ARTÍCULO ORIGINAL
Fisiopatología y respuesta inmune de ovinos experimentalmente infectados con Echinococcus granulosus
Edmundo Larrieu1, Ángela Rosa Álvarez1, Antonio Gatti2, Sergio Mancini2, Ricardo Bigatti2, Daniel Araya2, Verónica Véspoli2, Juan García Vinet3, Mariela García Cacheau2, Emiliano Álvarez2, Laura Cavagion2
1Facultad de Veterinaria de la Universidad Nacional de La Pampa;
2Ministerio de Salud, Provincia de Río Negro;
3Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Viedma, Río Negro
Dirección postal: Edmundo Juan Larrieu, Laprida 240, 8500 Viedma, Río Negro, Argentina Fax (54-2920) 430007 e-mail: elarrieu@salud.rionegro.gov.ar
Resumen
La respuesta inmune a la infección por Echinococcus granulosus en el ovino ha sido poco estudiada.
El objetivo del presente trabajo fue aportar información sobre la fisiopatología y la respuesta inmune
a la infección experimental con E. granulosus en ovinos. Se inocularon experimentalmente ovinos con tres
dosis distintas de huevos de E. granulosus, evaluándose la repuesta inmune por seguimiento mediante enzimo
inmuno ensayo con tres preparaciones antigénicas (líquido hidatídico total, fracción purificada de líquido hidatídico
total y fracción lipoproteica purificada) durante 500 días. Se sacrificaron animales en forma escalonada para
observar macroscópica y microscópicamente el desarrollo del parásito. La respuesta inmune se detectó a partir
de los 10 días y se mantuvo durante el período de observación, resultando inicialmente proporcional a la carga
de huevos inoculados, y disminuyendo las diferencias con el tiempo. Se identificaron quistes fértiles a los 10
meses post inoculación y oncósferas vivas 500 días post inoculación. La respuesta de anticuerpos en el ovino a
la infección por E. granulosus fue anterior a la formación de líquido hidatídico y resultó generada por la movilidad
de la oncósfera. La temprana fertilidad identificada histológicamente indica que la alimentación de canes
con vísceras de ovinos jóvenes puede producir ciclos de infección. La presencia de oncósferas vivas en el hígado,
por su parte, aporta información sobre la patogenia de la enfermedad y permite expresar hipótesis sobre las
causas de nuevas operaciones en el hombre luego de la extirpación de un quiste hidatídico lo que podría liberar
el freno inmunitario sobre dichas oncósferas.
Palabras clave: Equinococcosis; Ovinos; Respuesta inmune; Fisiopatología
Abstract
Pathophysiology and immune response in sheep experimentally infected with Echinococcus
granulosus. The immune response to Echinococcus granulosus in sheep has not been extensively
investigated. The objective of this study was to increase the information on the physiopathology of E. granulosus
and the immune response elicited in sheep. Animals were experimentally inoculated with three different doses
of E. granulosus eggs and the immune response was evaluated over 500 days using enzyme immunoassay with
three antigenic preparations: total hydatid fluid, purified fraction of hydatid fluid and purified lipoprotein fraction.
Sheep were slaughtered at different intervals to observe the macroscopic and microscopic development of the
parasite. Immune response was detected at 10 days and was maintained throughout the observation period,
being initially proportional to the load of inoculated eggs and then decreasing over time. Fertile cysts were identified
10 months after inoculation and live onchosphere 500 days after inoculation. Antibody response to E.
granulosus in sheep preceded hydatid fluid formation and was generated by the mobility of the onchosphere.
Early histological identification of fertile cysts indicates that feeding dogs with viscera of young sheep can produce
cycles of infection. Furthermore, the presence of live onchosphere in the liver here found contributes to a
better knowledge of the pathogenesis of this disease it could be hypothetically considered as a cause for the
repeated surgeries necessary in man after the extirpation of a hydatid cyst.
Key words: Echinococcosis; Sheep; Immune response; Pathophysiology
La equinococcosis quística es una zoonosis parasitaria
producida por un cestode, Echinococcus granulosus,
cuyo ciclo de vida incluye un hospedero definitivo
carnívoro (principalmente el perro) y un hospedero
intermediario ungulado (principalmente ovino). Los animales
herbívoros y las personas se infectan a partir de
la ingestión de huevos de E. granulosus. En el intestino
delgado los huevos eclosionan, las oncósferas resultantes
penetran en los capilares y migran en su mayor
parte al hígado o pulmón en donde se desarrollará la
forma larval o quiste hidatídico el cual puede causar seria
morbilidad.
