Medio EMJH modificado para el cultivo de Leptospira interrogans serogrupo Ballum
A. González*, R. Borrero, J. Ruiz, N. Batista, Y. Fernández, Y. Valdés, M. González
Instituto Finlay. Ave 27 N 19805, La Lisa, AP16017,
(11600), Ciudad de La Habana, Cuba.
*Correspondencia. E-mail: andresglez@finlay.edu.cu
RESUMEN
El serogrupo Ballum agrupa cepas de crecimiento fastidioso, con requerimientos
nutricionales más exigentes que otras cepas patógenas de Leptospira.
Fue evaluada la influencia de 37 compuestos nutricionales
sobre el crecimiento de Leptospira interrogans serogrupo Ballum, tomando
como base para el estudio al medio sintético EMJH. El crecimiento microbiano
fue estimado espectrofotométricamente y por conteo directo en cámara
de Petroff-Hausser. La estabilidad de la virulencia fue evaluada en hamsters
mediante el cálculo de la dosis letal media. La estabilidad de la antigenicidad
fue evaluada mediante Western blotting con antisuero policlonal específico.
Bajo condiciones de cultivo controladas se logró triplicar los rendimientos
de biomasa comúnmente obtenidos en el medio EMJH sin afectación
de la virulencia y antigenicidad tras el incremento de la concentración
de Tween 80 y la incorporación de acetato de sodio y extracto de carne.
El incremento de la concentración de al menos 6 componentes del EMJH
o la incorporación de una variedad de nuevos nutrientes no estimularon
apreciablemente los rendimientos de biomasa o la velocidad específica
de crecimiento del microorganismo. Los resultados obtenidos permiten disponer
de un medio de cultivo enriquecido capaz de sustentar elevados rendimientos
de biomasa de este serogrupo exigente de mayor circulación en humanos
en Cuba.
Palabras clave: Leptospira, medios de cultivo, crecimiento
ABSTRACT
Modified EMJH medium for cultivation of Leptospira interrogans serogroup
Ballum. Strains within the Ballum serogroup of spirochete Leptospira
show fastidious growth with more exigent nutritional requirements than those
of other Leptospira pathogenic strains. The influence of 37 nutritional
compounds on the growth of Leptospira interrogans serogroup Ballum was
investigated employing the synthetic EMJH medium as the base for the study.
Microbial growth was estimated spectrophotometrically and direct counts were
performed with a Petroff-Hausser counting chamber. Virulence stability was evaluated
by calculating the mean lethal dose in hamsters. Antigenicity stability was
evaluated by Western blotting using a specific antiserum. Cell yields commonly
obtained in EMJH were triplicated without virulence or antigenicity depletions
after culturing in a modified EMJH medium with an increased concentration of
Tween 80, and the incorporation of sodium acetate and beef extract. Neither
the increased concentration of at least 6 components of EMJH nor the incorporation
of a variety of new nutrients stimulated cell yields or the growth rate of the
microorganism. The results allow us to make use of an enriched culture medium
that promotes high cell yields of this fastidious serogroup most prevalent in
humans in Cuba.
Key words: Leptospira, culture media, growth
INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una zoonosis bacteriana de
amplia distribución mundial causada por espiroquetas patógenas
pertenecientes al género Leptospira, agrupadas en casi 230 serovares
y 24 serogrupos (19). La enfermedad en humanos puede variar desde una infección
subclínica hasta un síndrome severo de rápida progresión
y elevada mortalidad, o aparecer como grandes brotes en zonas urbanas de países
en desarrollo (15, 19). A pesar del enorme interés de la comunidad científica
en desarrollar nuevas estrategias de vacunas que garanticen un amplio espectro
de protección, las vacunas de células enteras inactivadas continúan
siendo en la actualidad la medida inmunoprofiláctica más eficaz,
con una protección serogrupo específica y de corta duración
(19).
Estudios relativamente recientes sugieren la incidencia de al menos 11 serogrupos
en humanos en Cuba, y es el serogrupo Ballum la principal causa de la enfermedad
en todo el país (25). Ante la actual situación epidemiológica,
varias investigaciones se han encaminado hacia la evaluación de la potencialidad
vacunal de cepas clínicas autóctonas pertenecientes a este serogrupo
de amplia circulación, no incluido en la vacuna trivalente aplicada en
la actualidad a grupos humanos de riesgo (9, 10). Algunas de estas investigaciones
han revelado el carácter exigente del crecimiento de cepas pertenecientes
al serogrupo Ballum en los medios comúnmente utilizados para el cultivo
in vitro de Leptospira, aspecto que ha sido evidenciado con anterioridad
por otros investigadores (26, 28).
