Optimización del desarrollo de Paenibacillus larvae en medios semiselectivos
F. J. Reynaldi, A. M. Alippi*
Centro de Investigaciones de Fitopatología
(CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de
La Plata, c.c. 31, calles 60 y 118, (1900) La Plata, Argentina.
* Correspondencia. E-mail: alippi@biol.unlp.edu.ar
RESUMEN
Se evaluó la capacidad de recuperación de esporas viables de Paenibacillus
larvae en medio MYPGP y MYPGP con el agregado de ácido nalidíxico
y ácido pipemídico, en diferentes concentraciones. No se hallaron
diferencias significativas en la recuperación para los tiempos de incubación,
los medios y el rango de concentración de esporas ensayados. La recuperación
de células vegetativas a partir de PBS no presentó diferencias
en los tiempos de incubación ni en las diluciones ensayadas, sin embargo
se vio disminuida significativamente con el aumento de la concentración
de ácido nalidíxico y ácido pipemídico en el medio.
De acuerdo con nuestros resultados, proponemos para la recuperación de
esporas a partir de mieles, el empleo del medio MYPGPNALPIAB (9 μg/ml
ac. nalidíxico y 20 μg/ml ac. pipemídico), en particular
para mieles con poblaciones heterogéneas de esporas bacterianas; en tanto
que para el cultivo de células vegetativas es conveniente el medio MYPGP
o MYPGPNALPIAA (6 µg/ml ac. nalidíxico y 10 µmg/ml
ac. pipemídico).
Palabras clave: Paenibacillus larvae , loque americana, miel,
MYPGP, esporas, abejas
ABSTRACT
Optimization of the growth of Paenibacillus larvae in semi-selective
media. The sensitivity of media MYPGP, MYPGPNALPIA A (6 µg/ml
nalidixic acid and 10 µg/ml pipemidic acid) and MYPGPNALPIA
B (9 µg/ml nalidixic acid and 20 µg/ml pipemidic acid) for the recovery
of viable spores of Paenibacillus larvae from honey, was evaluated by
using different incubation times and different spore concentrations. No significant
differences between incubation times, spore concentration or culture media were
found. In the case of the recovery of vegetative cells from PBS at different
incubation times and different dilutions no significant differences were found
between the incubation times or the dilutions tested, while significant differences
were found in the three media when compared with one another, MYPGPNALPIAB
providing the lowest recovery of vegetative cells. Considering these results,
we propose the use of MYPGPNALPIAB to recover spores of P. larvae
from honey, specially for honeys with heterogeneous populations of bacterial
spores; when culturing vegetative cells, MYPGP or MYPGPNALPIAA must
be used to obtain good growth.
Key words: Paenibacillus larvae, American Foulbrood, honey, MYPGP,
spores, honeybees
La loque americana, causada por la bacteria esporulada
Paenibacillus larvae (8, 11), es la enfermedad más grave de la
etapa larval de las abejas domésticas (Apis mellifera L.). Es
altamente contagiosa y una de las pocas enfermedades capaces de matar a una
colmena. Plantea problemas únicos para su prevención y control
debido a que las esporas bacterianas mantienen su capacidad infectiva por largos
períodos y pueden sobrevivir bajo condiciones ambientales adversas (5,
15). Los síntomas clínicos se manifiestan en los cuadros de cría
larval con un aspecto de cría salteada; las celdas afectadas presentan
los opérculos hundidos y oscurecidos, de apariencia húmeda y con
perforaciones irregulares. Al introducir un palillo a través del opérculo,
se extrae una masa viscosa de color variable entre amarillento y castaño
oscuro, casi negro, que se estira más de 2,5 cm. Con el correr del tiempo,
se forma una escama que se adhiere firmemente al capullo y hacia el piso y fondo
de las celdas. Cada una de estas escamas contiene dos mil quinientos millones
de esporas, que representan la forma infectiva capaz de iniciar el ciclo de
la enfermedad cuando las larvas las ingieren, junto con el alimento (5, 15).
