ARTÍCULO ORIGINAL
Ácido siálico sérico, carga aniónica y agregación eritrocitaria en pacientes diabéticos e hipertensos
Natalia Lebensohn1, Andrea Re1, Larisa Carrera2, Liliana Barberena2, Mabel D´Arrigo1 , Patricia Foresto1
1Laboratorio Inmunohematología y Hemorreología, Departamento Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas,
2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario
Dirección postal: Dra. Patricia Foresto, Dorrego 2366, 2000 Rosario, Santa Fe, Argentina Fax: (54-0341) 480-4593 e-mail: pgforesto@yahoo.com.ar
Resumen
El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación del ácido siálico sérico (AS) y la carga aniónica
eritrocitaria (CAE) con la agregación eritrocitaria en dos grupos de pacientes: diabéticos (DBT
n= 20) e hipertensos (HTA n= 21), comparados con un grupo control (n= 20). Se trabajó con sangre anticoagulada
con EDTA y suero. La agregación eritrocitaria se estudió por observación microscópica de los agregados y
cuantificación a través de un parámetro de forma denominado ASP (Aggregation Shape Parameter). La CAE se
determinó por unión a colorante alcian blue y el AS por método espectrofotométrico con reactivo de Erlich. Los
valores de ASP y AS resultaron significativamente aumentados en los HTA y DBT respecto de los normales.
Los HTA y DBT presentaron agregados amorfos, lo que se refleja en los valores alterados de ASP,
significativamente mayores (p < 0.005) respecto de los individuos normales. Los valores de CAE resultaron
significativamente inferiores en los HTA y DBT respecto del grupo control (p < 0.0001). En este trabajo se demostraron
anormalidades en la agregación eritrocitaria, detectadas por los valores de ASP, CAE y AS que podrían
estar involucradas en las complicaciones vasculares de vasculopatías como la hipertensión y la diabetes.
Palabras clave: Agregación eritrocitaria; Ácido siálico; Diabetes; Hipertensión
Abstract
Serum sialic acid, cellular anionic charge and erythrocyte aggregation in diabetic and hypertensive
patients. The aim of this work was to study the relationship between serum sialic acid
(SSA) and erythrocyte anionic charge (EAC) with erythrocyte aggregation in two groups: diabetic (DBT, n=20)
and hypertensive (HT, n=21) patients, compared to a control group (n=20). We worked with anticoagulated blood
with EDTA and serum. The erythrocyte aggregation was studied by microscopically observing and quantifying
aggregates using an ASP (Aggregate Shape Parameter). The EAC was determined by binding an Alcian blue
dye to the membrane sialic acid and SSA was determined by spectrophotometric method with an Erlich reactant.
The values of ASP and SSA increased significantly in HT and DBT patients compared to the control group.
The HT and DBT groups showed amorphous aggregates, evident in an alteration in the values of ASP, which
were significantly higher ( p< 0.005) than in healthy patients. The EAC values were much lower in HT and DBT
patients than in the control group (p < 0.0001). In this work, abnormalities in the erythrocyte aggregation could
be detected by the values of ASP, EAC and SSA, which might be involved in vascular disorders of diseases
such as hypertension and diabetes.
Key words: Erythrocyte aggregation; Sialic acid; Hypertension; Diabetes
Durante las últimas décadas hubo un incremento en
el interés de las ciencias básicas y clínicas por las posibles
asociaciones entre parámetros hemorreológicos y
el desarrollo de complicaciones en vasculopatías como
la hipertensión y la diabetes.
La agregación eritrocitaria, el factor celular más importante
en la determinación de la viscosidad sanguínea
a bajas velocidades de flujo, refleja un delicado balance
entre las fuerzas de adhesión celular (debidas a la
adsorción de macromoléculas y a la creación de puentes
entre los eritrocitos) y el efecto de las fuerzas de
desagregación (como las fuerzas de cizallamiento mecánico,
la repulsión electrostática entre las células, entre
otros). Cuando la velocidad de deslizamiento de los
eritrocitos disminuye, éstos se agregan formando "pilas
de moneda" o "rouleaux". Tal fenómeno se observa en
los territorios donde la circulación sanguínea es lenta y
puede revertirse con el cambio de las condiciones circulatorias;
esto es, con el aumento de la velocidad del flujo
sanguíneo.
En la hipertensión arterial pueden producirse anomalías
de distinto tipo, que ocasionan disfunción endotelial, modificación en la liberación de mediadores químicos,
aumento de la resistencia y modificaciones en la perfusión
de órganos. Es clásico definir a la hipertensión como
el producto del gasto cardíaco por la resistencia periférica
total (RPT). Esta última surge como consecuencia de la
viscosidad sanguínea y la dificultad que la cambiante
geometría vascular opone al flujo sanguíneo. Analizando
la RPT, es fácil entender entonces el papel decisivo
de los factores hemorreológicos a nivel de la microcirculación1.
