Análisis de la asociación de HLA DRB1-DQB1 y autoanticuerpos en familias con Síndrome Poliendocrino Autoinmune (APS)
An analysis of the relationship between HLA DRB1-DQB1 and autoantibodies, in families with autoinmune polyendocrine syndrome (APS)
Botta, Silvia*; Roveto, Silvana*; Galarza, P.¤; Perusco, A.¤; y Rimoldi, D.*
¤ Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética
* Departamento de Endocrinología Clínica. Instituto de
investigaciones Médicas. A. Lanari - uBA
Laboratorio: Av. Combatientes de Malvinas 3150 II Cuerpo 1er Piso. Ciudad Autónoma Bs. As. 1427.
Correspondencia a te: 4514-8701 int. 163. y/o e-mail: drimoldi@lanari.fmed.uba.ar / sbotta@intramed.net
Resumen
El APS es la asociación de enfermedades endocrinas autoinmunes, con otros desórdenes autoinmunes
no endocrinos, denominados componentes mayores y menores. Este síndrome se clasificó en 4 tipos. Las
alteraciones de la respuesta inmune provocan fallas regulatorias de la misma; y polimorfismos de HLA,
entre otros, sumado a factores adquiridos o permanentes, representan gatillos disparadores de la autoinmunidad.
Nuestro objetivo fue buscar la asociación de HLA-DRB1*-DQB1* en individuos pertenecientes a dos
familias, con diagnóstico en uno o más de ellos de APS, o con enfermedades autoinmunes aisladas. Determinar
los anticuerpos séricos: a21-OH, aGAD y aTPO y observar la asociación con el haplotipo HLA. Estudiamos
padres e hijos de dos familias, dos integrantes padecían APS tipo 2 y 3; y otros con enfermedades
autoinmunes. Buscamos HLA-DRB1*-DQB1* y cuantificamos a21-OH, aTPO y aGAD.
Los pacientes con APS 2 y 3 presentaron el HLA-DRB1*0301-DQB1*0201. De los individuos estudiados,
5/9 tenían este haplotipo HLA y al menos un autoanticuerpo positivo. Hallamos el factor genético en 2/3 de
los integrantes con enfermedades autoinmunes correspondientes a componentes mayores. La relación observada,
entre APS y HLA-DRB1*0301-DQB1*0201, aumenta la posibilidad de identificar personas en riesgo
de contraer afecciones autoinmunes en grupos familiares, en los cuales algún integrante padece APS.
Palabras clave: HLA DRB1-DQB1; Autoanticuerpos; APS.
Abstract
The APS is the association of autoimmune endocrine diseases, with other non-endocrine autoimmune
disorders, named mayor and minor components. This syndrome was classified in 4 types. The alterations of
the immune response cause regulatory faults; and HLA polymorphisms, among others; taken in conjunction
with acquired or permanent factors, these represent triggers of autoimmunity.
Our objective was to find out the association of HLA-DRB1*-DQB1* in individuals belonging to two
families, with diagnosis in at least one of them APS, or with isolated autoimmune diseases. To determine
serum antibodies: a21-OH, aGAD and aTPO and to observe the association with HLA haplotype. We have
studied parents and offspring of two families, two members who suffered APS type 2 and 3, and others with
autoimmune diseases. We have looked for HLA-DRB1*-DQB1* and quantified a21-OH, aTPO and aGAD.
Patients with APS 2 and 3 showed HLA-DRB1*0301-DQB1*0201. Among the population we have studied,
5/9 had this HLA haplotype and at least one positive auto antibody. We have found the genetic factor in 2/3
of the members with autoimmune diseases corresponding to greater components.
The observed relation between APS and HLA-DRB1*0301-DQB1*0201, increases the possibility of identifying
people at risk of catching autoimmune affections in familiar groups in which at least one member
suffers APS.
Keywords: HLA DRB1-DQB; Auto antibodies; APS.
Introducción
El síndrome poliendocrino autoinmune (APS)
es la asociación de enfermedades endocrinas autoinmunes,
con otros desórdenes autoinmunes no
endocrinos.
