. Tuberculoid leprosy patients locally produce Th1 cytokines, while lepromatous patients produce Th2 cytokines. Signaling lymphocytic activation molecule (SLAM) and the SLAM-associated protein (SAP) participate in the differentiation process that leads to the production of specific patterns of cytokines by activated T cells. To investigate the SLAM/SAP pathway in M. leprae infection, we determined the expression of SAP, IFN-g and SLAM RNA messenger in leprosy patients. We found a direct correlation of SLAM expression with IFN-g expression, whereas the expression of SAP was inversely correlated with the expression of both SLAM and IFN-g. Therefore, our data indicate that SAP might interfere with Th1 cytokine responses while SLAM expression may contribute to Th1 responses in leprosy. This study further suggests that the SLAM/SAP pathway might be a focal point for therapeutic modulation of T cell cytokine responses in diseases characterized by dysfunctional Th2 responses.
Key words: Th1; SAP; SLAM, IFN-g; Co-stimulation; intracellular infection.
La inmunidad contra patógenos intracelulares como las
micobacterias requiere IFN-g, una
citoquina activadora de macrófagos producida por células T1. La lepra es una enfermedad dinámica
donde diferentes subpoblaciones de células T reactivas a Mycobacterium
leprae controlan el espectro clínico/inmunológico. Los pacientes con lepra
tuberculoide restringen el crecimiento del patógeno, montan fuertes respuestas
celulares T contra M. leprae, y producen localmente citoquinas Th12. En contraste, los pacientes con lepra
lepromatosa presentan infección diseminada, sus células T responden débilmente
a M. leprae, y sus lesiones expresan citoquinas Th2, típicas de
respuestas humorales y supresión de la respuesta inmune celular2. Varios factores influencian el nivel y
patrón de citoquinas producidos por células T activadas3. Uno de dichos factores es la molécula
linfocitaria activadora de señales (SLAM), glicoproteína de membrana expresada
en linfocitos y timocitos inmaduros, que aumenta la producción de IFN-g y la proliferación celular4. Otro de los factores que modulan los
patrones de citoquinas producidos por las células T activadas es la proteína
asociada a SLAM (SAP), una molécula expresada en células T y NK (natural
killers) que contiene un único dominio SH2 e interacciona con la cola
citoplas-mática de SLAM5. Dicha
proteína participa en el proceso de diferenciación que conduce a las células T
hacia un patrón específico de citoquinas, operando como inhibidor natural de
las vías de transducción de señales desde SLAM hacia el interior de la célula6. Ha sido descripto que el dominio SH2 de
SAP se une al dominio SH3 de la quinasa FynT y directamente acopla FynT a SLAM7. Estudios en ratones deficientes en SAP
revelaron secreción incrementada de IFN-g 6, sugiriendo que la falta de expresión de
SAP da como resultado un viraje hacia el fenotipo Th1. Más aún, en humanos
deficientes en SAP (síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X-(XLP)),
las concentraciones de IFN-g se
encuentran elevadas durante la infección primaria por EBV, sugiriendo que un
viraje hacia la producción de citoquinas Th1 podría contribuir a la progresiva
inmunopatología de los individuos afectados8.
De esta manera, las anormalidades en la secreción de citoquinas que ocurren
tanto en humanos como en ratones deficientes en SAP, podrían resultar de
defectos en la propagación de señales inducidas a través de SLAM9.
Estudios previos de nuestro laboratorio demostraron que la
expresión de SLAM en lepra correlaciona con respuestas Th1, que la
señalización a través de SLAM incrementa la producción de IFN-g y que la expresión de SLAM aumenta por
efecto de IFN-g10. Más recientemente, observamos que la
expresión de SAP inhibe la producción de IFN-g en la tuberculosis humana11.
Considerando que tanto SLAM como IFN-g promueven respuestas de inmunidad celular en la infección por micobacterias10, 12, y dado que SAP parecería actuar
como un cofactor esencial para la transducción de señales mediadas por SLAM, en
este trabajo se iniciaron estudios para investigar la vía de señalización
SLAM/SAP en pacientes con lepra y en dadores sanos.
