ARTÍCULO ESPECIAL
La proteína verde fluorescente ilumina la biociencia
María Inés Pérez Millán, Damasia Becú-Villalobos
Instituto de Biología y Medicina Experimental. IBYME CONICET, Buenos Aires
Dirección postal: Dra. Damasia Becu-Villalobos, IBYME, Vuelta de Obligado 2490, 1428 Buenos Aires Fax: (54-11) 4783-2864 e-mail: dbecu@dna.uba.ar
Resumen
La proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en inglés, Green Fluorescent Protein) es una
proteína producida por la medusa Aequorea victoria que emite bioluminiscencia en la zona verde
del espectro visible. El gen que codifica esta proteína ha sido clonado y se utiliza habitualmente en biología
molecular como marcador. Los descubrimientos relacionados a la GFP merecieron el Premio Nobel de Química
2008, en conjunto a los tres investigadores, Dres Shimomura, Chalfie y Tsien que participaron escalonadamente
en dilucidar la estructura y función de la proteína. El Dr. Shimomura descubrió y estudió las propiedades de
GFP, el Dr. Chalfie usando técnicas de biología molecular logró introducir el gen que codificaba para la GFP en
el ADN del gusano transparente C. elegans, e inició la era de GFP como marcador de procesos en células y
organismos. Finalmente el Dr. Tsien modificó la estructura de la proteína para producir moléculas que emiten
luz a distintas longitudes de onda, extendiendo la paleta de colores de las proteínas. Las proteínas fluorescentes,
entre las cuales se encuentra la GFP, son muy versátiles y se utilizan en diversos campos como la microbiología,
ingeniería genética, fisiología, e ingeniería ambiental. Permiten ver procesos previamente invisibles, como
el desarrollo de neuronas, cómo se diseminan las células cancerosas, o la contaminación de agua con arsénico,
por mencionar algunos usos. Con la obtención de proteínas de muchos colores complejas redes biológicas
pueden ser marcadas diferencialmente, lo que permite visualizar la biología celular en acción.
Palabras clave: GFP; Bioluminiscencia; Aequorina; Cre/LoxP
Abstract
The Green Fluorescent Protein that glows in Bioscience Green fluorescent protein (GFP) is a
protein produced by the jellyfish Aequorea victoria, that emits bioluminescence in the green zone
of the visible spectrum. The GFP gene has been cloned and is used in molecular biology as a marker. The three
researchers that participated independently in elucidating the structure and function of this and its related proteins,
Drs. Shimomura, Chalfie and Tsien were awarded the Nobel Prize in Chemistry 2008. Dr. Shimomura discovered
and studied the properties of GFP. Using molecular biological techniques, Chalfie succeeded in introducing the
GFP gene into the DNA of the small, almost transparent worm C. elegans, and initiated an era in which GFP would
be used as a glowing marker for cellular biology. Finally, Dr.Tsien found precisely how GFP's structure produces
the observed green fluorescence, and succeeded in modifying the structure to generate molecules that emit light
at slightly different wavelengths, which gave tags of different colors. Fluorescent proteins are very versatile and
are being used in many areas, such as microbiology, biotechnology, physiology, environmental engineering,
development, etc. They can, for example, illuminate growing cancer tumours; show the development of Alzheimer's
disease, or detect arsenic traces in water. Finding the key to how a marine organism produces light unexpectedly
ended up providing researchers with a powerful array of tools with which to visualize cell biology in action.
Key words: GFP; Bioluminiscence; Aequorin; Cre/LoxP
La proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas
en inglés, Green Fluorescent Protein) es una proteína
producida por la medusa Aequorea victoria, que emite
bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. El
gen que codifica esta proteína, que ya ha sido clonado,
se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador1.
El descubrimiento y estudio de GFP representó un enorme avance para los investigadores, amplía la
capacidad del microscopio óptico, y otorga una nueva
dimensión visible al ojo humano.
Los descubrimientos relacionados a la GFP de Osamu
Shimomura, Martin Chalfie, y Roger Y. Tsien merecieron
el Premio Nobel de Química 2008, otorgado en partes
iguales a los tres, "por el descubrimiento y desarrollo de
la proteína verde fluorescente, GFP". Los investigadores
que participaron escalonadamente en dilucidar la estructura
y función de la proteína, nunca colaboraron directamente
entre ellos, ni siquiera el estudio de la GFP era el
principal foco de sus carreras científicas, sin embargo,
de las contribuciones de los tres surgió el uso de esta
proteína que sinergizó con los trabajos de miles de científicos.
