Evaluación inmunológica del tratamiento con benznidazol en la enfermedad de Chagas crónica
Graciela L. Bertocchi1, María G. Álvarez1, Damián Pérez2, Alejandro Armenti1, Rodolfo J. Viotti1, Bruno Lococo1, Marcos Petti1, Miriam Postan2, María C. Albareda2, Susana A. Laucella2, Rick L. Tarleton3
1 Hospital Eva Perón (ex "Dr. Mariano R. Castex"), San Martín, Provincia de Buenos Aires, Argentina
2 Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chabén", Buenos Aires, Argentina
3 Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, Athens, USA
Recibido: 18/10/2007
Aceptado: 15/05/2008
Dirección para separatas: Graciela Luciana Bertocchi Moldes 3878 - (1429) Capital Federal e-mail: gbertocchi@intramed.net.ar
RESUMEN
Para determinar el efecto del tratamiento con benznidazol sobre las células T de memoria específica para Trypanosoma cruzi, se seleccionaron 47 pacientes con tres reacciones serológicas positivas para T. cruzi, sin cardiopatía y edades comprendidas entre los 30 y los 50 años. El tratamiento se realizó con benznidazol en dosis de 5 mg/kg/d por 30 días. Se efectuó una evaluación serológica, inmunológica y clínica pretratamiento (tiempo 0) y a los 2, 6 y 12 meses postratamiento. Posteriormente, los controles se hicieron anualmente. La respuesta de linfocitos T frente a un lisado de amastigotas de T. cruzi se evaluó por la técnica de ELISPOT para IFN-γ. La frecuencia de linfocitos T de memoria productores de IFN-γ específicos para T. cruzi disminuyó significativamente en el grupo tratado (n = 33) versus el no tratado (n = 14) 12 meses después del seguimiento. Once de 25 (44%) pacientes que recibieron benznidazol negativizaron la respuesta para IFN-γ. Cuatro de los 11 (36%) pacientes con ELISPOT (+) que negativizaron la respuesta por ELISPOT para IFN-γ también negativizaron la serología convencional a los 2 años postratamiento. Durante el seguimiento no se observaron alteraciones clínicas. Estos hallazgos muestran que el benznidazol es capaz de modular la respuesta celular T de memoria específica para T. cruzi. La medición de la frecuencia de linfocitos T de memoria productores de IFN-γ podría constituir un ensayo más sensible y precoz para determinar el impacto/eficacia del tratamiento específico contra este parásito.
Palabras clave Enfermedad de Chagas; Benznidazol; Linfocitos T; Trypanosoma cruzi
Abreviaturas
HIV Virus de la inmunodeficiencia humana
IFN-γ Interferón gamma
IL-2 Interleucina 2
SUMMARY
Immunological Assessment of Benznidazol Therapy in Chronic Chagas Disease
To determine the effect of benznidazol therapy on memory T cells specific for Trypanosoma cruzi, 47 patients between 30 and 50 years old and three positive serological tests for T. cruzi without cardiopathy were selected. Benznidazol was administered in a dose of 5 mg/kg/d during 30 days. Serological, immunological and clinical assessment was performed at basal (time 0) and at 2, 6 and 12 months following treatment, and once a year thereafter. IFN-γ ELISPOT assay was used to evaluate T cell responses against a T. cruzi lysate obtained from amastigotes. The frequency of IFN-γ - producing memory T lymphocytes specific for T. cruzi was significantly lower in the treatment group (n=33) compared to the control group (n=14) 12 months after the therapy. IFN- γ response became negative in 11 patients in the treatment group (44%). Among these 11 patients, conventional serology also became negative in 4 patients (36%) after 2 years of treatment. No clinical manifestations occurred during follow-up. These findings show that benznidazol is capable of modulating T cell responses specific for T. cruzi. Measuring the frequency of memory T lymphocytes producing IFN-γ might become a more sensitive test to determine earlier the impact and/or efficacy of the specific treatment against this parasite.
Key words: Chagas disease; Benznidazol; Lymphocytes; Trypanosoma cruzi
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es una enfermedad parasitaria
cuyo agente patógeno es un protozoo flagelado,
Trypanosoma cruzi. Este parásito ingresa en el ser
humano por distintas vías: vectorial, transplacentaria,
transfusional, postrasplante y posiblemente digestiva.