Los pacientes con lepra fueron evaluados en el Hospital de
Infecciosas F.J. Muñiz, Buenos Aires y clasificados de acuerdo al criterio
establecido por Ridley y Jopling13.
Se obtuvo sangre periférica heparinizada de pacientes con lepra tuberculoide
(T-Lep) y lepromatosa (L-Lep), luego de consentimiento informado de los mismos.
Los controles participantes en este estudio fueron individuos sanos sin
enfermedades asociadas. A fin de investigar la expresión de ARN mensajero
(ARNm) de SLAM, SAP e IFN-g, se
obtuvieron células mononu-cleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes con
lepra y de individuos sanos luego de estimulación con sonicado de M. leprae.
Posteriormente, se purificó el ARN total y se realizó RT-PCR, mediante
utilización de cebadores específicos para SLAM, IFN-g y SAP. Nuestros resultados mostraron que, en pacientes con
lepra lepromatosa, la estimulación celular con antígeno específico no indujo expresión
del ARNm de IFN-g o SLAM, mientras que
se observó un notable incremento en la expresión del ARNm de SAP luego de dicha
estimulación (Figura 1A y 1B). Por el contrario, en pacientes con lepra
tuberculoide, la estimulación con M. leprae indujo expresión de ARNm de
IFN-g y de SLAM. Resultó interesante
que, en estos pacientes respondedores, la estimulación antigénica produjo una
marcada disminución de los niveles de ARNm de SAP en comparación con células no
estimuladas, las cuales mostraron altos niveles de SAP (Figura 1A). Mas aún, y
concordando con nuestros resultados en pacientes con lepra tuberculoide, en
dadores sanos la presencia del ARNm de SLAM correlacionó con la expresión del
ARNm de IFN-g, mientras que, la
presencia de ambas proteínas correlacionó inversamente con la expresión de SAP
(Figura 1A y 1B). Resulta interesante que nuestros resultados coincidan con un
modelo recientemente propuesto en ratón, el cual postula que SAP es requerido
para inhibir la producción de IFN-g 9. En dichos estudios, en la línea celular
murina T BI-14, la interacción SLAM/SAP desencadena una señal que inhibe de
manera selectiva la producción de IFN-g durante la activación T9. De
esta manera, los resultados publicados en ratón, conjuntamente con nuestros
resultados actuales apoyarían la hipótesis que la expresión diferencial de SLAM
y de SAP participaría en la modulación del patrón de citoquinas producido
durante la infección por M. leprae. Ha sido informado que las cantidades
relativas de expresión de SLAM y de SAP podrían variar durante la activación
linfocitaria y en algunos desórdenes autoinmunes, y que la abundancia relativa
entre estas dos moléculas podría tener un rol en las funciones que dependen de
SLAM9. De hecho, ha sido
propuesto que la expresión diferencial de SLAM y SAP estaría relacionada con el
estado de activación de la célula14.
En ratón, la expresión de SAP es regulada negativamente en forma inmediata en
células T activadas, mientras que la expresión de SLAM aumenta tempranamente.
Asimismo, el gen de SAP contiene múltiples sitios que podrían estar
involucrados en la regulación de su expresión, y esta regulación ocurriría a
través de múltiples mecanismos, a nivel transcripcional y a nivel
post-transcripcional por moléculas de degradación de ARNm14. Por lo tanto, proponemos que la
regulación de la producción de IFN-g por moléculas de señalización en lepra sería en primer lugar dependiente del
reconocimiento del antígeno por los linfocitos. Las células T de pacientes con
lepra tuberculoide responden al antígeno rápidamente, aumentando los niveles de
expresión de SLAM en su superficie, mientras que la expresión de SAP disminuye
de manera transitoria en respuesta a la activación celular. Asimismo, estas dos
señales se combinan para aumentar la expresión de IFN-g. Esta cascada de señalización se ve impedida en los pacientes
con lepra lepromatosa, ya que la anergia específica frente a M. leprae impide la regulación positiva de la expresión de SLAM y las moléculas de SAP
existentes previenen la producción de IFN-g.