El financiamiento fue a veces difícil, ya que los estudios
de ciencia básica de organismos como las medusas
no era un tema atractivo ni prometedor para las agencias
de financiamiento, por lo que el premio otorgado refuerza
el reconocimiento a la importancia de la ciencia básica
como el fundamento para beneficios prácticos tanto para
la salud como la economía.
A pesar que la llamada química "verde" está de moda
en la comunidad de químicos, ningún esfuerzo de los
mismos ha podido igualar las reacciones que coordina
un solo gen de esta medusa. La activación de este gen
activa 238 condensaciones, una ciclización, y una oxidación;
en pocos minutos en agua aireada, con un solo producto
lateral tóxico, y con un rendimiento de 100% de un
producto muy útil que fluoresce: la GFP2. Los corales producen
proteínas fluorescentes amarillas y rojas con una
química parecida. Esto es importante en el contexto del
equilibrio precario en que están los corales debido a la
acidificación y calentamiento de los océanos.
Historia del descubrimiento
Los descubrimientos que merecieron el Premio Nobel en
Química 2008 son un ejemplo de cómo la investigación
básica en un área científica puede muchas veces conducir
a aplicaciones en otra. En este caso, descifrar el mecanismo
de producción de luz por parte de un organismo
marino, proporcionó a los investigadores una poderosa
variedad de herramientas con las cuales visualizar la biología
celular en funcionamiento.
La historia comienza en los años sesenta cuando
Osamu Shimomura, en la Universidad de Nagoya, Japón,
investiga el fenómeno de bioluminiscencia, i.e. las
reacciones químicas dentro de organismos vivos que producen
luz. Años más tarde, en EE.UU, estudiando la
medusa Aequorea victoria identificó los órganos de luz
que eran responsables de la fluorescencia azul que emitía,
y junto a Frank Johnson, de la Universidad de Washington,
aisló una proteína bioluminiscente dependiente
del calcio, a la que llamaron aequorina, nombre derivado
de la medusa con la que trabajaban3, 4. Esta proteína
emite fluorescencia en la zona azul del espectro, pero en
la medusa emitía luz verde. Profundizando estos estudios,
Shimomura logró descubrir que la luz azul emitida
por aequorina era absorbida por una segunda proteína
(más tarde llamada proteína verde fluorescente o GFP),
la que a su vez re-emitía luz verde2. Esta capacidad de la
GFP era intrínseca a su estructura, y ocurría sin necesidad
de factores adicionales.
Shimomura, nacido en Kyoto en 1928, trabajó desde
1980 hasta su jubilación, en 2001, en el Laboratorio de
Biología Marina en Woods Hole, Massachusetts, donde
es profesor emérito. Siempre mantuvo su ciudadanía japonesa.
En 1988 Martín Chalfie, de la Universidad de Columbia,
Nueva York, tomó conocimiento de la existencia de
GFP y comprendió que su capacidad para fluorescer en
forma independiente podría convertirla en un marcador
celular ideal para el estudio de los organismos que él realizaba.
Usando técnicas de biología molecular logró introducir
el gen que codificaba para la GFP en el ADN del
gusano transparente Caenorhabditis elegans5. De esta forma
las células de los gusanos producían GFP y emitían
luz verde, sin necesidad del agregado de componentes
adicionales, y sin daño para el gusano. Este fue el primer
paso, a partir de entonces se comprendió que se podría
fusionar el gen que codificaba para la GFP a genes de
otras proteínas en estudio, abriendo de este modo enormes
posibilidades para el seguimiento de la localización
de proteínas específicas en organismos vivos2, 6.
La GFP como herramienta en biología celular fue rápidamente
incorporada por muchos investigadores. Roger
Y. Tsien, investigador de origen chino y profesor en la
Universidad de California, en San Diego, vislumbró la posibilidad
de extender la paleta de colores de las proteínas.
Tsien estudió cómo la estructura de la GFP producía la
fluorescencia verde, y luego modificó dicha estructura para
producir moléculas que emitían luz a distintas longitudes
de onda, y produjo marcadores de distintos colores7. Por
otro lado, con su grupo agregaron nuevas moléculas
fluorescentes provenientes de otras fuentes naturales a
su colección de marcadores que continúa en expansión.