En la Argentina, la loque americana se detectó por primera vez en 1989
(1, 2) y desde entonces se ha diseminado rápidamente por todas las áreas
apícolas del país. Estudios previos realizados sobre muestras
de miel provenientes de la provincia de Buenos Aires mostraron una incidencia
de la enfermedad superior al 50 % (4).
Se han desarrollado varios métodos para el aislamiento de esporas viables
de P. larvae a partir de miel, entre ellos la siembra directa de la muestra
de miel (9, 10) y la concentración de esporas por diálisis (16)
o centrifugación (12) y posterior siembra del concentrado de esporas
en medios específicos y/o semiselectivos (3, 12, 17). La incorporación
de distintas concentraciones de antibióticos a un medio basal apto para
el desarrollo de P. larvae permite una buena recuperación de esporas
del patógeno a partir de mieles con poblaciones heterogéneas de
especies bacterianas esporuladas aeróbicas y/o microaerófilas
(3, 4). El medio MYPGP, desarrollado por Dingman y Stahly para el cultivo de
P. larvae (7), presenta el mejor porcentaje de recuperación de
esporas de esta especie a partir de miel, en tanto que el agar J, el agar cerebro-corazón
fortificado con tiamina, el agar base Columbia suplementado con sangre ovina
y el agar sangre de caballo suplementado son menos eficientes en este sentido
(14).
El objetivo del presente trabajo fue optimizar las condiciones de cultivo para
obtener una máxima recuperación de P. larvae a partir de
mieles con diversas concentraciones de esporas. Para ello, se ensayaron distintas
concentraciones de los antibióticos ácido nalidíxico y
ácido pipemídico, diferentes tiempos de incubación y mieles
con diversas concentraciones de esporas del patógeno. Adicionalmente,
se evaluaron los mismos medios de cultivo para recuperar células vegetativas
de P. larvae a partir de PBS (buffer fosfato salino).
Para evaluar la recuperación de las células vegetativas se preparó
una suspensión en 1,5 ml de PBS de un cultivo de 24 h de la cepa de Paenibacillus
larvae ATCC 9545. Se corroboró la ausencia de esporas mediante observación
microscópica de frotis teñidos (14) y por shock térmico
de una alícuota de concentrado (6). La suspensión se ajustó
a una concentración final de 3,125 x 109, a partir de la cual
se realizaron diluciones en base 10, sembrando por cuadruplicado las diluciones
1/105, 1/106 y 1/107, a razón de 100
µl por placa en los medios MYPGP, MYPGPNALPIA A y MYPGP NALPIA
B, respectivamente. Las placas sembradas se incubaron en aerobiosis a 37 °C
y se contabilizaron las UFC por placa a las 48 y 96 h. Los datos fueron transformados
y analizados estadísticamente de igual modo que los obtenidos para esporas.
Para el caso de las células vegetativas de P. larvae, se observó
que no existieron diferencias significativas entre los medios MYPGP, MYPGPNALPIAA
y MYPGPNALPIAB para las diluciones 1/105 (p=0,88), 1/106
(p=0,73) y 1/107 (p=0,54); tampoco existieron diferencias significativas
entre los tiempos de cultivo teniendo en cuenta todos los medios usados (p =0,90).
Cuando se compararon los tres medios entre sí, existieron diferencias
significativas para las tres diluciones usadas, 1/105 (p=0,0005),
1/106 (p=0,01) y 1/107 (p=0,03); un posterior test de
Tuckey mostró, para todos los casos, un rendimiento similar para los
medios MYPGP y MYPGPNALPIAA, mientras que el medio MYPGPNALPIAB
presentó diferencias estadísticamente significativas, como se
muestra en la Figura 2.
Las esporas de P. larvae fueron obtenidas
a partir de colmenas con síntomas clínicos de loque americana.