En tal sentido, resulta de marcado interés el desarrollo de nuevos medios
de cultivo factibles para la producción de vacunas de células
enteras para uso humano, que sustenten elevados rendimientos celulares de estas
cepas exigentes sin que se vean afectadas otras propiedades importantes, como
su virulencia y antigenicidad. El presente trabajo tuvo como objetivos diseñar
y evaluar un medio de cultivo factible para el escalado productivo de Leptospira
interrogans serogrupo Ballum.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas bacterianas
Se utilizó en el estudio la cepa candidata vacunal 42600 de Leptospira
interrogans s.l. serogrupo Ballum, aislada en el año 2000 en la provincia
de Holguín por hemocultivo de un paciente con sintomatología compatible
con leptospirosis, y que fue posteriormente donada al Instituto Finlay por el
Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de la citada provincia.
Se incluyó como control de crecimiento en algunos ensayos la cepa vacunal
87 de Leptospira interrogans s.l. serogrupo Canicola, originalmente aislada
de muestras animales remitidas al Centro Nacional de Diagnóstico Veterinario
de Ciudad de La Habana. Las cepas fueron conservadas en medio semisólido
de Fletcher (5) y mantenidas rutinariamente en medio EMJH (5) bajo condiciones
estáticas a 28-30 ºC. La virulencia fue mantenida a través
de pases periódicos en hámsteres, según los métodos
descritos (5).
Inóculo y condiciones de cultivo
En todos los estudios nutricionales se emplearon como inóculos cultivos
en fase exponencial crecidos en medio EMJH (Albúmina A8022, Sigma) bajo
condiciones controladas (30 °C, 130 rpm). Todas las evaluaciones se realizaron
por triplicado empleando erlenmeyers de 250 ml de capacidad, con 50 ml de medio
fresco inoculado hasta una concentración microbiana inicial de 3-4 x
108 células/ml. Tras la inoculación, los cultivos fueron
incubados durante 6 días bajo condiciones controladas de temperatura
y agitación (30 °C, 130 rpm).
Compuestos nutricionales
Tomando como base el medio sintético EMJH, se evaluó la influencia
sobre el crecimiento de la cepa 42600 de Ballum de un incremento en la concentración
de 7 compuestos nutricionales presentes en el referido medio de cultivo, así
como la incorporación de 30 nuevos compuestos (Tabla
1). La influencia de cada compuesto nutricional fue evaluada de forma individual
adicionando concentraciones crecientes del mismo al medio EMJH, para lo cual
fueron preparadas en el momento soluciones madres a concentraciones apropiadas
empleando agua destilada estéril. Cada solución madre fue ajustada
a pH 7,0-7,2, esterilizada mediante filtración (0,2 µm) e incorporada
al medio de cultivo asépticamente. En los casos de interés, se
evaluó el efecto sinérgico de dos o más nutrientes simultáneamente.
Evaluación del crecimiento
El crecimiento fue estimado espectrofotométricamente (Ultrospec III,
Amersham) cada 24 horas durante 6 días, tomando muestras asépticamente.
En varios casos se determinó la concentración microbiana mediante
conteo directo en cámara de Petroff-Hausser y se calcularon parámetros
del crecimiento microbiano, como velocidad de crecimiento específica
y tiempo de duplicación, según las fórmulas descritas (21).
Fueron evaluadas además características culturales, como motilidad
y uniformidad celular (posible aparición de células alargadas
o pleomorfismo), mediante observación directa bajo el microscopio de
campo oscuro. Se realizaron controles de pureza en todos los cultivos mediante
siembra en caldo tripteína de soja y caldo tioglicolato. Los resultados
de la estimación del crecimiento fueron comparados estadísticamente
mediante el Test de Duncan, con un nivel de significación α=0,05 (18).
