El receptor de la hormona de crecimiento humana (hGH) y la proteína de transporte de alta afinidad de la hGH
Human Growth Hormone (GH) Receptor and the High Affinity GH-Binding Protein
Ballerini, María Gabriela*, Ropelato, María Gabriela**
Sección Laboratorio-División de Endocrinología - Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez
* Bioquímica de planta del Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires
** Jefa de la Sección Laboratorio-Miembro de la Carrera de Investigador del Consejo de Investigación en Salud
del Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Dirección Postal: Gallo 1360. Ciudad Autónoma Bs. As. -1425.
Correspondencia a tel/ fax: 4963-5931 / 4963 - 5930. y/o e-mails: mgballerini@cedie.org.ar / gropelato@cedie.org.ar
Resumen
La hormona de crecimiento humana (hGH) circula parcialmente unida a su proteína de transporte de alta afinidad (GHBP) la cual resulta del clivaje proteolítico del dominio extracelular del receptor de GH. Recientemente la enzima TACE se identificó como la metaloproteasa responsable del clivaje y liberación de GHBP a circulación. Aunque aún se desconoce la función específica de esta proteína de transporte, distintos trabajos en la literatura demuestran efectos que potencian y efectos inhibitorios sobre la acción de GH. Por otro lado, existen evidencias que demuestran una fuerte relación entre la GHBP y el nivel de receptor de GH en el hígado en situaciones fisiológicas y patológicas. Esto permitió proponer a la determinación de GHBP en suero como un marcador periférico de la abundancia del receptor de GH en los tejidos. La determinación de la concentración de GHBP sería de especial interés para evaluar pacientes con diagnóstico probable de insensibilidad a la acción de GH y orientar el posterior estudio de anormalidades en el gen del receptor de GH. En la presente revisión, también se abordan dificultades metodológicas relacionadas a la medición de GHBP sérica.
Palabras clave: hGH; RGH; Stat5b; TACE; GHBP.
Abstract
Human circulating growth hormone (GH) is partly bound to a high-affinity binding protein (GHBP) which is derived from proteolytical cleavage of the extracellular domain of the GH receptor. Recently, the metalloproteinase TACE has been identified as an important enzyme responsive for inducing GHBP shedding. Although the specific function of GHBP is not fully known, both enhancing and inhibitory roles of this binding protein on GH action have been proposed. Many reports have demonstrated a close relationship between GHBP and the liver GH receptor status in physiological conditions and diseases. Moreover, serum GHBP measurement has been proposed as an useful peripheral index of the GH receptor abundance. Related to the latter, circulating GHBP concentration would be of special interest for the evaluation of GH insensitivity due to GH receptor gene abnormalities. In addition, the present review also focus on methodological problems concerning serum GHBP measurement.
Key Words: hGH; GHR; Stat5b; TACE; GHBP.
Introducción
El receptor de la hGH (RGH) constituye un regulador
crítico del crecimiento de la vida posnatal
y del metabolismo. En humanos, el RGH está constituido por un dominio extracelular (DEC), un
dominio transmembrana (DTM) y un dominio intracelular
(DIC) asociado a moléculas con actividad
tirosina quinasa (JAK2). En los últimos años,
el clonado del RGH, su asociación a JAK2 y el
descubrimiento de las moléculas activadoras de la
transcripción (Stat) han sido hallazgos clave para
el entendimiento del mecanismo de acción de la
hGH. Por otro lado, recientemente fue identificada
la enzima TACE que produce el clivaje proteolítico
del ectodominio del RGH y genera la proteína de
transporte de GH en circulación (GHBP). El síndrome
de Laron es una enfermedad autosómica
recesiva de penetrancia completa que ocurre por
defectos moleculares en el RGH y que resulta en la
resistencia a la acción de la GH. Pacientes con esta
patología se caracterizan por presentar niveles elevados
de GH, niveles del factor de crecimiento insulino
símil (IGF-I) disminuidos o no detectables y
falta de respuesta al test de generación de IGF-I. La
mayoría de las mutaciones descriptas del RGH en
el Síndrome de Laron afectan el DEC del receptor y
generalmente, la ausencia o marcada disminución
de los niveles de GHBP en suero hacen pensar este
síndrome. Actualmente, se sabe que pacientes con concentraciones de GHBP dosables y sospecha de
resistencia a la acción de GH podrían presentar
mutaciones a nivel de los DIC y DTM, o bien en
algunos de los componentes involucrados en el
mecanismo de transducción de señal.
El presente informe constituye una actualización
sobre el RGH y sus formas polimórficas más
frecuentes, el mecanismo de acción de la hGH y
la proteína de transporte GHBP. Además, propone
la determinación de GHBP en suero como una
herramienta útil en el estudio molecular posterior
del RGH en pacientes con deficiencias no clásicas
de GH y sospecha de resistencia a la GH.
Receptor de hormona de crecimiento humana
La hormona de crecimiento humana (hGH), al
igual que la prolactina (PRL), son hormonas secretadas
por la adenohipófisis, que se encuentran
estructural y funcionalmente relacionadas con una
gran variedad de factores de crecimiento, como las
interleuquinas y citoquinas. Debido a la semejanza
entre los receptores y mecanismos de transducción
de señal de estas hormonas y factores, sus receptores
fueron agrupados bajo la denominación
común de: "Superfamilia de receptores de citoquinas".
Estos receptores tienen la particularidad de
estar anclados a la membrana celular, exponiendo
un dominio extracelular de unión a su ligando específico.