Avances en la tecnología para obtener nuevas proteínas fluorescentes
Con el reconocimiento de los beneficios y la potencialidad
de las proteínas fluorescentes ha comenzado una
carrera para producir versiones nuevas, más brillantes,
que cubran un amplio rango del espectro, con foto-estabilidad
aumentada, reducida oligodimerización, e insensibilidad
a los cambios de pH8. La GFP salvaje fue rápidamente
modificada para producir variantes que emiten
en regiones del azul (BFP), ciano (CFP) y amarillo (YPF)2,
9-10, , pero las regiones naranja y roja del espectro no se
han podido lograr con la GFP de la Aequorea, y fueron
sorprendentemente elusivas hasta el descubrimiento de
la primera proteína fluorescente roja en un coral no
bioluminiscente, la llamada DsRED (por Desired RED
protein)11. El grupo de Tsien desarrolló proteínas más
pequeñas a partir de ésta, y luego una serie de proteínas
con nombres de frutos, como la mPlum, mCherry,
mStrawberry, mOrange y mCitrine de acuerdo al color
de su brillo12. Posteriormente otros investigadores y compañías
han contribuido con nuevos colores a esta resplandeciente
gama.
Por otro lado, las proteínas originales han sido modificadas
para mejorar su funcionamiento8. Uno de los resultados de estas mejoras es la GFP mejorada (o EGFP,
por sus siglas en inglés, Enhanced Green Fluorescent
Protein). Con tan amplia paleta, complejas redes biológicas
se marcan con distintos colores, permitiendo observar
procesos múltiples, circunstancia impensable hasta
no hace mucho.
Estructura y espectro de emisión
La estructura de la proteína verde fluorescente es de 238
aminoácidos, que forman once cadenas beta, cuyo conjunto
forma un cilindro, en el centro del cual se encuentra
una hélice alfa13. Contiene un cromóforo especial (constituido
por los aminoácidos 65, 66 y 67), un grupo químico
que absorbe y emite luz. Cuando la luz UV o luz azul
impacta sobre el cromóforo, éste toma la energía de la
luz y se excita. En la fase siguiente, el cromóforo se libera
de la energía emitiendo luz en longitud de onda verde.
Una característica importante es que la GFP no necesita
aditivos para brillar, en contraste con la aequorina y
otras proteínas bioluminiscentes. Si así fuera, moléculas
energéticas deberían ser inyectadas en las células en
forma constante. En cambio, es suficiente con irradiar la
GFP con luz UV o azul para que emita fluorescencia.
La GFP original de la medusa posee dos picos de excitación:
uno menor, a 475 nm, y uno mayor, a 395 nm.
Su pico de emisión está a 509 nm, en la zona verde del
espectro.
La DsRED es más grande y más pesada que la GFP.
Consiste de cuatro cadenas aminoacídicas en lugar de
una, y no es tan versátil como marcador de procesos biológicos.
El grupo de investigación de Tsien resolvió este
problema rediseñando la DsRED de forma de lograr proteínas
estables, fluorescentes y de una sola cadena de
aminoácidos14.
Usos
Las proteínas fluorescentes, entre las cuales se encuentra
la GFP, son muy versátiles y se utilizan en diversos
campos como la microbiología, ingeniería genética y fisiología.
Permiten ver procesos previamente invisibles,
como el desarrollo de neuronas, cómo se diseminan las
células cancerosas, el desarrollo de la enfermedad de
Alzheimer, el crecimiento de bacterias patogénicas, la
proliferación del virus del SIDA, entre otros.
Por ejemplo, células cancerosas que expresan DsRED
pueden implantarse en ratones salvajes, o transgénicos
con expresión de GFP en todas las células. Cuando los
ratones son iluminados con luz azul las células cancerosas
pueden ser fácilmente detectadas y seguidas (en los
ratones verdes o normales) permitiendo la localización
de las metástasis y el fenómeno de angiogénesis en tumores
en proliferación. Por otro lado, el modelo permite
seguir la evolución comparativa de las metástasis en presencia
o ausencia de distintos fármacos. Esto sería sólo
uno de los múltiples usos que se le están asignando a
estas proteínas.
La GFP también tiene una importancia especial en la
biología del desarrollo: si se introduce en un estadio temprano
de un embrión, se puede seguir la evolución de
las primeras células, estructuras y órganos.