Produce parasitemia, anida y se reproduce en los
tejidos, donde induce inflamación y destrucción. Los
órganos especialmente afectados son el músculo cardíaco,
el aparato digestivo y el sistema nervioso. En
América Central y América del Sur son más de 10
millones las personas infectadas. (1)
Aproximadamente el 30% de los individuos infectados
desarrollan miocardiopatía crónica tras un período
indeterminado de una o dos décadas después de
la infección inicial. En el transcurso de este período
se establece una convivencia estable entre el individuo
y el parásito, durante la cual no hay evidencia
clínica de enfermedad. Esto es porque el sistema
inmunológico del huésped controla la infección a través
del control de la replicación del parásito. En ocasiones,
esta estabilidad se pierde y las alteraciones
clínicas sobrevienen, ya sea por la presencia de enfermedades
concomitantes, la administración de drogas
inmunosupresoras o porque la persistencia crónica de
la infección puede inducir agotamiento del sistema
inmune, lo que impide el control adecuado de la infección.
Estas alteraciones incluyen arritmias, trastornos
de conducción, cardiomegalia, insuficiencia
cardíaca, tromboembolia y muerte súbita. (2)
Por la condición intracelular del parásito, la respuesta
inmune celular es crítica para su control. Células
presentadoras de antígenos capturan el antígeno
de la sangre, lo procesan y lo presentan a los linfocitos
T alojados en los ganglios linfáticos. Estos linfocitos
reconocen al antígeno, proliferan y se diferencian en
las distintas poblaciones celulares. Los linfocitos T
"efectores" CD4 y CD8 migran a los tejidos donde se
produce la infección y liberan, entre otros, IFN-γ, capaz
de activar macrófagos. Otra función efectora de
los linfocitos T CD8+ es la lisis de las células
parasitadas. Los linfocitos T "de memoria" se clasifican
en linfocitos T de "memoria central" y linfocitos
T de "memoria efectora". La población de memoria
central está presente una vez que se produjo la depuración
completa del antígeno y secreta preponderantemente
IL-2. La población de memoria efectora,
contrariamente, está presente siempre que haya persistencia
del antígeno y tiene la particularidad de intervenir
con rapidez ante nuevas exposiciones antigénicas
con la producción, preferentemente, de IFN-
γ. Este estudio se realizó sobre la población de células
de memoria efectora específicas para T. cruzi.
La miocardiopatía chagásica evoluciona más
tórpidamente que las miocardiopatías dilatadas de
otras etiologías. (3) El mecanismo fisiopatológico de
la enfermedad es controversial por lo arduo que representa
realizar un seguimiento muy prolongado de
los pacientes, sumado al bajo número de parásitos en
sangre y a la persistencia de anticuerpos circulantes
aun después de la eliminación del parásito. (4) Sin
embargo, se ha reunido evidencia que sostiene que la
persistencia intracelular de T. cruzi en el miocardio
constituye el estímulo para la respuesta inflamatoria
crónica que resulta luego en daño tisular. (5, 6) Se demostró
que el tratamiento antiparasitario es efectivo
en la etapa aguda de la infección. (7, 8) Sin embargo,
su empleo en la etapa crónica es limitado por diversas
razones. (9-13) Una de las principales dificultades es
la evaluación de la eficacia terapéutica. No existen
ensayos confiables para medir la eliminación del parásito
y se requieren períodos muy prolongados para
detectar cura serológica. (14) Se desconoce en extenso
el impacto de la quimioterapia específica para T.
cruzi sobre la respuesta inmune del huésped. (15, 16)
Estudios previos de nuestro grupo demostraron
que los pacientes sin cardiopatía o con cardiopatía leve
presentan niveles mayores de linfocitos T de memoria
efectora específicos para el parásito, en comparación
con los niveles observados en pacientes con cardiopatía
grave. (17) Alrededor del 80% de los pacientes
asintomáticos presentan ELISPOT positivo para
IFN-γ y sólo el 15% de los pacientes crónicamente infectados
que presentan insuficiencia cardíaca muestran
niveles detectables de linfocitos T productores
de IFN-γ. Existe una relación inversa entre el grado
de cardiopatía y el número de linfocitos T de memoria
efectora. Es en estos pacientes con cardiopatía grave
en los que consideramos que su sistema inmunológico
está agotado y no puede responder adecuadamente
a las exigencias de la infección. (18) Dos trabajos
clínicos mostraron beneficio en el seguimiento a
largo plazo de los pacientes tratados con benznidazol.