Las enfermedades autoinmunes consideradas
como componentes mayores del APS son: hipoparatiroidismo,
adrenalitis, enfermedad tiroidea,
diabetes y candidiasis crónica. Los componentes
menores pueden ser endocrinos: ooforitis autoinmune,
hipofisitis o no endocrinos: vitiligo, alopecía
universal, hepatitis crónica autoinmune, cirrosis
biliar primaria, miastenia gravis, lupus eritematoso
sistémico, anemia perniciosa, enfermedad celíaca,
síndrome de Sjögren y otros.
Estos últimos pueden preceder, aparecer simultáneamente
o hacerlo muchos años después ( hasta
10) de los componentes mayores
Las diferentes formas de evolución, las determinaciones
de anticuerpos y la clínica resultan relevantes
para la clasificación del APS; donde cada
uno de los componentes se pueden observar temporalmente
en diversas secuencias.
En el año 1980, Neufeld y Blizzard, organizaron
y clasificaron este síndrome en cuatro tipos (1).
APS tipo1 es la asociación de candidiasis crónica,
hipoparatiroidismo y adrenalitis autoinmune como
componentes mayores.
El APS tipo 2 se caracteriza por la presencia de
enfermedades autoinmunes: adrenalitis (AA), Hashimoto
o Graves Basedow y/o diabetes insulino
dependiente (DBT), como componentes mayores
del síndrome. El APS tipo 3 asocia enfermedad
tiroidea autoinmune y otras autoinmunes como
diabetes, excluyendo adrenalitis e hipoparatiroidismo.
El tipo 4 con adrenalitis sumado a una o
más afecciones autoinmunes que excluyan a los
componentes mayores del tipo 1 y 2. La presencia
de anticuerpos dirigidos contra: peroxidasa tiroidea
(aTPO), receptor de TSH (Trab), 21-hidroxilasa
adrenal (a21-OH) y ácido glutámico decarboxilasa
de la célula β pancreática (aGAD); reflejan el compromiso
de órgano blanco en estas entidades (2-4)
Desde el punto de vista clínico, el APS puede
ser completo o incompleto; siendo este último
subclínico o latente. El latente presenta sólo
el autoanticuerpo, sin alteraciones en las pruebas
funcionales endocrinas.
El APS es una enfermedad compleja y multifactorial.
Entre los factores se encuentran los adquiridos,
que pueden ser transitorios (tabaquismo) o
permanentes (autoanticuerpos). Existen también,
factores genéticos que en forma asociada contribuyen
en la autoinmunidad, entre ellos, polimor-
fismos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(CMH), el receptor de activación de la segunda señal
inmunológica Cytotoxic T Lymphocyte-associated
antigen-4 (CTLA-4 + 49G) y del transductor de
señal Intracelular Tyrosyne phosphatase (PTPN22
620 W), entre otros(5-7)
La asociación con genes del complejo mayor
de histocompatibilidad (HLA), podría contribuir al
diagnóstico y/o pronóstico del APS(8-13). Esta asociación
permite la identificación de individuos,
considerados como de alto riesgo a contraer algún
tipo de enfermedad autoinmune dentro de un grupo
familiar(14-16).
Las enfermedades autoinmunes resultan en
parte, de la pérdida de tolerancia inmunológica,
a partir de un determinante genético dado, por
mutaciones específicas o por alteraciones relacionadas
al HLA, en el que distintos fenotipos del
mismo estarían involucrados.
Sumado a las alteraciones genéticas, agentes
externos (infecciones virales, drogas, productos
alimenticios y otros) pueden desencadenar respuestas
autoinmunes. Entre las hipótesis propuestas,
la teoría más aceptada para explicar el APS es
un defecto en la actividad de los linfocitos T. Las
citoquinas liberadas por T helpers activos, inducen
la activación de linfocitos citotóxicos (Th1) y B
(Th2). Se ha sugerido que el desarrollo de autoinmunidad
múltiple, estaría relacionado con uno
o más epitopes compartidos entre un agente externo
y un antígeno común presente en distintos
tejidos endocrinos (17).
Además, asociado o en forma separada, pueden
existir alteraciones en la activación de la
respuesta inmune, ya sea por, deficiencias en la
inhibición de la misma (CTLA-4); hiper-respuesta
(CD28, CD154,ICOS, etc.) o por fallas regulatorias,
a través de los transductores de señales (PTPN22)
y/o en menor medida por deficiencia en las moléculas
de adhesión (ICAM,VCAM,etc).