Los resultados del presente estudio, junto con nuestros
resultados anteriores en lepra10
y tuberculosis11, señalan a
SLAM y a SAP como potenciales blancos moduladores de citoquinas en enfermedades
con respuestas Th2 disfuncionales.
Fig. 1.- Células mononucleares de sangre periférica (CMSP)
provenientes de pacientes con lepra lepromatosa (L-Lep), lepra tuberculoide
(T-Lep) y dadores sanos (DS) fueron cultivadas en presencia o ausencia de
sonicado de M. leprae por 16 hs. El ARN total fue purificado y se
realizó RT-PCR, utilizando cebadores específicos para SLAM, IFN-g y SAP. Con el objetivo de comparar los
niveles de ARNm entre diferentes muestras, se normalizaron las concentraciones
de ADN complementario a una cantidad equivalente de producto de PCR de b-actina. (A) Ejemplos representativos de
pacientes L-Lep, T-Lep y DS. (B) Densitometría de los resultados obtenidos
frente a estimulación de CMSP con M. leprae. Los datos se expresan como
unidades arbitrarias (UA).
Agradecimientos: El presente trabajo recibió el apoyo del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) y de la Fundación Antorchas. Los autores agradecen asimismo, a Adriana Corigliano por el apoyo técnico brindado.
Bibliografía
1. Cooper AM, Dalton DK, Stewart TA, et al.
Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med 1993; 178: 2243-7.
2. Salgame P, Abrams JS, Clayberger C, et al.
Differing lymphokine profiles of functional subsets of human CD4 and CD8 T cell
clones. Science 1991; 254: 279-82.
3. Cocks BG, Chang CC, Carballido JM, et al. A
novel receptor involved in T-cell activation. Nature 1995; 376:
260-3.
4. Castro AG, Hauser TM, Cocks BG, et al. Molecular
and functional characterization of mouse signaling lymphocytic activation
molecule (SLAM): differential expression and responsiveness in Th1 and Th2
cells. J Immunol 1999; 163: 5860-70.
5. Sayos J, Wu C, Morra M, et al. The X-linked
lympho-proliferative-disease gene product SAP regulates signals induced through
the co-receptor SLAM. Nature 1998; 395: 462-9.
6. Wu C, Nguyen KB, Pien GC, et al. SAP controls T
cell responses to virus and terminal differentiation of Th2 cells. Nat
Immunol 2001; 2: 410-4.
7. Chan B, Lanyi A, Song HK, et al. SAP couples Fyn
to SLAM immune receptors. Nat Cell Biol 2003; 5: 155-60.
8. Morra M, Lu J, Poy F, et al. Structural basis
for the interaction of the free SH2 domain EAT-2 with SLAM receptors in
hematopoietic cells. Embo J 2001; 20: 5840-52.
9. Nichols KE, Koretzky GA, and June CH. SAP: natural
inhibitor or grand SLAM of T cell activation? Nat Immunol 2001; 2:
665-6.
10. Garcia VE, Quiroga MF, Ochoa MT, et al.
Signaling lymphocytic activation molecule expression and regulation in human
intracellular infection correlate with Th1 cytokine patterns. J Immunol 2001; 167: 5719-24.
11. Pasquinelli V, Quiroga MF, Martinez GJ, et al.
Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein
interrupts IFN-gamma production in human tuberculosis. J Immunol 2004;
172: 1177-85.
12. Cooper AM, Pearl JE, Brooks JV, Ehlers S, and Orme IM.
Expression of the nitric oxide synthase 2 gene is not essential for early
control of Mycobacterium tuberculosis in the murine lung. Infect Immun 2000; 68: 6879-82.
13. Ridley DS, and Jopling WH. Classification of leprosy
according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis
1966; 34: 255-73.
14. Wu C, Sayos J, Wang N, et al. Genomic
organization and characterization of mouse SAP, the gene that is altered in
X-linked lymphoproliferative disease. Immunogenetics 2000; 51: 805-15.