(9, 19)
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del
tratamiento con benznidazol sobre la respuesta celular
T de memoria específica para T. cruzi en pacientes
en la etapa indeterminada de la enfermedad de Chagas
crónica.
MATERIAL Y MÉTODOS
Selección de la población
La población se seleccionó entre las personas que concurren
a la Sección de Chagas del Hospital Interzonal de Agudos
"Eva Perón", Provincia de Buenos Aires. La reactividad a T.
cruzi se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta,
hemaglutinación indirecta y ELISA. Los pacientes fueron
agrupados de acuerdo con la clasificación de Kuschnir. (20)
Criterios de inclusión
Los criterios de inclusión comprendieron: que tres reacciones
serológicas HAI, IFI, ELISA fueran positivas, edad entre
21 y 50 años, ausencia de cardiopatía de cualquier etiología,
que no se padeciera de hipertensión, diabetes ni
dislipidemia ni de otras enfermedades importantes como
cáncer, artritis, alergias, HIV, las mujeres no debían estar
embarazadas y que los pacientes ingresados en el grupo tratado
hubieran completado el esquema de tratamiento.
Los pacientes aptos se asignaron en forma aleatoria, en
una relación 2/1, a grupo tratado versus no tratado, respectivamente,
previo a la inclusión en este trabajo simple ciego.
Esquema de tratamiento
Se administraron 5 mg/kg/día de benznidazol por vía oral
durante 30 días, tras un período de adaptación de 7 días en
los que la droga se administró en dosis crecientes hasta alcanzar
la dosis deseada. Este esquema lo recomendamos
tradicionalmente a nuestros pacientes (9, 19) sobre la base
de evidencias previas que no mostraron diferencias significativas
respecto de la negativización de la serología cuando
la droga se administró por 30 días o por períodos más prolongados.
Los efectos adversos graves se pueden prevenir si
la dosis acumulativa no excede los 18 g de benznidazol. (10)
Características de la población estudiada
Ingresaron 47 pacientes, 28 mujeres y 16 hombres. Edad
promedio: 41,64 ± 6,2 años + DE. Todos pertenecientes al
grupo 0 de la clasificación de Kuschnir, 33 al grupo tratado,
14 al grupo no tratado.
Control de los pacientes
Se realizaron una evaluación serológica, inmunológica y clínica
al ingreso (tiempo 0) y a los 2, 6 y 12 meses después de
la incorporación, laboratorio de rutina en los controles 0 y
12 meses, electrocardiograma en los controles 0, 2, 6 y 12
meses y radiografía tórax, ergometría y ecocardiograma
(tiempo 0). Posteriormente, los controles se realizaron en
forma anual. Los participantes firmaron un consentimiento
informado. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética
del Hospital Eva Perón y de la Universidad de Georgia.
Obtención de células mononucleares periféricas y suero
Se extrajeron 50 ml de sangre a cada participante mediante
un sistema de colección al vacío con heparina y sin ella. La
sangre heparinizada se sometió a un gradiente de centrifugación para la separación de células mononucleares
periféricas (PBMC). De la sangre extraída sin heparina se
separó el suero luego de permitir su coagulación a 37 °C y
centrifugación a 1.000 × g durante 15 minutos.
Obtención de lisado derivado de amastigotas de T. cruzi
Mediante tres ciclos de congelación-descongelación seguido
por sonicación se obtuvo un lisado proteico derivado de
amastigotas de T. cruzi. (17)
Ensayos de ELISPOT
En microplacas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa
estériles se sembró un anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ
durante 18 horas a 4 °C; 4 × 105 PBMC/pocillo se sembraron
por triplicado y se estimularon con 10 µg/ml del lisado
de amastigotas, o con medio de cultivo por 16 horas a 37 °C
con 5% CO2. (17) Posteriormente se agregó un anticuerpo
anti-IFN-γ biotinilado por 2 horas a temperatura ambiente
y los spots, cada uno representando una célula productora
de IFN-γ, se revelaron utilizando estreptavidina-peroxidasa
seguido por aminoetilcarbazol como sustrato. Los spots se
contaron con un lector de ELISPOT (CTL, USA). La respuesta
se consideró positiva cuando el número de spots fue
igual o mayor de 10 y al menos dos veces mayor al número
de spots obtenidos en el control con medio de cultivo. El
número de linfocitos T específicos para T. cruzi se obtuvo
por la resta del número de linfocitos T obtenidos sin
estimulación al número de linfocitos T obtenidos ante el
estímulo con el lisado. (17)
Análisis estadístico
Los cambios cuantitativos en la respuesta celular se determinaron
por ANOVA por rangos de Friedman. Para comparar
las variaciones de la respuesta celular entre los grupos
tratado y no tratado se utilizó la prueba de Mann-Whitney
U sobre las diferencias postratamiento/pretratamiento de
cada grupo. Para comparar categorías entre grupos se utilizaron
las pruebas de chi cuadrado y Fisher. Se consideró
significativo un valor p = 0,05.