El factor de riesgo genético más conocido es el
CMH, y los polimorfismos del HLA- DRB1*, DQA1*
y DQB1*, están asociados con enfermedades autoinmunes
y en particular al APS, de acuerdo al
grupo étnico que se estudie. La presencia de dichos
marcadores aumentaría el riesgo de desarrollar
enfermedades autoinmunes que componen el
APS (18-22).
Objetivos
Buscar la posible asociación de los diferentes marcadores moleculares (HLA- DRB1*-DQB1*) en individuos pertenecientes a dos grupos familiares, con diagnóstico en uno o más de ellos de APS, o con enfermedades autoinmunes aisladas que correspondan a componentes mayores de dicho síndrome. Determinar los anticuerpos séricos: a21-OH, aGAD y aTPO y hallar asociación con los marcadores moleculares mencionados.
Sujetos
Familias: O y L compuestas por dos generaciones, padre y madre con (tres hijos: 2 mujeres y un varón ) y (dos hijos: 1 mujer y un varón) respectivamente. Ambas familias presentan al menos un integrante con APS y enfermedades autoinmunes endocrinas asociadas.
Métodos
Se realizó una extracción de 10 ml de sangre
por punción venosa en pliegue del codo con 8 horas de ayuno previo. Las muestras séricas fueron
congeladas hasta su procesamiento y se recolectó
también, un tubo con EDTA como anticoagulante.
Este fue destinado para extracción de ADN, a
través de leucocitos que se ubican en la interfase
(plasma-rojos) después de una centrifugación de
10 minutos a 2.500 rpm.
Extracción de ADN: método salino con proteinkinasa,
para genotipificación de los polimorfismos
genéticos del HLA clase II-DRB1* y DQB1* por la
técnica de PCR-SSOP reversa (Innogenetics-Innolipa),
de mediana resolución.
El procedimiento de tipificación es similar para
los dos genes y se divide en dos grandes pasos:
1- Amplificación
2- Hibridización colorimétrica
1- Se amplifica por separado el segundo exón
del locus DRB1*, el segundo y tercer exón del
DQB1*, por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con cebadores biotinilados diseñados
para abarcar la zona polimórfica. Se utiliza
además, DNTP, Buffer, Mg+2 y taq polimerasa (2U/
ul) que conjuntamente con el DNA extraido, son
necesarios para la reacción, obteniendo un volumen
final de trabajo de 25 ul.
Se coloca un tubo por paciente y por gen en
el termociclador ( PTC-100 MJ Research) en un
programa de ciclado que consta de los siguientes
pasos:
a. Desnaturalización 95ºC 5 min.
b. Desnaturalización 95ºC 1 min.
c. Pegado o anillado 58ºC 1 min.
d. Extensión 72ºC 1 min.
e. Extensión 72ºC 1 min.
Los pasos b al d se repiten 35 ciclos.
Antes de de la hibridización, se extrae 5 ul del
volumen amplificado, para comprobar la presencia
del producto específico. Se corrobora a través
de 1 banda de: 280 pb para el DRB1, 250 pb del
exón 3 y 261 pb del exón 2 para el DQB1 de longitud.
Esto es corrido en gel de agarosa al 2% con
bromuro de etidio (10mg/ml). Se visualiza en UV
transiluminador .
2- El producto amplificado biotinilizado, se desnaturaliza
químicamente (separación de hebras) y
se lo hibridiza en tiras de nitrocelulosa que contiene
sondas de oligonucleótidos específicos inmovilizados,
complementarias a todos los polimorfismos
conocidos al momento de la tipificación (37 sondas
para DRB1 y 36 sondas para DQB1). Cada tira
posee dos bandas de control interno (control de
hibridización y conjugación).
Una vez terminado el proceso, la interpretación
de resultados para determinar las combinaciones
posibles de alelos se realiza a través de tablas (manual)
y software, provisto por la empresa que comercializa
los equipos (Tecnolab SA).
Para el dosaje de a21-OH y aGAD séricos se
utilizaron inmunoensayos isotópicos de R S R Limited,
adquiridos a través del distribuidor Diagnos
Med y procesados en el Laboratorio de Endocrinología
Clínica del Instituto Lanari .