Evaluación de la virulencia
La estabilidad de la virulencia de la cepa tras cada cambio nutricional se evaluó
mediante la metodología propuesta por González et al.,
empleando hámsteres sirios dorados de 45-50 g de peso (8). En los casos
de interés, se evaluó cuantitativamente la virulencia mediante
el cálculo de la dosis letal media, según la metodología
propuesta por Fajardo et al. (6).
Preparación de antisuero específico
en conejos
Se elaboró un antisuero policlonal específico para la cepa 42600
de Leptospira interrogans serogrupo Ballum crecida en medio EMJH. Conejos
Nueva Zelanda adultos, de 1,5-2 kg de peso, fueron inmunizados con 1 ml de una
suspensión (109 células) de leptospiras lavadas y resuspendidas
en tampón fosfato salino estéril pH 7,2 (TFS: NaCl 137 mM, KCl
2,7 mM, Na2HPO4 10mM), sonicadas y mezcladas con igual volumen de
adyuvante completo de Freund (Sigma). El inmunógeno así preparado
fue dividido en volúmenes iguales y aplicado en dos sitios por vía
intramuscular y en otros dos por vía subcutánea. Tras 4 y 8 semanas
desde la primera inmunización, se aplicó una segunda y una tercera
inmunización con 1 ml de sonicado de células (109 células)
mezclado con igual volumen de adyuvante incompleto de Freund; en ambos casos
se utilizó la misma vía combinada intramuscular-subcutánea.
Transcurridos 14 días después de la última inmunización,
los animales fueron sangrados por punción intracardíaca.
Evaluación de la antigenicidad
La estabilidad en la expresión de los principales antígenos inmunorrelevantes
tras el cultivo reiterado en medio EMJH modificado se evaluó mediante
la técnica de Western blotting según el procedimiento previamente
descrito (9), con ligeras modificaciones. Brevemente, muestras de 8 x 106
células fueron solubilizadas en tampón de lisis con 62,5 mM Tris-HCl
pH 6,8, 10% glicerol, 5% 2-mercaptoetanol y 2% dodecil sulfato de sodio (SDS).
Las muestras así tratadas fueron mantenidas durante toda la noche a 4
°C y luego separadas mediante SDS-PAGE empleando un gel separador al 12,5%.
Luego de la separación de las proteínas, los geles fueron teñidos
con azul brillante de Coomassie y analizados mediante analizador de imágenes
(ImageMaster VDS, Amersham) o transferidos a membrana de nitrocelulosa. Para
la detección antigénica, la nitrocelulosa fue bloqueada con leche
descremada al 3% en TFS y luego incubada durante 2 horas con antisuero de conejo
diluido 1:100 en solución de bloqueo con 0,05% de Tween 20. Para la visualización
de las bandas, se incubó una hora con conjugado proteína A-peroxidasa
(Sigma) y luego se aplicó el sustrato de la enzima.
RESULTADOS
Estudios nutricionales
Los estudios nutricionales realizados tuvieron como base el medio sintético
EMJH. Al analizar la cinética de crecimiento de la cepa 42600 en ese
medio bajo condiciones de cultivo controladas, empleando como inóculo
un cultivo joven crecido en el mismo medio y bajo las mismas condiciones, se
apreció una ausencia de fase de latencia; sin embargo, el crecimiento
exponencial se extendió solamente hasta el tercer día de incubación
y alcanzó la mitad del rendimiento de biomasa logrado por una cepa del
serogrupo Canicola bajo las mismas condiciones de cultivo. Los escasos rendimientos
alcanzados por la cepa del serogrupo Ballum con el cultivo en medio EMJH fueron
independientes de la talla de inóculo empleada, obteniéndose rendimientos
similares con inóculos del 20 al 50% del volumen final del cultivo (datos
no mostrados).
Fue evaluada la influencia sobre el crecimiento de Ballum de un incremento de
la concentración de 7 componentes del medio EMJH incluyendo la fuente
principal de carbono y energía (Tween 80), la fuente de nitrógeno
(NH4Cl), la fuente de hierro (FeSO4) y los factores de
crecimiento glicerol, piruvato de sodio, tiamina (B1) y cianocobalamina
(B12). Sólo el incremento de la concentración de la
fuente de carbono desde 1,25 mg/ml (utilizada para el EMJH) hasta 3 mg/ml produjo
un aumento significativo de los rendimientos celulares finales sin incidir sobre
otras características culturales, como motilidad y uniformidad celular.