A su vez, existe un subgrupo de estos receptores, entre los que se encuentran el receptor
de hormona de crecimiento (RGH), el receptor de
eritropoyetina, el receptor de PRL, y otros, que,
por su alta similitud estructural y funcional, se denominan:"Receptores Clase I de citoquinas" (1,2).
El gen de RGH humana está ubicado en el brazo
corto del cromosoma 5 (región p13.1-p12) (3). La
caracterización del RGH evidenció 9 exones codificantes,
numerados del 2-10. El exón 2 codifica para
el péptido señal, los exones 3-7 al dominio extracelular
(DEC), el exón 8 al dominio transmembrana
(DTM) y el 9-10 al dominio intracitoplasmático
(DIC). En la actualidad se han descripto más de
50 mutaciones en el gen del RGH, constituyendo
el DEC del mismo la región en las que se han comunicado
la mayor parte de las alteraciones(4,5). La
molécula de RGH está constituida por 638 aminoácidos,
que incluye una secuencia de 18 residuos
que comienzan en metionina y un corte de 14 residuos
hidrofóbicos, que indican que se trata de
un péptido de señal. La forma madura del RGH
la componen 620 aminoácidos, con un peso molecular
aproximado de 70 Kd previo al proceso de
glicosilación. En su estructura se pueden diferenciar
tres dominios: un DIC de 350 aminoácidos, una
porción transmembrana y un DEC de unión a la
hormona de crecimiento de 246 aminoácidos, este último idéntico a la proteína ligadora de hormona
de crecimiento humana de alta afinidad (GHBP)
circulante en el plasma(6,7). Existen al menos tres
isoformas descriptas de la región codificante del
DIC del RGH: la forma más abundante o completa
del DIC (full-length=fl), una forma idéntica al anterior
excepto por 26 pb que se pierden por splicing
alternativo en el exón 9, generando una isoforma
truncada del RGH (RGH-tr o RGH-(1-279)) que carece
de un 97.5% del DIC, y finalmente una tercera
isoforma que únicamente contiene 7 residuos
del DIC, producto de la pérdida total del exón 9
(RGH-(1-277))(8-10). Estas dos últimas isoformas truncadas
del RGH inhiben la función de la forma completa
del mismo in vitro(8,9). En cuanto a la región
codificante del mRNA del DEC del receptor, existen
dos isoformas: una que retiene al exón 3 (fl) dando
la forma completa del RGH o full-lenght, y una
que lo carece (d3)(11). Respecto del mecanismo de generación de esta última, se cree que una deleción
genómica de 2.7 pb que incluirían al exón 3 y
no un splicing alternativo del mismo sería la forma
más probable de generación de esta isoforma(12).
De la heterogeneidad de ambas isoformas resultan
los genotipos homocigota para el fl, homocigota
para el d3 y heterocigota fl/d3 para el RGH.
La frecuencia alélica estimada en la población es
de 75% y 25% para los genotipos fl-RGH y d3-
RGH, respectivamente(12,14). Se ha demostrado que
los niños deficientes de GH, niños con síndrome
de Turner y pequeños para su edad gestacional
portadores de la variante d3 del RGH presentan
una mejor respuesta al tratamiento con GH(15-17).
Sin embargo, existen trabajos contradictorios al
respecto(18-20) y mas aún, la capacidad diferencial
de respuesta al tratamiento con GH en relación
al genotipo del exón 3 no es clara debido a que
ambas formas del DEC exponen iguales propiedades
de afinidad por la GH(21). Por otro lado, existe
escasa información acerca de la posible asociación
del genotipo del exón 3 y parámetros bioquímicos
relacionados al crecimiento en sujetos normales.
Un estudio reciente de nuestro grupo de trabajo
muestra que los niveles de GHBP fueron estadísticamente
menores en niños normales portadores
de 1 ó 2 copias del alelo que tiene la deleción del
exón 3 del RGH comparados con los obtenidos
en niños portadores de ambos alelos con la forma
completa del receptor(22). Un impacto diferencial
del genotipo sobre la acción proteolítica de la enzima
que interviene en el clivaje proteolítico del
RGH y liberación de GHBP al medio podría explicar
este hallazgo(23).
Finalmente, otra característica de los receptores
Clase I de Citoquinas es la presencia de sus
dominios extracelulares en circulación. Estas formas
solubles de DEC cumplen funciones agonistas
o antagonistas. La forma soluble del DEC del
RGH constituye la proteína ligadora de hormona
de crecimiento humana de alta afinidad (GHBP).
En conjunto, los niveles de GH, el recambio o turnover
del RGH, la regulación posreceptor y los
niveles de GHBP determinarán el efecto biológico
final de la hormona de crecimiento humana(24,25).
Mecanismo de acción de la hormona de crecimiento humana
El receptor de la hormona de crecimiento humana
está ampliamente distribuido en todo el organismo,
aunque su expresión es particularmente
importante en el hígado(26), donde la GH estimula
genes relacionados al crecimiento lineal como el
factor de crecimiento insulino-símil tipo-I (IGF-I),
la proteína de transporte de IGF-I tipo 3 (IGFBP-3)
y de la subunidad ácido lábil (ALS), favoreciendo
la vida media del IGF-I en circulación por la formación
del complejo ternario IGF-I/IGFBP-3/ALS.
Además de sus acciones promotoras del crecimiento,
la hormona de crecimiento ejerce funciones
metabólicas, es hiperglucemiante, anabólica y
lipolítica. También tiene otros efectos de regulación
sobre la función cardíaca e inmune, agilidad mental
y el proceso de envejecimiento(6).