En resumen, en la hipertensión y en la diabetes se
generarían cambios hemorreológicos en toda la extensión
del aparato cardiovascular, quedando por definir si
ellos son causa o consecuencia de los mismos.
El ácido siálico (AS) forma parte de oligosacáridos
unidos a proteínas de membranas celulares eritrocitarias.
Aproximadamente el 80% del ácido siálico en suero humano
es N-acetil neuramínico (Neu5Ac; NANA)2, 3.
Algunas de las funciones atribuidas al ácido siálico
son: 1) ser constituyente mayoritario de la carga electronegativa
de la superficie celular eritrocitaria (CAE), (la carga
negativa contribuye a la repulsión celular, por efecto
antiagregante, participando en la estabilización de
glicoproteínas en circulación e impidiendo las interacciones
célula-célula); 2) proteger del ataque proteolítico por
sialización de glicoproteínas; 3) participar en el reconocimiento
e interacción de mensajeros químicos en tejidos
y fluidos biológicos; 4) ser componente de receptores de
superficie celular4, 5.
Numerosos trabajos demuestran la relación del ácido
siálico sérico con el desarrollo de complicaciones en enfermedades
cardiovasculares (ECV). Es considerado
como un marcador de riesgo cardiovascular y predictor a
largo plazo de ECV6-9.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación del ácido siálico sérico y la carga aniónica con la agregación
eritrocitaria, en dos grupos de pacientes: diabéticos e
hipertensos, comparados con un grupo control.
Materiales y métodos
Se estudiaron 21 pacientes hipertensos sin tratamiento, no
diabéticos, provenientes del Servicio de Clínica Médica del
Hospital Provincial del Centenario, entre 32 y 72 años de
edad, 20 pacientes diabéticos y 20 individuos normales (la
composición de ambos grupos, fue similar en cuanto a sexo
y edades). Se realizó una detallada historia clínica y examen
físico de los pacientes, incluyendo estudios de laboratorio. Las
muestras de sangre fueron extraídas por punción venosa, se
trabajó con muestra anticoagulada con EDTA/Na2 para los
estudios hemorreológicos y suero para las determinaciones
de AS y CAE. Los hematíes fueron separados por centrifugación
y resuspendidos a la concentración requerida para
cada estudio. Las determinaciones fueron realizadas en el
Laboratorio de Inmunohematología, Hemorreología e Inmunogenética
del Hospital Provincial Centenario de Rosario. La
presión sanguínea fue medida a la mañana luego de 5 minutos
de reposo, aplicando la técnica tradicional con
manómetro de mercurio acorde con la American Heart
Association y el British Hypertension Society Standards.
La estimación cuantitativa de la morfología de los agregados
eritrocitarios fue realizada con la técnica denominada
ASP (Agregate Shape Parameter o parámetro de forma de
los agregados). Tal parámetro es definido por la siguiente
ecuación:
Donde A es el área proyectada del agregado y P es el
perímetro de la imagen proyectada del agregado. Los valores
de ASP varían de 0 a 1. En tales condiciones, una esfera,
cuya imagen proyectada es un círculo, tendrá un valor
máximo de ASP = 1, mientras que un cilindro, cuya área proyectada
es un rectángulo, presenta valores de ASP < 1.
El estudio de la morfología de los agregados eritrocitarios,
se realizó por análisis de las imágenes digitalizadas de suspensiones
eritrocitarias al 1% en plasma autólogo. Se estudió la morfología de los agregados con un microscopio óptico
invertido (Union Optical, Tokio), las imágenes fueron captadas
y registradas por una video-cámara (CCD SONY XC-
75), las microfotografías captadas por la videocámara fueron
procesadas con un sofware IPP PLUS 2.1, a través del cual
se pudo medir el área y el perímetro de cada agregado. Los
valores de ASP calculados se expresaron como el promedio
correspondiente a los agregados observados en 20 campos
distintos10-12.
Las determinaciones de AS fueron realizadas mediante
método colorimétrico, aplicando hidrólisis ácida del suero en
presencia de reactivo de Erlich. La CAE se realizó por unión
al colorante catiónico Alcian Blue.
El estudio de la asociación de los parámetros ASP, AS y
CAE, fue realizado por el coeficiente de correlación de
Pearson.
Resultados
La comparación de los valores de las presiones sistólica y diastólica de los individuos hipertensos (156 ± 3 - 101 ± 2 mm Hg) con los controles normotensos (120 ± 2 - 78 ± 2 mm Hg), fue estadísticamente significativa (p < 0.001). Los resultados correspondientes a ASP, AS sérico y la CAE para los grupos estudiados se presentan en la Tabla 1.
TABLA 1.- Valores de ASP (Aggregate Shape Parameter),
CAE (carga aniónica eritrocitaria) y AS (ácido siálico sérico)
en individuos hipertensos, diabéticos y controles normales
Expresados como el promedio ± un desvío estándar
* p < 0.05 respecto al control.