Un incremento adicional de la concentración de Tween 80 condujo a una
disminución de los rendimientos celulares, con la aparición de
células muertas y abundantes detritos. Este efecto citotóxico
fue generalizado al incorporar concentraciones de la fuente de carbono mayores
de 3,25 mg/ml (Figura 1). El incremento de la concentración
del resto de los componentes del medio EMJH evaluados no influyó significativamente
en los rendimientos celulares finales ni en la velocidad específica de
crecimiento de la cepa.
Al evaluar la influencia de otras fuentes de carbono
reportadas para Leptospira, como los polisorbatos de ácido esteárico
(Tween 60) y de ácido palmítico (Tween 40), se apreció
un efecto similar al registrado con el polisorbato de ácido oleico (Tween
80). La incorporación al medio EMJH de Tween 60 hasta 1 mg/ml o Tween
40 hasta 1,25 mg/ml condujo a un incremento significativo de los rendimientos
de biomasa, aunque las características culturales fueron cualitativamente
inferiores a las mostradas por la cepa cultivada con Tween 80 como única
fuente de carbono y energía, ya que se observó una disminución
de la motilidad y un incremento de células largas o pleomorfismo. Concentraciones
superiores a las citadas determinaron una disminución del rendimiento
de biomasa y un incremento de células muertas en el cultivo. Fueron evaluadas,
además, varias mezclas de Tween 80/60 y 80/40 en diferentes proporciones
como fuente de carbono y energía. Ninguna de las mezclas de polisorbatos
ensayadas fue superior al Tween 80 como única fuente de ácidos
grasos para el cultivo de la cepa 42600 de Ballum (datos no mostrados).
La incorporación de suero de conejo o de carnero al medio EMJH estimuló
ligeramente el crecimiento de la cepa de Ballum, sin llegar a alcanzar los rendimientos
obtenidos con el incremento de Tween 80. En ambos casos no se registró
efecto citotóxico, al menos hasta la incorporación de un 10% de
suero, aunque por encima de un 5% comenzaron a aparecer células largas
o pleomorfismo. El efecto estimulador de ambos suplementos nutricionales no
pudo ser equiparado con su sustitución por suero fetal bovino o con la
incorporación de una variedad de factores de crecimiento séricos
como hemoglobina, hemina o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD).
Tampoco la incorporación de vitaminas y coen-zimas, como ácido
pantoténico, ácido-p-aminobenzoico o riboflavina; de azúcares,
como glucosa; ni de agentes antioxidantes, como glutatión y MnSO4,
estimularon apreciablemente el crecimiento de la cepa candidata vacunal de Ballum.
Un significativo incremento de los rendimientos celulares fue observado tras
la incorporación al medio EMJH de concentraciones crecientes de acetato
de sodio. La adición de este nutriente estimuló el rendimiento
de biomasa de forma proporcional a la concentración hasta 0,2 mg/ml,
a partir de la cual un incremento adicional no repercutió apreciablemente
en los rendimientos obtenidos; no obstante, no se observó efecto citotóxico,
al menos hasta 0,4 mg/ml. El efecto estimulador del acetato de sodio fue aún
más evidente tras su incorporación al medio EMJH previamente modificado
por un incremento de la concentración de Tween 80 hasta 2,75 mg/ml (Figura
2). Los rendimientos de biomasa alcanzados con la adición de ambos
nutrientes a la vez fueron muy superiores a aquellos logrados con la adición
de uno u otro nutriente de forma individual.
La incorporación al medio EMJH de complejos orgánicos ricos en factores de crecimiento, como el extracto de levadura o de carne, así como una variedad de fuentes de nitrógeno, como peptona de carne, peptona de caseína, triptosa, proteosa peptona o aminoácidos libres, no estimularon el crecimiento de Ballum. Sin embargo, al incorporar al medio EMJH previamente modificado con Tween 80 (2,75 mg/ml) y acetato de sodio (0,2 mg/ml) concentraciones crecientes de fuentes orgánicas de nitrógeno, como extracto de carne o proteosa peptona,se observó un significativo incremento de los rendimientos celulares finales (Figura 3). Este marcado efecto estimulador del crecimiento no se obtuvo sustituyendo las fuentes de nitrógeno orgánicas anteriores por fuentes inorgánicas, como NH4Cl, como así tampoco por la adición de al menos 9 aminoácidos individuales o la mezcla de ellos (Figura 4).