La forma larval o metacestode que se desarrolla en el
ovino es típicamente unilocular, pleomórfica, llena de fluido
y con una compleja estructura consistente en una
membrana germinal interna, compuesta por células de
núcleo circular u ovalado y una membrana cuticular,
acelular y elástica (externa), rodeada por una membrana
adventicia y fibrosa producida por el hospedero. El quiste
hidatídico es fértil cuando presenta protoescólices y
es viable cuando los protoescólices están vivos1,2.
Existen varias fuentes de estimulación antigénica para
el hospedero con capacidad de producir anticuerpos: la
exposición a la oncósfera infectante, el desarrollo subsiguiente
de quistes inmaduros y el desarrollo de quistes
fértiles1. Establecido el metacestode con su capa laminar,
los antígenos localizados en la membrana germinal,
en el líquido hidatídico y en los protoescólices quedan
secuestrados dentro del quiste hidatídico cesando la
estimulación para el hospedero. La salida de macromoléculas
a través de microfisuras de la capa laminar del
metacestode maduro constituye la segunda fuente de
estimulación para el hospedero2,3.
En el ovino, la respuesta inmune a la infección por E.
granulosus ha sido poco estudiada1. Así, el objetivo del
presente trabajo es aportar nueva información sobre la
respuesta de anticuerpos antiantígeno total y antiantígeno
B en ovinos experimentalmente infectados y analizar la
respuesta inmune en relación al estado evolutivo de la
oncósfera y al desarrollo del metacestode.
Materiales y métodos
Se dosificaron 245 perros de áreas endémicas de la Provincia
de Río Negro y 20 de la Provincia de Buenos Aires con
el tenífugo bromhidrato de arecolina. La materia fecal eliminada
fue depositada en bandeja de fondo oscuro y los
especímenes de E. granulosus presentes fueron aspirados y
alojados en tubos de ensayo con 5 ml de solución fisiológica
adicionada de penicilina. Se conservaron a una temperatura
de 8-10 °C a razón de dos especímenes adultos y grávidos
por tubo de ensayo (estimado en 1000 huevos de E. granulosus),
obtenidos de un solo perro. Se remitieron muestras
de los cestodes al Instituto Nacional de Microbiología Carlos
Malbrán para determinación de cepas.
Se utilizaron tres dosis diferentes de inóculos: dosis baja
(2000 huevos, 4 proglótidos maduros), dosis media (4000
huevos, 8 proglótidos maduros) y dosis alta (20 000 huevos,
40 proglótidos maduros). Los ovinos fueron inoculados por
medio de una sonda nasogástrica con lavado posterior con
agua en abundancia.
Se seleccionaron dos grupos de animales: a) grupo de
inoculación experimental: 23 ovejas de 2 a 4 años de edad y
b) grupo control: 15 animales sin inocular.
Los dos grupos de animales fueron clasificados como libres
de equinococcosis quística mediante una evaluación
serológica 15 días antes de la inoculación. Todos los animales
presentaron valores de densidad óptica por debajo del
nivel de corte para enzimo inmuno ensayo (EIE) con tres preparaciones
antigénicas: líquido hidatídico total (EIE.LHT), fracción
purificada de líquido hidatídico total (EIE.S2B) y fracción
lipoproteica purificada (EIE.B), acorde a técnicas descriptas4.
Se seleccionaron aleatoriamente los animales a ser inoculados.
Ocho (34.8%) de éstos recibieron una carga baja de
huevos de E. granulosus, 9 animales (39.1%) una carga
media y otros 6 animales (26.1%) una carga alta.
Se efectuaron extracciones de sangre pre-inoculación y
luego sucesivamente a los 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 210,
270, 360 y 500 días posteriores a la inoculación.
El suero se extrajo mediante centrifugación y se conservó refrigerado a 5-8 °C hasta su remisión al laboratorio antes
de las 48 h en donde se mantuvieron a -20 °C hasta su
procesado mediante EIE con las tres preparaciones
antigénicas.