Por otro lado, la GFP y proteínas similares tienen aplicaciones
biotecnológicas, incluyendo la detección de arsénico
en los pozos de agua. Por ejemplo, en partes del
sudeste asiático el arsénico presente naturalmente en el
agua está envenenando a miles de personas. Los investigadores
han modificado genéticamente bacterias resistentes
al arsénico que fluorescen en presencia de arsénico15,16.
También se han modificado organismos que
fluorescen en presencia de trinitrotolueno o metales pesados
como el cadmio y zinc17,18.
Ya se han generado monos, gusanos, algas, Escherichia
coli, y cerdos con GFP en su genoma, que fluorescen19.
Y hasta se han fabricado juguetes con GFP que
brillan en la oscuridad.
El arco iris cerebral o brainbow
Tres de estas proteínas han sido usadas en un experimento espectacular. Fueron modificados genéticamente ratones para producir determinadas cantidades de proteínas con colores amarillo, cian y rojo en células nerviosas individuales del cerebro; combinación de colores semejante a la que usan las impresoras de computadoras. El resultado fue un cerebro que brillaba con noventa tonalidades diferentes. Los investigadores podían así seguir las fibras nerviosas de células individuales dentro de una densa red en el cerebro. Las imágenes fueron llamadas brainbow, el arco iris cerebral20. Recorren internet con el mismo éxito que los videos de YouTube.
Nuestra experiencia usando transgénicos que expresan EGFP
Es interesante mencionar el uso de ratones marcadores,
o biosensores, que validan escisiones de ADN, y que
son utilizados mayormente en la generación de ratones
transgénicos específicos por la tecnología de Cre/LoxP21.
La técnica convencional de animales knockout ha sido
muy útil para descifrar las bases moleculares y celulares
de comportamientos, y genera animales que heredan
deleciones génicas en todas las células del organismo22-24. Sin embargo, una deleción no restringida en tiempo o
región, el knockout global, puede conducir a graves defectos
en el desarrollo y muerte prematura, que impedirían
el análisis de las funciones de los genes post desarrollo.
Además, hace difícil la interpretación de fenotipos anormales atribuyéndolos a un tipo particular de tejido o
célula, ya que todas las células están mutadas. Por lo
tanto, para mejorar la utilidad de la tecnología de animales
knockout, se han desarrollado técnicas que imponen
restricciones temporales o regionales, o ambas, a la
deleción génica: el knockout restringido. Una manera para
lograrlo en un tipo de tejido o célula es aprovechar el
sistema Cre/loxP, un sistema de recombinación sitio específica
del fago P1, en el cual la enzima Cre recombinasa
cataliza la recombinación de ADN al reconocer una secuencia
específica llamada loxP de 34 pares de bases.
Estas secuencias loxP pueden ser artificialmente insertadas
en el genoma de células madre embrionarias por
recombinación homóloga, de tal forma que flanqueen uno
o más exones del gen de interés (llamado gen "floxeado"),
lo que producirá una escisión precisa de ADN sin cortar
otras partes del genoma. Se generan ratones transgénicos
homocigotas para el gen "floxeado" por técnicas
convencionales, y se cruzan con un segundo ratón transgénico
que contiene el transgén Cre bajo el control de un
promotor transcripcional, tejido o célula específico. En la
progenie homocigota para el gen "floxeado" y que porte
el transgen Cre simultáneamente, se producirá recombinación
Cre/LoxP, y por lo tanto se delecionará el gen "floxeado", y esto sucederá solamente en aquellos tipos
celulares en los cuales el promotor asociado a Cre sea
activo. El desafío radica en la generación de ratones que
expresen Cre bajo promotores específicos, y para ello
un paso esencial es la validación de la actividad in vivo de la recombinasa Cre. Para ello se usan ratones reporteros.
Uno de los más usados es el ratón ROSA-EGFP25.
Estos ratones tienen el gen de la proteína verde fluorescente
(EGFP) insertado en el locus Gt(ROSA)26Sor. La
expresión de esta proteína está bloqueada por un fragmento
STOP "floxeado" por secuencias loxP y ubicado
entre la secuencia de EGFP y el promotor Gt (ROSA)
26Sor. Por lo tanto, EGFP sólo se expresará cuando actúe
la recombinasa Cre cortando el fragmento de STOP.