La GH actúa uniéndose los receptores que se
encuentran bajo la forma de homodímeros en la
membrana de las células(27) (Figura 1). El hallazgo
reciente de formación constitutiva de la forma dimérica
del RGH en la membrana celular desafió el modelo históricamente conocido de la formación
de dímeros de activación del RGH inducido por
la unión de la GH(28). Los trabajos de Gent y colaboradores
demostraron la existencia de dímeros
inactivos del RGH en el retículo endoplásmico en
ausencia del ligando específico (GH) y permitieron
postular un nuevo mecanismo mediante el cual
una única molécula GH generaría los dímeros de
activación (2RGH:1GH)(27,29-30). El dominio extracelular
del RGH está compuesto por un subdominio
1 N-terminal de unión a la GH y un subdominio
2 próximo a la membrana celular. Entre ambos
subdominios existe una región denominada bisagra.
Inicialmente, el dímero del RGH se formaría
por la interacción de los subdominios 2 del DEC,
proceso facilitado por proteínas chaperonas del
retículo endoplásmico. Paso seguido los DTM interactuarían
y sellarían ambos receptores bajo una
estructura dimérica para finalmente ser transportados
hacia la membrana como homodímeros(30).
Figura 1:
Modelo de mecanismo de activación del RGH. La GH se une a un dímero constitucionalmente formado
del RGH en la membrana celular. En consecuencia los RGH rotan y permiten que las Jak2 unidas al dominio
intracelular de los mismos se alineen apropiadamente y se transfosforilen mutuamente iniciando la cascada de
transducción de señal intracelular.
La dimerización constitutiva del RGH determinó que un cambio conformacional de los RGH inducido
por la unión de la GH sería el responsable del
mecanismo de activación del proceso de transducción(28). El RGH, al igual que otros integrantes de la
superfamilia de receptores Clase I de citoquinas, no
presenta actividad tirosina-quinasa "per se" en su
dominio intracelular, sino que se relaciona física
y funcionalmente a moléculas no receptoras de la
familia de las tirosina-quinasas Janus (JAK1, JAK2,
JAK3 y TYK2). En el caso particular del RGH, JAK2
se acopla a una secuencia rica en prolina del DIC
del RGH (Box 1) cercana a la membrana celular.
Debido a que Box 1 es la única región citoplasmática
conservada entre todas los miembros de la
familia de receptores de citoquinas que utilizan a
JAK2 en su señal de transducción, el Box 1 es el
sitio involucrado en la interacción receptor-JAK2.
Mutaciones o deleciones en el Box 1 impiden la
formación del complejo receptor-JAK2, y la posterior
activación del receptor, luego de la unión
de la GH al mismo(1,6). Además de su función en
la activación de los mecanismos intracelulares de
transducción de señal, las moléculas JAK2 potenciarían
la estabilidad de la forma madura del RGH
y tendrían un rol regulatorio en la proteólisis del
DEC del receptor(31-32). La unión de la GH al dímero de RGH aproxima dos moléculas de JAK2
de manera suficiente para que se inicie la transfosforilación
de las mismas. Las JAK2 activas fosforilan
residuos tirosínicos críticos en la cascada
de transducción de señal que se encuentran en
el dominio citoplasmático del RGH, y fosforilan
también sustratos directos de las moléculas JAK
como los IRS-1 y -2(27,28). Finalmente, las fosfotirosinas
distales del DIC del RGH reclutan a los
transductores de señal y activadores de la transcripción
(Stat) y otras proteínas por medio de
interacciones con los dominios (SH)-2. Las Stats
son otra familia de proteínas intracelulares, y en el
caso particular de JAK2, fosforila a por los menos
4 integrantes de la familia de las Stats: Stat 1, 3, 5a
y 5b, las cuales dimerizan y se traslocan al núcleo,
uniéndose a secuencias específicas del ADN e inducen
la transcripción de genes GH-dependientes
específicos(33). Existen al menos 2 isoformas de moléculas
Stat5: la Stat5a y la Stat5b. A pesar de la alta
homología entre estas formas moleculares, estudios
recientes les adjudican roles diferentes y altamente
específicos de especie. La disrupción génica de
las Stat5 produjo en ratones defectos en la expresión
de genes relacionados al crecimiento lineal,
lo que indica la importancia de las mismas en la
acción de GH. En un modelo de ratón knockout
de la isoforma Stat5b, se observó la pérdida del dimorfismo
sexual característico del crecimiento de
estos roedores y falta de expresión de genes hepáticos
dependientes de GH. Interesantemente, ni
la Stat5a ni otras moléculas Stats pudieron revertir
los efectos negativos de la falta de Stat5b sobre el
crecimiento lineal(34). El camino de JAK2/Stat5b/
IGF-I juega un rol crítico en la regulación del crecimiento
posnatal, sin descartar que otros sistemas
también estuvieran involucrados(35).
La regulación negativa del mecanismo de transducción
de señal inducido por la GH está a cargo
de unas moléculas codificadas por genes citoquina-
inducibles, denominadas "supresoras de
señal de transducción de receptores de citoquinas" o "Socs"(36). Las moléculas Socs pertenecen a una
gran familia, aunque únicamente las Socs 1, Socs
2 y Socs 3 se transcriben inducidas por GH mediante
un mecanismo que aún no ha sido del todo
esclarecido, aunque se cree que las Stats estarían involucradas en el mismo. Es altamente probable
que las Socs inhiban la señalización de GH y otros
receptores relacionados inactivando la actividad
quinasa de las JAKs. Sumado a la acción de las
Socs, existe un mecanismo de activación y reclutamiento
de una o más proteínas tirosina-fosfatasas
que producirían la defosforilación de las JAKs y
del RGH, conduciendo hacia su inactivación(6).