Los estudios nutricionales realizados permitieron la definición de un medio de cultivo cualitativamente superior al medio EMJH para el crecimiento de la cepa candidata vacunal 42600 de Leptospira interrogans serogrupo Ballum, que incluyó la adición de Tween 80 hasta 2,75 mg/ml y la incorporación de 0,2 mg/ml de acetato de sodio y 8 mg/ml de extracto de carne; este medio de cultivo fue utilizado en ulteriores ensayos de estabilidad de la virulencia y antigenicidad de la cepa. Cada una de las modificaciones realizadas al medio EMJH condujeron a incrementos significativos de los rendimientos de biomasa con respecto a la variante anterior que le dio origen (Tabla 2). Por otro lado, el cultivo de la cepa 42600 de Ballum en medio EMJH modificado permitió alcanzar parámetros de crecimientos similares a los logrados por la cepa vacunal 87 del serogrupo Canicola cultivada en medio EMJH (Tabla 3).
Estabilidad de la virulencia
Ninguno de los nutrientes incorporados al medio EMJH, independientemente de
su efecto sobre el crecimiento, afectó la capacidad de la cepa 42600
de producir infección letal en el modelo hámster sirio dorado.
Tampoco se registró disminución de la dosis letal media tras varios
subcultivos sucesivos en medio EMJH modificado, mediante el incremento de la
concentración de Tween 80 (hasta 2,75 mg/ml) y la incorporación
de 0,2 mg/ml de acetato de sodio y 8 mg/ml de extracto de carne.
Estabilidad de la antigenicidad
El cultivo reiterado de la cepa 42600 en el medio EMJH modificado no produjo
alteración en la expresión de los principales antígenos
inmunorrelevantes según la técnica de Western blotting,
empleando para la detección un antisuero policlonal específico
producido en conejos previamente inmunizados con la cepa crecida en el medio
EMJH (Figura 5).
DISCUSIÓN
El serogrupo Ballum agrupa cepas de crecimiento
fastidioso, con requerimientos nutricionales más exigentes que otras
cepas patógenas de Leptospira (5, 9, 26, 28). Los escasos rendimientos
alcanzados por la cepa candidata vacunal 42600 del serogrupo Ballum en el medio
EMJH confirman el hecho de que este medio sintético, actualmente el más
utilizado para el cultivo de cepas de Leptospira, resulta inapropiado
para el escalado productivo de una vacuna de células enteras de este
serogrupo exigente, de mayor circulación en humanos en Cuba. Por ello
se torna necesario el diseño y la evaluación de un medio enriquecido,
que permita alcanzar los rendimientos de biomasa requeridos para la producción.
Los resultados obtenidos en el presente estudio confirman la importancia de
los ácidos grasos de cadena larga en el metabolismo de Leptospira,
los cuales no sólo constituyen la principal fuente de carbono y energía,
sino que además son requeridos como fuente exógena de lípidos
dado que Leptospira no es capaz de sintetizar ácidos grasos de
novo (5, 12-14). Los resultados de nuestras evaluaciones con el serogrupo
Ballum son comparables a los reportados anteriormente para cepas del serogrupo
Pomona, donde se observó una estimulación del crecimiento al incrementar
la concentración de Tween 80 en el medio EMJH, manteniendo constante
la concentración de albúmina bovina (8). Ambos estudios sugieren
que en el medio EMJH la capacidad destoxificante de la albúmina no ha
sido completamente saturada y que un incremento de la concentración de
ácidos grasos hasta determinados niveles y bajo condiciones de cultivo
controladas, lejos de tener un efecto citotóxico, estimula el crecimiento
celular. Un incremento de la concentración de otros macronutrientes del
medio EMJH, como las fuentes de nitrógeno y de hierro, no estimularon
apreciablemente el rendimiento de biomasa ni la velocidad específica
de crecimiento, lo cual sugiere que estos nutrientes no limitan el crecimiento
de la cepa en estudio o que las fuentes utilizadas para su suministro no son
mayormente asimiladas al aumentar su concentración. De la misma forma,
los resultados sugieren la presencia en el medio EMJH de concentraciones saturantes
de factores de crecimiento como vitaminas B1 y B12, piruvato de sodio y glicerol.