RESULTADOS
Monitoreo de la respuesta celular T de memoria específica
para T. cruzi.
En diferentes infecciones humanas, la presencia
de linfocitos T de memoria central (productores de
IL-2) se asoció con la resolución de la infección, mientras
que la memoria de tipo efectora (productora de
IFN-γ) es característica de infecciones persistentes.
(22-24) La monitorización de la función celular T constituye
una herramienta valiosa para determinar la
actividad de la enfermedad. En este estudio evaluamos
si el benznidazol es capaz de modular la respuesta
inmune celular T de memoria efectora específica
para el parásito en la fase indeterminada de la infección.
Para ello, cuantificamos la frecuencia de
linfocitos T productores de IFN-γ mediante la técnica
de ELISPOT.
La frecuencia de linfocitos T de memoria productores
de IFN-γ específicos para T. cruzi disminuyó
significativamente en el grupo tratado en comparación
con el no tratado, 12 meses después del seguimiento
(Figura 1).
Fig. 1. Efecto del tratamiento con benznidazol sobre la respuesta
celular T de memoria específica para Trypanosoma cruzi en
pacientes con enfermedad de Chagas crónica. El número de
linfocitos T productores de IFN-γ específicos para T. cruzi se determinó por ELISPOT pretratamiento y a los 12 meses postratamiento
con benznidazol. Cada símbolo representa el número
promedio de spots para cada paciente. (*) p < 0,005 Prueba de
Mann-Whitney U sobre las diferencias pretratamientopostratamiento
entre los grupos tratados y no tratados.
De los 33 pacientes que ingresaron en el grupo tratado, 25 (76%) presentaron el ensayo de ELISPOT positivo previo al tratamiento, en tanto que en 8 (24%) fue negativo (Figura 2). El ensayo de ELISPOT se negativizó en 11 de los 25 (44%) pacientes que presentaban ELISPOT positivo antes del tratamiento (8 pacientes a los 12 meses y 3 pacientes a los 24 meses postratamiento), mientras que en ninguno de los pacientes del grupo no tratado se observó negativización de la técnica de ELISPOT observándose niveles de linfocitos T secretores de IFN-γ relativamente estables (Figura 2, Fisher entre el porcentaje de pacientes tratados que negativizan el ELISPOT versus el porcentaje de pacientes no tratados que negativizan el ELISPOT, p < 0,05).
Fig. 2. Evolución de la respuesta celular T de memoria específica
para T. cruzi en pacientes tratados con benznidazol y no tratados.
(*) Prueba de Fisher p < 0,05 (% de negativización en el
grupo tratado versus % de negativización en el grupo no tratado
con ELISPOT (+) al ingreso).
El tratamiento con benznidazol también evidenció algún cambio inmunológico en los pacientes cuya respuesta por ELISPOT era negativa previa al tratamiento, observándose niveles detectables de linfocitos T productores de IFN-γ en 5 de los 8 pacientes que mostraban ELISPOT negativo previo al tratamiento. Estos resultados sugieren que la técnica de ELISPOT podría constituir un ensayo sensible y precoz para determinar el impacto del tratamiento específico para T. cruzi.
Cinética de la respuesta celular T de memoria
efectora en pacientes tratados con benznidazol
Para evaluar la cinética de la respuesta celular, se
determinó también la producción de IFN-γ a los 2 y 6
meses de seguimiento en un grupo de 18 pacientes
(12 pacientes tratados, 6 no tratados). La disminución
observada en el grupo tratado no se evidenció
antes del primer año postratamiento.