Finalmente, el RGH es constitutivamente internalizado
vía estructuras recubiertas por clatrina, y
transportado a través de endosomas hacia los lisosomas
para su posterior degradación. Tanto la
internalización como el transporte del RGH a lisosomas
es dependiente de un sistema ubiquitina-proteosoma,
para el cual se requiere la indemnidad
del motivo de endocitosis ubiquitina-dependiente
del RGH (UbE-motif, DSWVEFIELD). Interesantemente,
el fenómeno de dimerización es indispensable
para el proceso de degradación ubiquitina-dependiente,
debido a que formas quiméricas, no
dimerizables del RGH, fueron rápidamente internalizadas
por endocitosis sin depender del mecanismo
de degradación ejercido por el sistema
ubiquitina(29,36).
Alteraciones del crecimiento relacionadas a mutaciones del RGH
Alteraciones del crecimiento relacionadas a mutaciones en el RGH producen el síndrome de insensibilidad a la acción de la GH, descrito por primera vez en 1966 por Laron y col.(37). A continuación se hará una breve referencia a algunas de las mutaciones recientemente identificadas que afectan la expresión, activavión o señalización del RGH.
Fallas en la expresión:
Una mutación puntual que activa un pseudoexón
genera la inserción de 36 residuos en la región
de dimerización del RGH. Esta forma elongada
del RGH altera el proceso de transporte del
receptor hacia la membrana quedando atrapado
en el núcleo y expresándose en menor proporción
en la membrana celular(38).
Fallas en la activación:
La sustitución de un residuo histidina por un
aspartato en la posición 152 (D152H) localizada
en la interfase de dos DEC del homodímero del
RGH afectaría la correcta rotación y cambio conformacional
que debe experimentar el RGH para
la activación del proceso de transducción(39,40).
Fallas en la señalización:
Debido a una mutación en el exón 9 que afecta
el sitio aceptor de splicing se genera una forma
truncada del receptor que conserva únicamente 7
residuos del DIC. Como consecuencia, se pierde
el UbE-motif necesario para el proceso de internalización
del RGH, acumulándose estos receptores
en la membrana y actuando como dominantes negativos
frente a la forma completa del RGH. Esto
permite entender el retardo severo del crecimiento
en pacientes que portan esta mutación aún en
heterocigosis(9). Recientemente fueron descriptas
dos mutaciones que también afectan la señal de
transducción y son producidas por un cambio en
el marco de lectura y generación de un codón de
stop prematuro(41,42). Estos receptores están truncados
a partir del residuo 449 y 581, respectivamente,
y en ambos casos sólo está afectada la posibilidad
de activar Stat5, mientras que conservan
la habilidad de activar JAK2, Stat3 o la vía de las
MAP quinasas.
Defectos posreceptor:
El síndrome de insensibilidad a la acción de
GH puede también tener su origen en alteraciones
en algunos de los componentes intracelulares involucrados
en su mecanismo de transducción de
señal. La combinación de retardo del crecimiento
e inmunodeficiencia hizo pensar en defectos genéticos
compartidos por diferentes integrantes de
la familia de citoquinas. Un ejemplo de ello son
mutaciones que afectan la molécula de Stat5b(43-46).
Recientemente en el Hospital de Niños Dr. Ricardo
Gutiérrez se identificó una nueva mutación
de la Stat5b en una paciente del sexo femenino,
que asocia insensibilidad a la GH e inmunodeficiencia(46). Estos trabajos demuestran el rol crítico,
especialmente de la molécula Stat5b, en la producción
de IGF-I, el crecimiento posnatal y pone en evidencia el cross-talk que existe entre los diferentes
receptores de la Familia de Receptores de
Citoquinas.
GHBP: Homología con el dominio extracelular del receptor de hormona de crecimiento humana
Transcurrieron varias décadas desde que se
tuvo la primera evidencia de la existencia de un
componente en sangre capaz de interactuar con
la GH hasta su posterior caracterización(47). Entre
los años 1986 y 1987, finalmente se describió y
caracterizó una proteína de baja capacidad y alta
afinidad que específicamente unía alrededor del
50% de la GH circulante en el plasma humano:
proteína ligadora de hormona de crecimiento humana
de alta afinidad o GHBP(48-50). En el plasma
humano también se describió otra proteína que
une alrededor del 5-8% de la GH total circulante,
especialmente la isoforma de 20 kd, de la cual se
desconoce su regulación(49).
En humanos y conejos, la GHBP se genera por
clivaje proteolítico del dominio extracelular del RGH
permitiendo su liberación al medio vascular(51) (Figura
2). Recientemente fue descubierta una enzima
anclada a la membrana celular involucrada en la proteólisis del RGH(52,53). Esta enzima forma
parte de una superfamilia de enzimas conocidas
como metzincinas, desintegrina y metaloproteinasas
(ADAM) que intervienen en diferentes procesos
de proteólisis. La ADAM-17, también conocida
como TACE (enzima convertidora de TNF-α) es la
enzima responsable del clivaje del DEC del RGH y
liberación de GHBP a circulación. Aunque aún no
han sido identificados los residuos específicos del
clivaje ni su regulación, se sabe que sería necesaria
la integridad de la región yuxtamembrana para
el clivaje enzimático(54). Esta proteasa, se sintetiza
como un precursor que incluye un prodominio,
un dominio catalítico que contiene un sitio de
unión al Zn, un dominio desintegrina, un dominio
EGF/crambina rico en cisteínas, un dominio transmembrana
(TM) y un dominio citoplasmático. Su
prodominio contiene un sitio rico en cisteína que
interactúa y neutraliza al átomo de Zn en el sitio
catalítico, manteniendo a la enzima como zimógeno
(inactiva) durante el tránsito por el retículo
endoplásmico y el aparato de Golgi. Al llegar a
la membrana se elimina el prodominio quedando
anclada a membrana en su forma activa(55). Esta
metaloproteasa no es específica del RGH, sino
que participa en el clivaje de otras proteínas de
membrana. La enzima TACE, cliva al monómero de RGH en una región llamada "stem" generando
la GHBP que difunde al espacio pericelular y de
allí a circulación. El producto remanente en membrana,
sufre una segunda proteólisis por acción de
una γ-secretasa, originando un péptido intracelular
del cual se desconoce su relevancia biológica
(55). Como fue mencionado anteriormente, debido
a la existencia de diferentes isoformas del RGH, la
concentración de la GHBP en suero sería el producto
final del clivaje proteolítico de las formas
completas y truncadas del RGH, las cuales a su vez
podrán corresponder a diferentes polimorfismos
del exón 3 del DEC (fl-RGH o d3-RGH).