A pesar de que el medio EMJH presenta como única fuente de ácidos
grasos de cadena larga al Tween 80, algunos autores recomiendan el empleo de
una mezcla de polisorbatos para el crecimiento de cepas exigentes de Leptospira
(4). La incorporación de Tween 60 y 40 al medio EMJH hasta niveles no
citotóxicos estimuló el crecimiento de la cepa Ballum; sin embargo,
la adición de estos polisorbatos no superó los rendimientos de
biomasa ni las cualidades del cultivo alcanzadas por la cepa con una concentración
incrementada de polisorbato de ácido oleico (Tween 80) como única
fuente de carbono. Algunos investigadores plantean que los ácidos grasos
insaturados como el oleico soportan un crecimiento superior que variantes saturadas
con similar número de átomos de carbono (esteárico, palmítico)
a la misma concentración (29).
Otras fuentes suplementarias de ácidos grasos de cadena larga utilizadas
por Leptospira las constituyen los sueros animales, los que además
son ricos en factores de crecimiento. Entre los más comúnmente
empleados se encuentran el suero de conejo, constituyente esencial de los primeros
medios de cultivo desarrollados para este microorganismo, como los de Fletcher,
Korthof y Stuart (7, 16, 30), y el suero de carnero (24). El ligero efecto estimulador
del crecimiento observado con ambos suplementos nutricionales puede deberse
a su aporte adicional de ácidos grasos de cadena larga, más que
a otros factores de crecimiento presentes, dado que los resultados obtenidos
no fueron equiparados con la incorporación de factores de crecimiento
séricos o con suero fetal bovino.
Ha sido tradicionalmente reconocido que Leptospira no es capaz de utilizar
azúcares como fuente de carbono y energía (5, 11), a pesar de
haber sido demostrada recientemente la presencia de todos los genes necesarios
para la vía glicolítica (22). Los mismos autores sugieren que
las dificultades en la utilización de la glucosa por este microorganismo
radican en la ineficiencia de los mecanismos de transporte hacia el interior
celular. Sin embargo, algunos investigadores han planteado que la adición
de glucosa al medio de cultivo promueve el crecimiento de algunas cepas de Leptospira
(3). Los resultados de nuestras evaluaciones no evidenciaron una estimulación
del crecimiento de la cepa de Ballum al incorporar glucosa al medio EMJH.
Estudios recientes confirmaron la ausencia de genes para superóxido dismutasas
en cepas de Leptospira (22). Esta deficiencia quizá conduzca al
microoganismo hacia un estrés oxidativo por acumulación de radicales
superóxido formados durante la respiración aerobia, especialmente
en condiciones de cultivo aireadas, como las empleadas en nuestros ensayos.
La incorporación al medio de cultivo de agentes antioxidantes secuestradores
de aniones superóxido, como el glutatión (20) o el MnSO4
(31), recomendados para otros microorganismos exigentes, no tuvo un efecto apreciable
sobre el crecimiento de esta cepa. Estos resultados tienden a corroborar la
hipótesis sobre la existencia en Leptospira de mecanismos alternativos
a las superóxido dismutasas, como las metaloporfirinas (22).
Un marcado efecto estimulador del crecimiento se obtuvo al incorporar acetato
de sodio al medio EMJH. Dada la naturaleza aerobia estricta del metabolismo
de Leptospira (5, 11), el efecto estimulador del acetato de sodio se
explica teniendo en cuenta que el mismo constituye una fuente adicional de acetil-CoA,
vía de entrada al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (17),
aun cuando el aporte principal de esta molécula en Leptospira
lo brinda la b-oxidación de los ácidos grasos de cadena larga
(5, 22, 23). Por otro lado, algunos microorganismos fermentadores de ácidos
grasos, como Clostridium kluyveri, utilizan acetato en un mecanismo indirecto
para la activación de los ácidos grasos (17). En tal sentido,
algunos investigadores han sugerido la incorporación de acetato de sodio
a los medios de cultivo de Leptospira (1). Un aporte adicional de acetil-CoA,
al incrementar la concentración de piruvato de sodio, uno de los factores
de crecimiento de Leptospira presentes normalmente en el medio EMJH,
podría haber resultado en un efecto favorable. Sin embargo, el incremento
de la concentración de piruvato en al menos 10 veces no estimuló
apreciablemente ni los rendimientos de biomasa ni la velocidad específica
de crecimiento del microorganismo. Este resultado puede deberse a la fuerte
regulación negativa a la que es sometido el complejo enzimático
de la piruvato deshidrogenasa en presencia de elevados niveles de ATP (17).