Al cruzar los ratones que expresan Cre bajo el promotor
de prolactina con ratones ROSA-EGFP, hemos logrado
que se produzca la recombinación homóloga de los genes "floxeados", la remoción del codón STOP y la expresión
de la EGFP en aquellas crías positivas para ambos genes
(Cre+-EGFP+)21. La utlización de estos ratones reporteros
fue un paso importante de validación de nuestro sistema,
para la posterior obtención de un ratón con deleción
específica del receptor dopaminérgico D226.
Por otro lado, usando ratones transgénicos que expresan
EGFP, en el INGEBI-CONICET se han estudiado
procesos de neurogénesis en cerebro, y la regulación
del apetito, entre otros. En 2004 se identificaron neuronas
recién nacidas en el cerebro de un animal adulto y se
siguió la evolución de células nerviosas durante sus primeras
dos semanas de vida, el tiempo que demoran en
madurar y convertirse en adultas27. Las neuronas identificadas
por la GFP eran células granulares, un tipo celular
del hipocampo cerebral que forma muchas conexiones
y que participa especialmente en procesos de memoria,
más que nada de memoria espacial. El modelo
confirmó dos cuestiones características de la neurogénesis
adulta: que ésta disminuye con la edad (es decir,
los ratones más jóvenes tienen más neuronas jóvenes) y
que cuanta más actividad física desarrolla el animal de
laboratorio más neurogénesis se produce. El hallazgo
abonaría la idea que un mayor nivel de actividad motora
aumenta la producción de neuronas, a diferencia del
sedentarismo. Al contrario, el estrés traumático disminuye
la neurogénesis y eso desmejoraría la capacidad de
aprender.
Por otro lado, la creación de un ratón transgénico que
expresa EGFP en neuronas relacionadas al circuito del
apetito, realizada en colaboración entre el INGEBI-CONICET
y el Dr. Malcolm Low, de Portland, Oregon,
permitió dilucidar aspectos del mecanismo de la obesidad28.
Cuando se ingiere un alimento, el cerebro recibe un
mensaje a través de una hormona llamada leptina, luego
de una serie de procesos: absorción, metabolización, síntesis
de proteínas, etcétera. La metodología biotecnológica
logró la identificación de las moléculas del cerebro
que son liberadas por la leptina. Se sabía que el tejido
adiposo secreta la leptina, de allí entra en la circulación
sanguínea, y que el hambre y la saciedad están gobernadas
por el cerebro. Por lo tanto, la hormona periférica
tenía que entrar al cerebro y dar cierta información. No
se sabía bien cómo ocurría esto. El ratón creado expresa
EGFP en neuronas cuando el gen de melanocortinas
es activado. Las melanocortinas son unos potentes
péptidos anorexígenos. Este ratón permitió identificar
neuronas que tienen receptores para leptina y que, cuando
son activados por dicha hormona liberan melanocortinas,
que inducen inmediatamente saciedad.
Patentes
Shimomura, Chalfie y Tsien patentaron las proteínas por
ellos descubiertas y desarrolladas. Para los científicos
que hacen investigación básica su uso es gratuito, no así para las empresas farmacéuticas. Por lo tanto, para los
tres galardonados, en particular para el Dr. Tsien, el descubrimiento
también tuvo un rédito económico.
En relación a la constante creación de ratones
transgénicos que expresan GFP, es importante destacar
que estos ratones no pueden patentarse, porque se utiliza
la GFP que ya posee patente por Clonetech. Los
nuevos transgénicos pueden ser licenciados por el investigador
que los genera, de forma que si alguna empresa
quisiera usarlos, pueda hacerlo mediante el pago
de la licencia.
En conclusión, desde la primera publicación del GFP, hace 46 años, se han conseguido proteínas similares a la GFP, que brillan con los colores del arco iris. Los usos en biología molecular, biotecnología, y medicina se han multiplicado. Y una simple proteína que ha existido en la tierra por más de 160 millones de años saltó a la fama, porque una de sus propiedades más especiales es que los resultados se pueden "ver". Las páginas en Internet con ilustraciones que emplean la GFP son quizás más atractivas que aquellas que utilizan otras metodologías más complejas. El manejo de estas proteínas no ha sido sencillo, ni usarlas es tan sencillo aún, pero el Premio Nobel es bien merecido. Terminamos citando las palabras del Dr. Tsien en su conferencia del banquete del Premio Nobel: "Agradecemos tanto a corales como a medusas, y deseamos que siempre tengan habitats intactos para brillar en la posteridad"29.
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Recibido: 25-3-2009
Aceptado: 7-4-2009