Ambos grupos de pacientes presentaron valores de
ASP y AS superiores respecto a los normales, cuyas probabilidades
fueron p = 0.0048 y p = 0.05 (Tabla 1) respectivamente;
mientras que para CAE, los pacientes
hipertensos y diabéticos mostraron valores significativamente
disminuidos respecto de los controles normales
(p = 0.0001). La correlación del ASP con AS y CAE para
cada grupo de pacientes resultó significativa.
En la Fig. 1 se pueden observar los patrones de agregación
eritrocitaria, resultantes de la observación de las
imágenes digitalizadas de los agregados eritrocitarios en
ambos grupos, normal y con vasculopatía (hipertensos
y diabéticos). En individuos normales, los agregados
adoptan la forma de rouleaux (apilamiento de discocitos bicóncavos) que al enlazarse lateralmente se convierten
en redes filamentosas más o menos reticuladas. En los
pacientes con vasculopatías, los agregados son amorfos,
irregulares y se los conoce como clusters (agrupamiento
de eritrocitos en forma desordenada y globular) lo que
refleja una anormal interacción célula-célula.
Fig. 1.- Imagen inferior: Patrón normal de agregación
eritrocitaria. Imagen superior: Patrón de agregación típico
de pacientes con vasculopatías (diabetes e hipertensión)
Discusión
Los mecanismos propuestos de elevación del ácido siálico
sérico en pacientes hipertensos y diabéticos no están muy
claros, algunas de las hipótesis en la bibliografía plantean
que podrían ser por el incremento de proteínas
reactantes de fase aguda, influencia de la actividad de la
sialil-transferasa, desialización, glicosilación no enzimática
de proteínas de membrana13-16. Tanto la desialización
como la glicosilación no enzimática de proteínas
llevarían a una reducción de la carga electrone-gativa
eritrocitaria y esto a una disminución de la repulsión con
un incremento en la agregación celular, contribuyendo a
alteraciones del flujo microvascular17-19.
En los diabéticos, la formación de rouleaux resulta
alterada, produciéndose grandes agregados que se atribuyen
a una falla en la dispersión de los mismos y que
podrían determinar, como consecuencia, obstrucciones
capilares20, 21.
El enlentecimiento del flujo sanguíneo disminuye las
fuerzas desagregantes, y la mayor agregación eritrocitaria
observada en esta enfermedad dificulta aún más dicho
flujo, provocando una situación de retroalimentación que
lleva a un aumento de la viscosidad sanguínea.
En hipertensión arterial se supone la existencia de
distintas vías y mecanismos que modifican los parámetros
hemorreológicos e influyen en la resistencia periférica.
En esto, además del diámetro de los vasos, la sangre y
sus componentes juegan un papel preponderante a través
de la viscosidad sanguínea, las anomalías de
deformabilidad y la agregación eritrocitaria. De acuerdo
a los resultados obtenidos, se podría pensar que en la
hipertensión arterial los eritrocitos estarían sometidos a
un mayor contacto y agresión con el endotelio, favoreciendo
la desialización de su membrana.
La viscosidad de la sangre a bajas velocidades de
corte depende fundamentalmente de la agregabilidad
eritrocitaria. Es ésta participan factores plasmáticos (proteínas
plasmáticas, como el fibrinógeno) y las características
propias de las células que interaccionan entre sí (deformabilidad, agregación celular).
En este trabajo se advierten diferencias estadísticamente
significativas en los valores de ASP y de ácido
siálico sérico y de membrana, por lo que se puede suponer
que las alteraciones hemorreológicas observadas se
deban a factores celulares eritrocitarios. Se podría pensar
en alteraciones de membranas eritrocitarias con pérdida
de ácido siálico y la consiguiente disminución de
carga neta de superficie, lo que llevaría a una mayor
interacción entre eritrocitos, que se pone de manifiesto
por alteraciones en el patrón de agregación y consecuentemente
en los valores de ASP. El ASP es un parámetro
microrreológico que valora la agregación eritrocitaria, en
la que juegan un papel primordial los capilares, cuyos diámetros pueden llegar al orden del tamaño de los
eritrocitos. Cuando se forman agregados irregulares,
clusters, sus diámetros pueden superar a los de los capilares
generando obstrucciones y complicaciones
microvasculares22.
Por otra parte, debido al limitado acceso in vivo para
el análisis del mecanismo de la formación de agregados,
el ASP provee una herramienta útil para medir
desviaciones en la morfología de los agregados eritrocitarios.
A partir de los resultados obtenidos, esta metodología
podría contribuir a estudiar y comprender, en
parte, los mecanismos involucrados en las alteraciones
de agregación eritrocitaria demostrada en los pacientes
hipertensos y diabéticos bajo mal control metabólico.
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Recibido: 26-9-2008
Aceptado: 12-2-2009