Al parecer, la energía en forma de ATP liberada por la b-oxidación
de los ácidos grasos de cadena larga es suficiente para producir la inhibición
o disminución de la actividad enzimática del complejo piruvato
deshidrogenasa, lo cual no ocurre con la acetil-CoA sintetasa, enzima responsable
de generar Acetil-CoA a partir de acetato libre.
Ha sido reconocido que Leptospira es capaz de sintetizar todos los aminoácidos
esenciales a partir de una fuente inorgánica de nitrógeno como
las sales de amonio (2, 5) y, de hecho, el NH4Cl constituye la única
fuente de nitrógeno presente en el medio EMJH. En contraste con otras
espiroquetas patógenas, como Borrelia burgdorferi y Treponema
pallidum, Leptospira presenta los genes de todos los sistemas enzimáticos
implicados en la biosíntesis de aminoácidos (23). Sin embargo,
algunos autores recomiendan la incorporación de fuentes orgánicas
como extracto de carne (7) o aminoácidos (29), a pesar de que estos últimos
no logran satisfacer por sí solos los requerimientos de nitrógeno
en muchas cepas patógenas (5, 11, 29). Los resultados de nuestros estudios
sugieren que un incremento de la concentración de nitrógeno inorgánico
no es mayormente asimilado por cepas pertenecientes al serogrupo Ballum en un
medio con una proporción no balanceada de carbono/nitrógeno, como
el medio EMJH modificado por un incremento de Tween 80. Sin embargo, este desequilibrio
logró revertirse suministrando una mezcla rica en aminoácidos
libres, dipéptidos y péptidos de bajo peso molecular, entre otros
nutrientes aportados por el extracto de carne o la proteosa peptona. Leptospira
posee una variedad de transportadores en la membrana específicos para
el transporte de aminoácidos libres, dipéptidos y péptidos
de bajo peso molecular (23), que le permiten la asimilación simultánea
de una gran gama de moléculas nitrogenadas con el consiguiente ahorro
energético que ello presupone. Además del elevado aporte nutricional,
estas fuentes tal vez ejerzan un efecto destoxificante y estabilizador sobre
los ácidos grasos libres, de forma similar a lo que ocurre con la albúmina
bovina, lo cual podría estar contribuyendo al notable incremento de la
velocidad específica de crecimiento observado tras su incorporación.
Los estudios nutricionales realizados en este trabajo permiten disponer de una
variante de medio EMJH enriquecido, que incluye el incremento de la concentración
de Tween 80 hasta 2,75 mg/ml y la incorporación de acetato de sodio a
una concentración de 0,2 mg/ml y de extracto de carne a una concentración
de 8 mg/ml, manteniendo constante las concentraciones del resto de los componentes
del medio EMJH. Esta variante de medio proteico enriquecido permitió
triplicar los rendimientos de biomasa comúnmente alcanzados por la cepa
42600 de Ballum en el medio EMJH bajo las mismas condiciones de cultivo. El
cultivo reiterado en el medio modificado no conllevó a una disminución
de la virulencia, según los resultados de la dosis letal media en el
modelo hámster sirio dorado. De la misma forma, se mantuvo inalterada
la expresión de los principales antígenos inmunorrelevantes, según
la técnica de Western blotting, con un antisuero policlonal específico
producido en conejos con la cepa crecida en medio EMJH. Es necesario destacar
que el medio de cultivo propuesto ha sido diseñado para alcanzar elevados
rendimientos celulares bajo condiciones de cultivo controladas, empleando un
inóculo en fase exponencial crecido bajo las mismas condiciones. Dada
la alta concentración de ácidos grasos libres presentes en el
medio modificado, el mismo no se recomienda para cultivos estáticos o
para cultivos agitados cuyos inóculos provengan de cultivos estáticos.
En cualquier caso, las células expuestas a tan altas concentraciones
de Tween 80 deberán presentar una elevada tasa metabólica que
les permita una óptima asimilación del nutriente.
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Recibido: 13/6/05
Aceptado: 8/5/06