Se retiraron 30 escamas con pinzas de disección estériles y se
machacaron en 5 ml de PBS (0,01 M, pH 7,2) estéril en un mortero estéril
hasta homogeneizado total. Esta solución se transfirió a un tubo
estéril con tapa a rosca y se agitó en vórtex durante 60
segundos, al cabo de los cuales se hizo el recuento de esporas por ml en cámara
de Petroff-Hausser bajo contraste de fase a 400 aumentos. La concentración
final de esporas fue de 6 x 1010 esporas/ml.
Posteriormente, se prepararon dos matrices diferentes: 1- Miel virgen (miel
comercial) y 2- Miel tindalizada (esterilizada por tindalización consecutiva
durante 3 días). Todas las mieles se analizaron previamente para confirmar
que no contenían esporas viables de P. larvae (4). Cada una de
las matrices se dividió en 3 submuestras a las que se les agregaron distintas
alícuotas del concentrado original, para alcanzar concentraciones finales
de 2047, 204 y 20 esporas por gramo de miel en cada submuestra.
Para el aislamiento de esporas viables, cada submuestra de miel más PBS
con esporas (6 en total) se homogeneizó en un tubo de centrífuga
con varilla de vidrio estéril y se centrifugó a 4000 g durante
25 minutos, luego de los cuales se descartó el sobrenadante dejando 3
ml de fluido por tubo. Posteriormente las muestras se agitaron en vórtex
durante dos minutos a máxima velocidad y se sometieron a un shock térmico
de 80-82 °C durante 15 minutos, para eliminar todas las formas vegetativas
y activar la germinación de las esporas bacterianas. Finalmente, se sembraron
100 µl por placa con micropipeta, distribuidos uniformemente con espátula
de Drigalsky. Esta metodología se realizó por quintuplicado en
los medios MYPGP, MYPGPNALPIA A (6 µg/ml ácido nalidíxico
y 10 µg/ml de ácido pipemídico) y MYPGPNALPIA
B (9 µg/ml ácido nalidíxico y 20 µg/ml de ácido
pipemídico). Las placas sembradas se cultivaron en microaerofilia a 37
°C y se evaluaron a los 7 y 14 días, contando el número de
UFC por placa. Para realizar el análisis estadístico de los resultados,
los datos se estandarizaron sumando una unidad (para evitar valores cero) y
se transformaron mediante logaritmo en base 10. El ANOVA efectuado sobre los
datos transformados demostró que no existieron diferencias significativas
entre los 7 y los 14 días de incubación para ninguno de los medios
en todas las matrices (Tabla 1); tampoco se encontraron
diferencias significativas entre las distintas concentraciones de esporas probadas
para miel virgen (p = 0,09) ni para miel tindalizada (p = 0,09). Finalmente,
tampoco se hallaron diferencias significativas entre los tres medios usados
para las matrices miel virgen (p = 0,15) y miel tindalizada (p = 0,11) (Figura
1).
A pesar de que en este trabajo no se encontraron
diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos de incubación
para recuperar esporas viables de miel, estudios previos demostraron que cuando
la concentración de esporas en la miel es muy baja, la incubación
de sólo 7 días puede arrojar falsos negativos (3, 4). De acuerdo
con pruebas adicionales realizadas en este laboratorio, sobre un total de 219
mieles provenientes de apiarios con loque americana, el 32% (n=70) mostró
desarrollo de colonias del patógeno a partir del día 8 y hasta
los 14 días de incubación en microaerofilia, lo cual claramente
indica que si las muestras se hubieran evaluado sólo a los 7 días,
se hubiera obtenido un 32% de falsos negativos.
De acuerdo con los resultados de este trabajo, las pruebas adicionales efectuadas
y las observaciones previas (3, 4), se propone utilizar el medio MYPGPNALPIAB
para aislar P. larvae de miel y, de esta forma, optimizar al máximo
la recuperación de esporas viables del patógeno a partir de mieles
con poblaciones heterogéneas de esporas bacterianas, sin perder la gran
sensibilidad que posee el medio MYPGP.