Figura 2:
Mecanismo de generación de GHBP: la acción proteolítica de la enzima de membrana TACE sobre el
dominio extracelular del RGH permite la liberación de GHBP (shedding) al medio vascular. La GH en plasma se une
a su proteína de transporte (GHBP) en una relación 1:1.
La activación de la TACE puede ser inducida farmacológicamente por la acción de ésteres de forbol que activan las vías dependientes de protein kinasa-C (PK-C) y por reactivos que son inactivantes de grupos sulfhidrilos(56). Sin embargo, aún no se conocen los mecanismos moleculares que regulan la proteólisis del RGH ni la regulación fisiológica de la enzima TACE. Por un lado se vio que el receptor en su forma dimérica era resistente a la acción proteolítica de la enzima TACE(56), mientras que la molécula de GH sería necesaria para la interacción de la TACE con el RGH(53). Recientemente, se demostró que JAK 2 influiría en el mecanismo de proteólisis del RGH(32). El estudio de la regulación de la enzima TACE podría proveer información adicional acerca del mecanismo que controla la expresión del RGH en membrana y la liberación de su dominio extracelular (GHBP) a circulación.
GHBP: fuentes titulares, distribución y regulación
Debido a problemas éticos y limitaciones prácticas,
es muy escasa la información que se tiene respecto
de la expresión del RGH en humanos, aunque
se sabe que el hígado sería el órgano más enriquecido
en este receptor y el que contribuiría en mayor
grado a la GHBP circulante en plasma(57). También
se encontró alta expresión de la enzima TACE en
el hígado (58). Si bien, estudios en circulación venosa
determinaron mayores niveles de GHBP en la
vena hepática que en cualquier efluente de otro órgano, también se ha observado que otros tejidos
como riñón, músculo, cerebro, corazón, tejido adiposo,
etc.(59), contribuirían en menor proporción, a
la GHBP total circulante. Dada la alta correlación
encontrada entre los niveles de esta proteína de
alta afinidad y la masa grasa(60), se postuló que el
tejido adiposo podría ser una fuente importante de
generación de GHBP, aunque actualmente se sabe
que el mismo contribuye en un porcentaje ínfimo a
los niveles séricos de esta proteína, y posiblemente
serían factores producidos por el adipocito los que
estarían regulando la expresión del RGH y /o la
liberación de GHBP al medio(61).
En la literatura no existe evidencia clara de
los mecanismos de regulación involucrados en la
modulación de la GHBP sérica. En la Tabla 1 se
muestran algunos factores que se asociaron a cambios
en los niveles plasmáticos de la GHBP en el
hombre.
Tabla 1: Factores fisiológicos, nutricionales y farmacológicos que se asocian a cambios en los niveles plasmáticos de la GHBP en el hombre.
A pesar de lo expuesto, es controvertida la información acerca de la acción de esteroides sexuales y la GH sobre los niveles de GHBP. Durante la etapa puberal no se han registrado diferencias significativas entre ambos sexos(22,74,76). Tampoco se observaron modificaciones significativas en los niveles de GHBP en suero durante el ciclo menstrual (77). Además, en pacientes con déficit total de aromatasa y síndrome de Turner se han reportado niveles normales o ligeramente elevados(78,79), aún tratándose de situaciones con niveles no detectables o muy bajos de estrógenos. Respecto de la acción de GH en pacientes con déficit de la misma, diversos trabajos muestran que los niveles de GHBP no variaron o normalizaron(80,81) en el transcurso del tratamiento sustitutivo de esta hormona.
GHBP: función
La función primaria y fundamental de la GHBP
es la formación endógena de complejos 1:1 con la
GH (complejos GH-GHBP) (Figura 2). En plasma,
la GHBP une alrededor del 50% de la GH(82), salvo
en los picos secretorios de esta hormona, donde
se une hasta el 80%(83). En consecuencia, la GHBP
atenúa las oscilaciones propias de la secreción
episódica de GH, prolongando su vida media de 7
a 29 minutos, en parte también por la incapacidad
del riñón de filtrar por el glomérulo el complejo
GH/GHBP de alto peso molecular(84). En efecto,
la formación de complejos estaría asegurando un
reservorio de GH en circulación para los tejidos
blanco. Estos efectos "in vivo" tienden a aumentar
la biodisponibilidad y potenciar la acción de GH.
Sin embargo, estudios "in vitro" han demostrado
que la GHBP inhibe la unión de GH a su receptor
en forma dosis dependiente posiblemente por
competencia con el receptor y secuestro de GH.