En el grupo tratado se constataron dos modalidades
de comportamiento, un grupo presentó aumento
en el número de linfocitos seguido de reducciones progresivas
en su número previo a la negativización; este
ascenso en el número de linfocitos se observó entre
los 2 y 6 meses postratamiento. Otro grupo evidenció
reducciones progresivas en la respuesta hasta su
negativización sin presentar el pico descripto en el
grupo anterior (Figura 3).
Fig. 3. Cinética de la respuesta
celular T de memoria efectora
en pacientes tratados con
benznidazol. La respuesta por
ELISPOT para IFN-γ se midió a
distintos tiempos postseguimiento
en pacientes tratados
con benznidazol y en un grupo
no tratado. Los distintos
gráficos representan el comportamiento
para pacientes
individuales. La frecuencia
de linfocitos T productores de
IFN-γ aumenta entre los 2 y los
6 meses de seguimiento para
disminuir posteriormente
(p < 0,05; columna izquierda),
disminuir paulatinamente
(p < 0,05; columna central) o
no variar (columna derecha)
de acuerdo con lo determinado
por la prueba de rangos de
Friedman.
Relación entre la respuesta por ELISPOT y la
serológica convencional
Cuatro de 33 (12,12%) pacientes que recibieron tratamiento
negativizaron las tres técnicas serológicas convencionales;
1 de ellos a los 12 meses y 3 a los 24 meses
postratamiento. Cuatro de los 11 (36,36%) pacientes
que negativizaron la respuesta por ELISPOT para
IFN-γ también negativizaron la serología convencional
postratamiento.
DISCUSIÓN
En la mayoría de los pacientes, la infección por T. cruzi
pasa inadvertida y unos pocos desarrollan cardiopatía
transcurridos varios años de la infección inicial.
Establecida la cardiopatía, es posible establecer un
pronóstico de progresión de la enfermedad sobre la
base de indicadores clínicos, (25) pero aún es un enigma
la detección de los pacientes que evolucionarán a
la miocardiopatía. Tampoco existen indicadores de
éxito terapéutico en los pacientes crónicamente infectados
por T. cruzi. (9, 14) Sin embargo, la evaluación
del estado inmunológico de los pacientes frente
al parásito evidenció que aquellos en mejores condiciones
clínicas presentan niveles mayores de linfocitos
T de memoria productores de IFN-γ específicos para
T. cruzi con respecto a pacientes que muestran compromiso cardíaco grave. (17) Cuando analizamos los
pacientes del grupo 0 (sin cardiopatía) encontramos
que no todos tenían el mismo comportamiento
inmunológico. La mayoría presentan un mismo perfil
de memoria celular T efectora (productora de IFN-γ e
IL-2) y ausencia de linfocitos productores de IL-2 exclusivamente
(memoria central). (26)
Mientras la memoria de tipo central posee alta
capacidad proliferativa en ausencia del antígeno y
puede persistir por largo tiempo, la memoria de tipo
efectora depende del antígeno para su persistencia y
posee baja capacidad replicativa. (27) Estas evidencias,
sumadas a la observación de que la gravedad de
la enfermedad se asocia con una frecuencia mayor de
linfocitos T CD8+ de memoria totales altamente diferenciados
y apoptóticos que presentan características
senescentes, (18) apoyan la idea de que la infección
crónica por T. cruzi lleva a un agotamiento del
sistema inmune como consecuencia de la persistencia
antigénica. Esto podría afectar la capacidad del sistema
inmune para controlar la infección, con la consecuente
progresión de la enfermedad.
Esta investigación evalúa el impacto del tratamiento
con benznidazol en la etapa crónica de la infección
por T. cruzi sobre la respuesta inmune celular específica
para este parásito. Los resultados muestran que el
tratamiento etiológico para T. cruzi modula la respuesta
celular T de memoria efectora específica para el parásito.
Considerando que la memoria T efectora depende
del antígeno para persistir, el descenso de la respuesta
por ELISPOT para IFN-γ al año postratamiento
serviría como un potencial marcador precoz de la eliminación/
disminución de la carga parasitaria. Si bien
el tiempo de seguimiento no es suficiente para detectar
cambios significativos a nivel de la serología convencional,
hemos observado que los 4 pacientes tratados
con benznidazol que negativizaron la serología convencional
para T. cruzi también nega-tivizaron o disminuyeron
la frecuencia de linfocitos T de memoria
productores de IFN-γ. Esta interpretación también se
apoya en la observación de que el tratamiento fue capaz
de modificar los títulos serológicos para proteínas
recombinantes (Datos no mostrados) para T. cruzi.