Se seleccionaron aleatoriamente 10 animales a los que se
les practicó necropsia a los 60, 120, 240, 300, 360 y 500 días
posteriores a la inoculación para observar macroscópicamente
el crecimiento del metacestode y, mediante histología, la instalación
y crecimiento de la oncósfera y del metacestode
hasta su evolución a la fertilidad. Los ovinos se sacrificaron
de acuerdo a recomendaciones de manejo ético5.
La estimación de las diferencias estadísticas se efectuó con chi cuadrado de asociación o chi cuadrado de Pearson,
(según correspondiera) utilizándose el software EPIDAT 3.0,
fijándose en p = 0.05 el límite de significación.
Resultados
En los ovinos inoculados se observó que EIE.LHT alcanzó el valor de corte a los 20 días posteriores a la inoculación, y a partir de los 30 días se mantuvo por encima del valor de corte hasta 500 días después de la inoculación. A los 270 días el valor promedio de la respuesta de anticuerpos se expresó por debajo del nivel de corte (Fig. 1-A).
Fig. 1.- Valor medio de la respuesta de anticuerpos en EIE
con diferentes preparaciones antigénicas (1-A): líquido
hidatídico total (LHT), (1-B): fracción purificada de LHT
(S2B) y (1-C): fracción lipoproteica purificada (EIAB) durante
500 días en ovinos experimentalmente infectados
con E. granulosus.
La respuesta inmunológica con el EIE.S2B superó el
valor de corte a los 10 días posteriores a la inoculación,
manteniéndose por encima de dicho valor durante todo
el período de observación.(Fig. 1-B).
El EIE.B alcanzó el valor de corte a los 10 días posteriores
a la inoculación, presentando mayor variabilidad
en la respuesta a lo largo del período de observación,
incluyendo un resultado por debajo del valor de corte a
los 150 días posteriores a la inoculación (Fig. 1-C).
Dos (8.6%) animales se mantuvieron negativos a todas
las pruebas serológicas hasta su sacrificio a los 300
días de su inoculación, mientras que 1 (4.3%) animal inoculado
permaneció negativo durante el período de observación
sólo a antígeno B. El resto (91.4%) de los animales
inoculados presentaron con los EIE.LTH y EIE.S2B
al menos una determinación serológica por encima del
valor de corte durante el período de observación. La respuesta
individual más tardía en los animales seropositivos
con EIE.LHT se identificó a los 310 días posteriores a la
inoculación y con EIE.S2B a los 360 días.
El grupo control mantuvo siempre con las tres preparaciones
antigénicas valores promedio por debajo del
valor de corte, resultando las diferencias estadísticamente
significativas en relación al grupo inoculado (p: 0.0000)
(Fig. 1).
En relación a las dosis aplicadas, las diferencias a lo
largo del período de observación resultaron estadísticamente significativas (Chi cuadrado de Pearson
p: 0.0000 para EIA.LHT, EIA.S2B y EIA.B). La respuesta
resultó proporcional a la carga de huevos inoculada (mayor
respuesta a mayor dosis) comparando 20 000 huevos
en relación a 2000 y 4000 huevos, no así en la comparación
entre 2000 y 4000 huevos en que la respuesta
fue proporcionalmente mayor con 2000 huevos y
estadísticamente significativa (Chi cuadrado de Pearson
p: 0.0000 ) (Fig. 2).
Fig. 2.- Valor medio de la respuesta de anticuerpos en EIE
con diferentes preparaciones antigénicas (2-A): líquido
hidatídico total (LHT), (2-B): fracción purificada de LHT
(S2B) y (2-C): fracción lipoproteica purificada (EIAB) durante
500 días en ovinos experimentalmente infectados
con E. granulosus de acuerdo al número de huevos inoculados
(2000, 4000 y 20 000 huevos).
En el primer animal necropsiado, a los 60 días posteriores
a la inoculación, no se observaron formaciones
macroscópicas compatibles con equinococcosis. A los
120 días posteriores a la inoculación se observaron en
un animal inoculado con 2000 huevos, en total 15 formaciones
visibles macroscópicamente compatibles con
equinococcosis (11 en pulmón y 4 en hígado) de 2 a 3
mm de diámetro.