Finalmente, los efectos positivos de la GHBP sobre
la acción de GH observados a dosis fisiológicas
servirían de alguna manera para neutralizar los
efectos inhibitorios coexistentes(85).
Métodos para la cuantificación de GHBP en suero
Existen diferentes métodos para la determinación
de GHBP en suero:
a) Métodos que miden la capacidad de unión de
la GHBP a la GH: cromatografía y ensayos de inmunoprecipitación
b) Inmunoensayos: radioinmunoensayos y ensayos
de ELISA (kit comercial)
c) Ensayos inmunofuncionales mediados por ligando:
ELISA desarrollado y Fluoroinmunoensayos
Los métodos mas comúnmente utilizados para
la cuantificación sérica de GHBP medían capacidad
de unión y consistían en la incubación de la
muestra de suero con GH marcada radiactivamente,
y posterior separación de la fracción libre de
la unida por cromatografía o mediante el uso de
una suspensión de carbón-dextrán(48). Estas metodologías
eran engorrosas y poco prácticas en el laboratorio
clínico, presentaban el inconveniente de
una difícil interpretación de los resultados debido a
la interferencia de la GH endógena presente en el
suero(48,86,87). Además, estos ensayos de unión miden
el total de GHBP presente en la muestra y no permiten
determinar con precisión la fracción unida en
forma endógena de la GH a la GHBP (complejos
GH/GHBP endógenos), ofreciendo estos métodos únicamente una estimación de la capacidad de la
unión de la GHBP. Otro inconveniente residía en la
utilización de material radiactivo (125I-GH) y el tiempo
prolongado de procesamiento de la muestra con
la posible disociación de los complejos GH/GHBP,
afectando la precisión del resultado obtenido.
En 1990, Tar y col. utilizaron cromatografía líquida
de alta presión para evaluar los niveles de
GHBP en el plasma humano(86). Esta metodología
permitía una rápida resolución (evitando la disociación
de los complejos GH/GHBP) y resultaba más
reproducible que la tradicional de filtración en gel.
Posteriormente, en un estudio realizado por Ho
y col., se comparó el comportamiento de dos métodos
en la determinación sérica de GHBP: cromatografía
en gel versus un método de inmunoprecipitación
utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-RGH(88). Si bien, ambos métodos correlacionaron
positiva y significativamente entre sí, los autores encontraron una tendencia del método de
inmunoprecipitación a sobreestimar los niveles de
GHBP respecto de la filtración en gel, hecho que
explicaron por la posible disociación de los complejos
GH/GHBP en el tiempo de procesamiento
de la muestra por parte de este último.
También, se diseñaron inmunoensayos competitivos
(RIA) para la determinación de GHBP inmunoreactiva
en suero. Estos métodos determinan únicamente la concentración de la proteína en el
suero y no permiten conocer la cantidad de GHBP
total capaz de unir la GH (GHBP funcional). Además,
resulta imposible relacionar la concentración
de GHBP determinada en el suero por estos métodos
y la sensibilidad de los tejidos a la acción
de la GH(82).
En 1991, Lena Carlsson y col. diseñaron un
método inmunofuncional de ELISA tipo sándwich
para la determinación de la GHBP total y de los
complejos GH/GHBP endógenos(89), que posteriormente
fue modificado por Rajkovic y col.(90).
La ventaja de esta nueva metodología reside en la
posibilidad de determinar con mayor precisión la
concentración de la GHBP total y de los complejos
GH/GHBP endógenos presentes en el suero.
Posteriormente, se desarrolló un ensayo inmunofuncional
con señal de detección fluorométrica
que permite en forma específica y selectiva determinar
tanto la GHBP total sérica como los complejos
GH/GHBP endógenos con alta sensibilidad y
especificidad(66,91). La misma incluyó la marcación
del anticuerpo con especificidad anti-GHBP con
quelato de Europio y puesta a punto del método.
El inmunoensayo tiene por principio saturar el total
de GHBP presente en el suero con GH agregada
exógenamente, posibilitando la formación de
complejos GH/GHBP que son capturados por el
anticuerpo de captura con especificidad anti-GH
inmovilizado a una superficie sólida (pocillo de
microplaca). El complejo formado es luego reconocido
por un segundo anticuerpo con especificidad
anti-GHBP marcado con Europio. Finalmente,
y posterior al agregado de una solución disociante
e intensificadora de la señal de Europio, se mide la
fluorescencia que resulta directamente proporcional
a la concentración de GHBP de la muestra. Los
complejos de formación endógena entre la GH y
su proteína de transporte (GHBP) son cuantificados
de igual forma pero sin el agregado de la solución
saturante de GH (Figura 3).
Figura 3:
Esquema del método fluorométrico para la determinación de la concentración sérica de GHBP total inmunofuncional y complejos endógenos GH-GHBP. MAb a-GH: anticuerpo monoclonal con especificidad anti-hGH; MAb
a-GHBP-Eu3+: anticuerpo monoclonal con especificidad anti-GHBP marcado con quelato de europio; ON: over night.
La utilización de metodologías inmunofuncionales mediadas por ligando permiten la determinación de GHBP total y de los complejos endógenos formados entre esta proteína de transporte y la GH, pudiendo contribuir al entendimiento de la dinámica del eje somatotrófico en situaciones aún no del todo esclarecidas.
Utilidad del la determinación sérica de GHBP
Debido a la alta homología que existe entre la
GHBP sérica y el dominio extracelular del RGH, y la
relación positiva de esta proteína con la sensibilidad
a la GH, se ha propuesto que la determinación
de GHBP en suero podría constituir una marcador
periférico de la abundancia de RGH en los tejidos
blanco y colaborar, junto a otros parámetros, en
el estudio de pacientes con desórdenes del crecimiento(
8, 85).