El aumento significativo de la población celular T
de memoria productora de IFN-γ entre los 2 y 6 meses
postratamiento, observado en una proporción alta
de los pacientes que negativizaron posteriormente la
respuesta celular, indicaría una liberación mayor de
antígenos parasitarios por acción del benznidazol, estimulando
así la respuesta celular. Esto podría deberse
a una sensibilidad mayor al benznidazol o bien a
una carga parasitaria mayor en estos pacientes, previamente
al tratamiento. Estos hallazgos también
explicarían el aumento de la respuesta por ELISPOT
para IFN-γ observado en los pacientes que presentaban
respuesta negativa antes del tratamiento. Los
resultados concuerdan con observaciones previas en
el modelo murino, al demostrar que la activación del
sistema inmune del huésped por antígenos del parásito
y el IFN-γ endógeno tendrían un papel preponderante
en la eficacia del tratamiento con benznidazol.
(28-30) A largo plazo se podrá evaluar la asociación entre
la respuesta celular y la evolución de la enfermedad
como consecuencia del tratamiento etiológico. El hallazgo
de un efecto positivo del tratamiento sobre la
respuesta inmune celular hacia T. cruzi en la etapa
crónica de la infección podría avalar el uso del tratamiento
en esta etapa. Asimismo, esta investigación
aporta también información valiosa sobre la contribución
de la respuesta inmune celular en el control
del parásito.
En resumen, nuestros hallazgos muestran que el
benznidazol es capaz de modular la respuesta celular
T de memoria específica para T. cruzi. La medición de
la frecuencia de linfocitos T productores de IFN-γ podría
constituir un ensayo más sensible y precoz para
determinar el impacto/eficacia del tratamiento específico
contra este parásito.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Bunge & Born, BID 1728 PICT 38188, National Institutes of Health, (NIH 5P01AI044979), CONICET y FONCYT.
1. World Health Organization. Control of Chagas disease. Report of a WHO Expert Committee. World Health Organ Tech Rep Ser 2002;905:1-109.
2. Manzullo EC, Chuit R. Risk of death due to chronic chagasic cardiopathy. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999;94:317-20.
3. Bestetti RB, Dalbo CM, Freitas OC, Teno LA, Castilho OT, Oliveira JS. Noninvasive predictors of mortality for patients with Chagas' heart disease: a multivariate stepwise logistic regression study. Cardiology 1994;84:261-7.
4. Cancado JR. Tratamento especifico. En: Cancado JR, Chuster M, editores. Cardiopatía Chagásica. Belo Horizonte, Brazil: Fundacao Carlos Chagas; 1985:327-55.
5. Tarleton RL, Zhang L. Chagas disease etiology: autoimmunity or parasite persistence? Parasitol Today 1999;15:94-9.
6. Tarleton RL. Parasite persistence in the aetiology of Chagas disease. Int J Parasitol 2001;31:550-4.
7. Urbina JA. Chemotherapy of Chagas' disease: the how and the why. J Mol Med 1999;77:332-8.
8. Khaw M, Panosian CB. Human antiprotozoal therapy: past, present, and future. Clin Microbiol Rev 1995;8:427-39.
9. Viotti R, Vigliano C, Armenti H, Segura E. Treatment of chronic Chagas' disease with benznidazole: clinical and serologic evolution of patients with long-term follow-up. Am Heart J 1994;127:151-62.
10. Cancado JR. Long term evaluation of etiological treatment of Chagas disease with benznidazole. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2002;44:29-37.
11. Sosa-Estani S, Armenti A, Araujo G, Viotti R, Lococo B, Ruiz Vera B, et al. Treatment of Chagas disease with benznidazole and thioctic acid. Medicina (B Aires) 2004;64:1-6.
12. Fabbro De Suasnábar D, Arias E, Streiger M, Piacenza M, Ingaramo M, Del Barco M, et al. Evolutive behavior towards cardiomyopathy of treated (nifurtimox or benznidazole) and untreated chronic chagasic patients. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2000;42:99-109.
13. Fabbro DL, Streiger ML, Arias ED, Bizai ML, del Barco M, Amicone NA. Trypanocide treatment among adults with chronic Chagas disease living in Santa Fe city (Argentina), over a mean followup of 21 years: parasitological, serological and clinical evolution. Rev Soc Bras Med Trop 2007;40:1-10.