A los 240 días posteriores a la inoculación se observó en un animal inoculado con 2000 huevos la presencia en
pulmón e hígado de quistes superficiales e intraparenquimatosos
de 2.5 a 3 mm de diámetro, (2 con contenido
líquido) mientras en otro inoculado con 20 000 huevos
no se observaron formaciones visibles compatibles con
hidatidosis.
A los 300 días posteriores a la inoculación de 2000
huevos, se observaron en 2 animales un total de 10 y 66 quistes respectivamente, de 3 mm a 4 cm de diámetro en
pulmón e hígado, mientras que en un animal inoculado
con 4000 huevos no se observaron formaciones macroscópicas
compatibles con equinococcosis.
En los animales necropsiados a los 360 días posteriores
a la inoculación se observaron, con 4.000 huevos,
quistes de hasta 1.5 cm, con líquido hidatídico, mientras
que en otro inoculado con 20 000 huevos se observaron
630 formaciones visibles macrocópicamente compatibles
con hidatidosis.
A los 500 días posteriores a la inoculación de 4000
huevos se observaron 184 quistes de hasta 1.3 cm.
En los estudios histológicos, a los 60 días posteriores
a la inoculación se observaron en pulmón oncósferas vivas
en distinto estado de desarrollo, y algunas muertas,
de localización peribronquial, peribronquiolar y perivascular
en grandes vasos, mientras que en el hígado se
observaron oncósferas vivas en localización centrolobulillar
y portal.
A los 120 días se observaron quistes en formación
viables, quistes alterados por inflamación, otros viables
y uno con vesículas hijas.
A los 240 días se observó en el pulmón una gran zona
de necrosis coagulativa y oncósferas peribronquiales vivas.
En el hígado se observaron grandes áreas de necrosis
coagulativa y oncósferas muertas.
A los 300 días se observó en hígado y pulmón presencia
de oncósferas vivas, incluso en animales negativos
a la necropsia. Se observaron quistes fértiles en pulmón
con formación de protoescólices.
A los 360 días se observaron quistes en hígado y pulmón
con membrana prolígera y otros en vías de contaminación
(leve infiltración de células inflamatorias que
invaden la periferia del quiste, sin ocuparlo totalmente) y
oncósferas rodeadas de células de la inflamación. En
bazo se observó un quiste fértil con protoescólices vivos
en su interior y 2 oncósferas periarteriales.
A los 500 días se observaron quistes con membrana
prolígera y oncósferas vivas.
La proporción entre huevos inoculados y quistes formados
tuvo un rango de 0-200 huevos por quiste (Tabla 1).
TABLA 1.- Resultados de necropsias y estudios histológicos en ovinos experimentalmente infectados
con E. granulosus
quistes fértiles (con protoscolices)
**: presenta membrana prolígera
Todos los E. granulosus enviados al Instituto Nacional de Microbiología Carlos Malbrán resultaron cepa Ovina G1.
Discusión
En el presente trabajo se ha seguido el desarrollo de la
oncósfera, su transformación en metacestode y su crecimiento
hasta alcanzar capacidad reproductiva, determinada
por la identificación de protoescólices mediante
necropsias y estudios histológicos efectuados en animales
adultos experimentalmente infectados.
La respuesta inmune detectada es consecuente con
estudios previos que indican que la oncósfera produce
secreciones para facilitar su penetración en el organismo
y que estas secreciones, además, protegen al parásito
contra las defensas del organismo mientras se desarrolla
la membrana laminar6. La respuesta inmune se mantuvo
durante los 500 días posteriores a la inoculación.
La respuesta de anticuerpos fue detectada en forma
precoz, lo cual confirma experiencias previas, que con
EIE detectaron la respuesta de anticuerpos más temprana
a las dos semanas posteriores a la infección7, mientras
que con doble difusión en gel de agar recién identificaron respuesta de anticuerpos a los 112 y 120 días posteriores
a la infección respectivamente8, 9.
En relación a la dosis infectante, estudios previos identificaron
una correlación positiva entre sensibilidad del
EIE y dosis infectante, especialmente entre animales inoculados
con 100 y 1000 huevos de E. granulosus en relación
a aquellos inoculados con 10 huevos7. En la presente
experiencia esa asociación sólo se identificó con
una alta carga de huevos inoculados.