Para cuantificar los anticuerpos a21-OH séricos
se utilizó un inmunoensayo no competitivo respetando
estrictamente las instrucciones del fabricante.
El procedimiento se basa en una incubación
de 18 horas a 4 °C, de las muestras séricas, controles
y calibradores con la enzima 21 hidroxilasa
recombinante humana marcada con 125 Iodo (trazador).
Luego separamos el complejo antígenoanticuerpo
formado, mediante precipitación con
proteína A incubando a 4º C 1 hora; y adicionando
buffer frío centrifugamos a 1700 rpm, 30 minutos
a 4º C. Aspiramos el sobrenadante, el precipitado
radioactivo fue leído y los datos procesados en un
contador gamma automático COBRA II (Packard).
Valor de referencia hasta 1 U/ml. Sensibilidad analítica:
0.03 U/ml.
Para cuantificar los anticuerpos aGAD séricos se
utilizó un inmunoensayo no competitivo respetando
estrictamente las instrucciones del fabricante. El
procedimiento se basa en una incubación de 2 horas
a temperatura ambiente de las muestras séricas,
controles y calibradores con la enzima ácido glutámico
decarboxilasa (GAD65) recombinante humana
marcada con 125 Iodo (trazador). Luego separamos
el complejo antígeno-anticuerpo formado,
mediante precipitación con proteína A incubando
a temperatura ambiente 1 hora; y adicionando
buffer frío centrifugamos a 1700rpm, 30 minutos
a 4º C. Aspiramos el sobrenadante el precipitado
radioactivo fue leído y los datos procesados en un contador gamma automático COBRA II (Packard).
Valor de referencia hasta 1 U/ml. Sensibilidad analítica:
0.02 U/ml.
Para aTPO se utilizó un inmunoensayo con IMMULITE
1000 del Laboratorio de Endocrinología
Clínica, método quimioluminiscente de Diagnostic
Products Corporation (actualmente Siemens); siendo
nuestros valores de referencia hasta 15 IU/ml.
Consideramos individuos sanos, a los integrantes
de las familias sin anticuerpos séricos ni clínica
correspondiente a los componentes del síndrome
investigado.
El protocolo de estudio fue aprobado por el
Comité de Docencia e Investigación del Instituto
Lanari. Todos lo sujetos estudiados fueron informados
y firmaron el consentimiento.
Resultados
Familia O: padre APS tipo 2 completo; hija e hijo portadores del haplotipo DRB1* 0301-DQB1*0201 con enfermedad de Graves. Madre con aGad positivo, como marcador bioquímico aislado de DBT, que al momento no corresponde a un APS ni posee el haplotipo hallado. Familia L: hija APS tipo 3 completo; comparte el haplotipo estudiado con el padre que presenta autoinmunidad tiroidea. Madre APS tipo 3 incompleto en relación a la DBT. Tabla I
Tabla I
Los portadores de los haplotipos investigados presentaron diversas expresiones clínicas al momento de la investigación. Los dos pacientes APS 2 y 3 tienen el HLA DRB1* 0301-DQB1*0201. Los 5 sujetos con dicho haplotipo hallado se relacionan al menos con la presencia de un autoanticuerpo positivo. De los individuos que presentan enfermedades autoinmunes correspondientes a componentes mayores del APS, 2/3 tienen el factor genético asociado.
Discusión
Nuestros pacientes con APS estudiados son portadores
del haplotipo HLA DRB1*0301-DQB1*0201.
Hallamos una relación del factor genético con diabetes,
adrenalitis, Graves o Hashimoto, que incrementa
el riesgo de adquirir dichas patologías en
individuos portadores de estos polimorfismos.
La relación observada, entre APS y HLA, aumenta
la posibilidad de identificar personas en
riesgo de contraer afecciones autoinmunes en
grupos familiares, en los cuales algún integrante
padece APS. La detección temprana nos permitiría,
además, una intervención precoz reduciendo
la morbilidad crónica de estas enfermedades.
Si se manifiesta clínicamente sólo una enfermedad
endocrina autoinmune, asociada a la presencia
de otros autoanticuerpos, podría representar el comienzo
de APS con expresión latente o subclínica
de las distintas enfermedades que lo componen.
Agradecimientos
TOKATLIAN SA por la donación de aTPO IMMULITE
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