14. Rassi A, Luquetti AO. Specific treatment for Trypanosoma cruzi infection (Chagas disease). En: Tyler KM, Miles MA, editors. American Trypanosomiasis. Boston: Kluwer Academic Publishers; 2003. p. 117-25.
15. Laucella SA, Segura EL, Riarte A, Sosa ES. Soluble platelet selectin (sP-selectin) and soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) decrease during therapy with benznidazole in children with indeterminate form of Chagas' disease. Clin Exp Immunol 1999;118:423-7.
16. Olivieri BP, Cotta-De-Almeida V, Araújo-Jorge T. Benznidazole treatment following acute Trypanosoma cruzi infection triggers CD8+ T-cell expansion and promotes resistance to reinfection. Antimicrob Agents Chemother 2002;46:3790-6.
17. Laucella SA, Postan M, Martin D, Hubby Fralish B, Albareda MC, Alvarez MG, et al. Frequency of interferon- gamma -producing T cells specific for Trypanosoma cruzi inversely correlates with disease severity in chronic human Chagas disease. J Infect Dis 2004;189:909-18.
18. Albareda MC, Laucella SA, Alvarez MG, Armenti AH, Bertochi G, Tarleton RL, et al. Trypanosoma cruzi modulates the profile of memory CD8+ T cells in chronic Chagas' disease patients. Int Immunol 2006;18:465-71.
19. Viotti R, Vigliano C, Lococo B, Bertocchi G, Petti M, Alvarez MG, et al. Long-term cardiac outcomes of treating chronic Chagas disease with benznidazole versus no treatment: a nonrandomized trial. Ann Intern Med 2006;144:724-34.
20. Kuschnir E, Sgammini H, Castro R, Evequoz C, Ledesma R, Brunetto J. Evaluation of cardiac function by radioisotopic angiography, in patients with chronic Chagas cardiopathy. Arq Bras Cardiol 1985;45:249-56.
21. Barclay CA, Cerisola JA, Lugones H, Ledesma O, Lopez Silva J, Mouzo G. Aspectos farmacológicos y resultados terapéuticos del benznidazol en el tratamiento de la infección chagásica. Prens Med Arg 1978; 65:239.
22. Zimmerli SC, Harari A, Cellerai C, Vallelian F, Bart PA, Pantaleo G. HIV-1-specific IFN-gamma/IL-2-secreting CD8 T cells support CD4-independent proliferation of HIV-1-specific CD8 T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:7239-44.
23. Harari A, Vallelian F, Meylan PR, Pantaleo G. Functional heterogeneity of memory CD4 T cell responses in different conditions of antigen exposure and persistence. J Immunol 2005;174:1037-45.
24. Harari A, Dutoit V, Cellerai C, Bart PA, Du Pasquier RA, Pantaleo G. Functional signatures of protective antiviral T-cell immunity in human virus infections. Immunol Rev 2006;211:236-54.
25. Viotti R, Vigliano C, Armenti A. A risk score for predicting death in Chagas' heart disease. N Engl J Med 2006;355:2489.
26. Alvarez MG, Postan M, Weatherly B, Armenti A, Sidney J, Sette A, et al. HLA Class I-T cell epitopes from trans-sialidase proteins reveal functionally distinct subsets of CD8+ T cells specific for Trypanosoma cruzi in chronic Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases (in press).
27. Pantaleo G, Harari A. Functional signatures in antiviral T-cell immunity for monitoring virus-associated diseases. Nat Rev Immunol 2006;6:417-23.
28. Romanha AJ, Alves RO, Murta SM, Silva JS, Ropert C, Gazzinelli RT. Experimental chemotherapy against Trypanosoma cruzi infection: essential role of endogenous interferon-gamma in mediating parasitologic cure. J Infect Dis 2002;186:823-8.
29. Olivieri BP, de Souza AP, Cotta-de-Almeida V, de Castro SL, Araújo- Jorge T. Trypanosoma cruzi: alteration in the lymphoid compartments following interruption of infection by early acute benznidazole therapy in mice. Exp Parasitol 2006;114:228-34.
30. Dantas AP, Olivieri BP, Gomes FH, De Castro SL Treatment of Trypanosoma cruzi-infected mice with propolis promotes changes in the immune response. J Ethnopharmacol 2006;103:187-93.