Se observó que la respuesta de anticuerpos a la infección
por E. granulosus en el ovino es anterior a la producción
de líquido hidatídico y evidencia que la activación,
movilidad e instalación en los tejidos de la oncósfera genera
respuestas del sistema inmunitario del hospedero.
Así, muchas reacciones serológicas tanto en el ovino
como eventualmente en el hombre, podrían ser clasificadas
como falsos positivos ante la imposibilidad de localizar
un quiste hidatídico en el hospedador, pero pueden
resultar verdaderas infecciones por E. granulosus en
estado de oncósfera o de fase temprana de desarrollo
del metacestode.
La proporción de quistes desarrollada fue directamente
proporcional a la dosis de huevos inoculados (hasta 16
quistes con dosis de 2000 huevos, hasta 196 quistes con
dosis de 4000 huevos y hasta 630 quistes con dosis de
20000 huevos), resultado que confirma experiencias previas10 que establecieron en animales experimentalmente
infectados que la edad no tenía significación para el establecimiento
de la infección, aunque sí la dosis y la susceptibilidad
individual.
Los quistes se transformaron en fértiles por presencia
de protoescólices a los 300/360 días posteriores a la inoculación.
En ovinos de Libia se encontraron quistes fértiles
recién a los 428/611 días posteriores a la infección11,
mientras que en Nueva Zelanda no identificaron fertilidad
en quistes hidatídicos ovinos hasta los 2 años posteriores
a la infección10.
Estos hallazgos indican que la alimentación de perros
con vísceras crudas de animales jóvenes puede generar
ciclos de infección con desarrollo de parásitos adultos en
el perro, contrariamente a lo supuesto hasta el momento.
La identificación de oncósferas vivas en vísceras a
los 300 y 500 días posteriores a la inoculación, y en presencia
de quistes hidatídicos formados, es un hallazgo
no descrito hasta el presente. Su significado fisiopatológico
debería ser cuidadosamente evaluado.
La presencia de oncósferas latentes podría resultar
de un freno inmunitario generado por un metacestode
desarrollado. Se ha supuesto que esta situación era generada
en condiciones naturales por la inmunidad adquirida
con posterioridad a la primer ingestión de huevos,
inhibiendo el desarrollo de oncósferas resultantes
de subsiguientes infecciones en un medio natural con
oferta permanente y elevada de huevos. Los hallazgos
de la presente experiencia indican que esta inmunidad o
modulación inmune limitante del crecimiento de oncósferas
puede ser generada a partir de una sola infección10,
12, 13.
Estos aspectos resultan relevantes para una mejor
comprensión de las respuestas al tratamiento en el hombre.
En casos humanos tratados quirúrgicamente se han
señalado tasas de reoperación del 2% al 25% en programas
de seguimiento longitudinal, atribuibles a una no
completa extirpación del quiste o a la presencia de quistes
no detectables previamente o a reinfecciones. En
general, estas teorías no explican acabadamente el fenómeno
de las reoperaciones, en tanto que en la actualidad
las técnicas quirúrgicas están sumamente desarrolladas
al igual que los métodos sensibles de diagnóstico
por imágenes.
De acuerdo a lo observado en el presente trabajo, esta
situación podría ser explicada por el crecimiento de
oncósferas latentes al desaparecer por la extirpación del
quiste los procesos de modulación de la respuesta inmune
generados por el metacestode.
Se ha observado en programas de seguimiento
longitudinal que portadores de quistes hidatídicos tratados
con albendazol no desarrollaron nuevos quistes
hidatídicos. Esta situación podría ser generada por el
sostenimiento de la modulación inmune dado por la permanencia
de un quiste hidatídico muerto por efecto de la
droga14 o directamente por la acción parasiticida del
albendazol sobre las oncósferas.
Así, la identificación de oncósferas vivas en tejido
hepático a los 500 días posteriores a la inoculación permite
explicar razonablemente las respuestas observadas
en estudios longitudinales en el hombre como consecuencia
de los distintos tratamientos aplicados.
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Recibido: 31-1-2008
Aceptado: 24-2-2009