Teniendo en cuenta que actualmente se cuenta
con inmunoensayos funcionales mediados por ligando,
es bueno que se considere la utilidad que
podría constituir tanto la determinación sérica de
GHBP total inmunofuncional como la determinación
de complejos endógenos GH/GHBP:
- Utilidad de la determinación de GHBP total:
Los avances obtenidos en el diagnóstico de pacientes
con insensibilidad a la acción de GH se debieron
principalmente a la caracterización molecular
de este síndrome(92,93). La abundancia del RGH en
la superficie celular constituye un determinante
importante de la sensibilidad celular a la acción de
GH y salvo algunas excepciones, la concentración
de GHBP total reflejaría la expresión del RGH en
los tejidos(85). En este sentido permitiría identificar
niños con diagnóstico probable de resistencia a la
GH, y orientar el posterior estudio molecular.
Alteraciones en el gen del RGH (actualmente se
han descrito más de 50 mutaciones del mismo) producen
insensibilidad a la acción de GH (IGH)(94). El
síndrome de Laron clásico (insensibilidad primaria
a la GH), es una patología causada por mutaciones
inactivantes del RGH, y dependiendo de la localización
de la mutación, la GHBP puede o no ser detectable
en suero. La mayoría de los pacientes con
IGH, presentan valores de GHBP no detectables o muy disminuidos, mientras que en un porcentaje
menor, están normales o aumentados(94):
• Mutaciones que afecten el dominio extracelular
del RGH o aquellas que interfieran con la
correcta síntesis del mismo (77% de los individuos
Laron)(94,95), presentarán niveles no dosables
de GHBP, también denominados "GHBP
negativos", en el caso de pacientes homocigotas
y heterocigotas compuestos(96). En pacientes
con un alelo normal y el otro afectado, los
niveles de GHBP podrían encontrase muy bajos,
pudiendo explicar esta situación hasta un
5% de las bajas tallas idiopáticas(97).
• Las mutaciones en regiones de la molécula del
RGH que afecten la dimerización y las señales
de transducción intracelulares, darán lugar al fenotipo
Laron con GHBP dosable o "GHBP positivos" (20-25% de los casos)(43-46, 94-95). Las mutaciones
que afectan los sitios de splicing pueden
generar la pérdida de los exones 8(98) ó 9(99) que
codifican para el dominio intracitoplasmático.
En el primer caso, se produce la ausencia del
dominio intracelular del receptor y la generación
de una molécula mutada del RGH virtualmente
idéntica a la GHBP, mientras que la pérdida
del exón 9 generaría una forma truncada
del RGH, asociada a niveles de GHBP en suero
entre 20-50 veces la concentración normal. Los
individuos heterocigotos para esta última mutación
presentan concentraciones de GHBP entre
2-10 veces superiores a la normal(85,94).
En 1997, Woods y col. realizaron un estudio
intensivo de la relación fenotipo: genotipo en
pacientes con síndrome de IGH(95). Los pacientes
fueron estudiados clínica, bioquímica y genéticamente,
y a su vez, fueron categorizados de
acuerdo a la presencia o ausencia de GHBP en
suero (GHBP positivos o GHBP negativos, respectivamente).
Tanto los pacientes GHBP positivos
o GHBP negativos presentaron déficit de talla,
aunque en los pacientes con niveles de GHBP
dosables, la altura parecía estar menos afectada
que en los pacientes con niveles no detectables
de esta proteína. Sin embargo, a pesar de la
gran heterogeneidad fenotípica observada en la población estudiada, estos autores no pudieron
encontrar una clara asociación entre el sitio o
tipo de mutación del gen del RGH y la severidad
de la enfermedad.
Por otro lado, partiendo de la premisa que
algunos niños con baja talla idiopática (BTI) son
considerados como deficientes no clásicos de
hormona de crecimiento, ya que responden en
forma favorable a las pruebas de estímulo de
secreción de esta hormona, Carlsson y col. investigó la hipótesis que la resistencia periférica
observada en estos niños, podía responder a
anormalidades en el receptor de GH y ésto, a
su vez, ser reflejado estudiando los niveles de
GHBP séricos en una población de niños con
deficiencia clásica de GH (DGH) y niños con
BTI, estudiados en relación a la edad cronológica
y sexo(100). Los niveles séricos de GHBP en
niños con BTI y niños con DGH fueron inferiores
al rango de normalidad estipulado por edad
y sexo, aunque esta disminución resultaba más
pronunciada en los niños con BTI. En este estudio,
el 90 % de los niños con BTI presentó niveles de GHBP por debajo de la media para
la edad y sexo, mientras que un subgrupo presentó una concentración de esta proteína por
debajo de -2 DE.
Attie y col. estudió en un grupo de pacientes
con BTI la concentración de IGF-I en SDS y la
concentración media de secreción nocturna de
GH en relación con la concentración de GHBP
en SDS. Los pacientes con niveles más bajos de
GHBP en SDS presentaron mayores niveles de
GH y bajo IGF-I, consistente con insensibilidad
a la acción de GH(101).
Los trabajos de Woods, Carlsson y Attie, ponen
de manifiesto la posible utilidad de la determinación
de GHBP en suero, que junto a otros
parámetros y pruebas funcionales, permitirían
identificar aquellos niños con diagnóstico probable
de resistencia a la acción de GH, en sus
formas parciales y severas (Sme. Laron), con el
fin de orientar el posterior estudio molecular del
gen del RGH.
Como fue mencionado anteriormente, niveles
normales o aumentados de GHBP total en un paciente
con diagnóstico probable de IGH, podrían
indicar fallas a nivel posreceptor (Ver defectos posreceptor
en el apartado del RGH).
Cabe finalmente mencionar que existen ciertas
situaciones fisiológicas y patológicas donde no se
establece el vínculo positivo entre la concentración
de GHBP circulante y la función del RGH,
como por ejemplo en la infancia temprana(63) y
en la acromegalia(102). Los pacientes acromegálicos
presentan baja concentración de GHBP, posiblemente
reflejo del "down-regulation" del RGH
ejercido por la alta concentración de GH, tal cual
fue demostrado in vitro(103). Por otro lado, existen
otras patologías crónicas, no relacionadas directamente
a alteraciones en el gen del RGH, donde los
niveles de GHBP total pueden estar disminuidos,
como en la insuficiencia renal, la diabetes mellitus
insulinodependiente, y patologías tendientes a la
reducción de la masa hepática funcionante como
la cirrosis(85). En la Tabla 2 se resumen las patologías
que se asocian a niveles anormales de GHBP
en suero:
Tabla 2: Patologías asociadas a variaciones en los niveles normales de la concentración sérica de GHBP.
- Utilidad en la determinación de complejos endógenos GH/GHBP
Existe escasa información en la literatura acerca
de la utilidad potencial de la determinación sérica
de los complejos endógenos entre la GH y su proteína
de transporte, GHBP. Probablemente, tenga
su explicación en la falta de métodos sensibles
y precisos que pudieran determinar la concentración
del complejo GH/GHBP. En el Laboratorio de
la División de Endocrinología del Hospital Ricardo
Gutiérrez se realizó un estudio de diferentes
componentes del eje GH-IGFs-BPs en niños con
obesidad simple, con el fin de explicar el normal/
aumentado crecimiento observado en estos niños
a pesar de la conocida disminución de la GH(66). La
población estudiada de obesos, presentó niveles
normales de IGF-I, IGFBP-3 y ALS (todos parámetros
GH dependientes) a pesar de una disminuida
concentración de GH al ser comparados con un
grupo de niños con peso adecuado. Por otro lado,
los niños obesos, tuvieron niveles significativamente
aumentados de la GHBP total (medida por
un método inmunofuncional mediado por ligando
generado en nuestro laboratorio). En el grupo
de niños obesos, los niveles de GHBP total correlacionaron
en forma positiva y significativa con el índice de masa corporal y la concentración de insulina.
Este aumento de la GHBP total, reflejo del
nivel de expresión del RGH en los tejidos blanco,
estaría indicando un aumento en la sensibilidad
a la acción de GH. Lo novedoso de este trabajo
resultó el hallazgo de niveles normales de complejos
endógenos GH/GHBP, medidos por la misma
metodología, lo que sugeriría la existencia de un
reservorio normal de GH en circulación para los
tejidos blanco.
Este trabajo pone de manifiesto que la determinación
conjunta de la GHBP total y complejos
GH/GHBP puede ser de utilidad para conocer la
dinámica del eje somatotrófico en su conjunto, tratando
de explicar situaciones aún no del todo esclarecidas
como el crecimiento normal/aumentado
habitualmente observado en niños obesos bajo un
estado de hiposomatrofinismo.
Conclusión
El receptor de hormona de crecimiento humana (RGH) es el efector más importante de la acción de la hGH en los tejidos, ya que mutaciones en los dominios que conforman su receptor producen una falla en su mecanismo de acción. La población normal puede expresar diferentes formas moleculares del RGH, producto de polimorfismos en las secuencias codificantes del gen del RGH. Sin embargo, todavía queda por dilucidar si estas variantes génicas podrían afectar algunos aspectos de la fisiología y/o farmacología de la acción de la hGH. Además, la hGH en el plasma se une con alta afinidad a la proteína de transporte (GHBP) generada por el clivaje proteolítico del dominio extracelular del RGH por acción de una enzima de membrana denominada TACE. A pesar del tiempo transcurrido desde su descubrimiento, aún hoy se desconoce la función biológica precisa de la GHBP en el plasma aunque está ampliamente documentada su relación con la secreción de GH, la composición corporal, la edad y el estatus de hormonas sexuales. Debido a la homología que existe entre la GHBP sérica y el dominio extracelular del RGH, y la relación positiva de esta proteína con la sensibilidad a la GH, se propone la determinación de GHBP en suero como un indicador periférico de la abundancia del RGH en los tejidos. Las controversias en la literatura respecto de sus niveles en plasma y su asociación a distintas condiciones clínicas, podrían deberse a aspectos metodológicos relacionados a la interferencias de la propia hGH del plasma en los ensayos para la determinación de GHBP. La utilización de metodologías inmunofuncionales de alta sensibilidad mediadas por ligando podrían constituir una herramienta útil a incluir en el estudio especialmente de pacientes con baja talla idiopática.
Agradecimientos
Las autoras desean agradecer la gentil colaboración
del Dr. Horacio Domené en la lectura de la
presente revisión previa a su publicación. Además, quieren resaltar el equipo de salud que integran
junto a médicos, bioquímicos, técnicos y enfermeros
del Grupo Crecimiento de la División de
Endocrinología del Hospital de Niños Dr. Ricardo
Gutiérrez para el estudio de niños con alteraciones
del crecimiento.
Parte de los resultados presentados en la
presente revisión fueron realizados con subsidios
otorgados por el Laboratorio Pfizer Global
Pharmaceutical y el PICT/2003 Nº 05-14354.
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