A partir de las placas de aislamiento de esporas de miel, y con el objeto de
obtener cultivos puros del patógeno, los primeros repiques deberían
efectuarse en MYPGPNALPIAA, ya que esta combinación de antibióticos
en el medio de cultivo no altera la viabilidad de las células vegetativas
bacterianas, a la vez que permite la inhibición de alguna espora de la
placa de aislamiento primario por carry over. Para estudios posteriores que
involucren crecimiento y desarrollo de células vegetativas bacterianas
es indistinto usar MYPGP sin antibióticos o MYPGPNALPIAA.
Agradecimientos: a la Lic. A. C. López, por su ayuda en la elaboración de los gráficos. FJR es becario del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y AMA es Investigadora de la Comisión de Investigaciones Científicas de la Prov. de Bs. As. (CIC). El presente trabajo fue subsidiado por la CIC y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT).
BIBLIOGRAFÍA
1. Alippi AM. A comparison of laboratory techniques for the detection of significant
bacteria of the honey bee Apis mellifera L. in Argentina. J Apic Res
1991; 30: 75-80.
2. Alippi AM. Characterization of Bacillus larvae White, the causative
agent of AFB of honeybees. First record of its occurrence in Argentina. Rev
Argent Microbiol 1992; 24: 67-72.
3. Alippi AM. Detection of Bacillus larvae spores in Argentinian honeys
by using a semi-selective medium. Microbiología SEM 1995; 11: 343-50.
4. Alippi AM, Reynaldi FJ, López AC, De Giusti MR, Aguilar OM. Molecular
epidemiology of Paenibacillus larvae subsp. larvae, the causal
agent of American Foulbrood of honeybees, in Argentina. J Apic Res 2004; 43:
135-43.
5. Bailey L, Ball BV. Bacteria. En: Bailey L, Ball BV, editors. Honey Bee Pathology.
London, Academic Press, 1991, p. 35-52.
6. Calesnick E, White JW. Thermal resistance of Bacillus larvae spores
in honey. J Bacteriol 1952; 64: 9-15.
7. Dingman DW, Stahly DP. Medium promoting sporulation of Bacillus larvae
and metabolism of medium components. Appl Environm Microbiol 1983; 46: 860-9.
8. Genersch E, Forsgren E, Pentikäinen A, Ashiralieva A, Rauch S, Kilwinski
J, et al. Reclassification of Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens
and Paenibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae
without subspecies differentiation. Int J Syst Evol Microbiol 2006; 56: 501-11.
9. Hansen H. Methods for determining the presence of the foulbrood bacterium
Bacillus larvae in honey. Dan J Plant Soil Sci 1984; 88: 325-8.
10. Hansen H, Rasmusen B. The investigation of honey from bee colonies for Bacillus
larvae. Dan J Plant Soil Sci 1986; 90: 81-6.
11. Heyndrickx M, Vandemeulebroecke K, Hoste B, Janssen P, Kersters K, De Vos
P, et al. Reclassification of Paenibacillus (formerly Bacillus)
pulvifaciens (Nakamura 1984) Ash et al., 1993, a later subjective
synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) larvae (White
1906) Ash et al. 1994, as a subspecies of P. larvae, with emended
descriptions of P. larvae as P. larvae subsp. larvae and
P. larvae subsp. pulvifaciens. Int J Syst Bacteriol 1996; 46:
270-9.
12. Hornitzky MAZ, Clark, S. Culture of Bacillus larvae from bulk honey
samples for the detection of American Foulbrood. J Apic Res 1991; 30: 13-6.
13. Nordström S, Fries I. A comparison of media and cultural conditions
for identification of Bacillus larvae in honey. J Apic Res 1995; 34:
97-103.
14. Schaeffer AB, Fulton M. A simplified method of staining endospores. Science,
NY, 1933; 77: 194.
15. Shimanuki H. Bacteria. En: Morse RA, Nowogrodzki R, editors. Honey bee pests,
predators and diseases. Ithaca, NY, Cornell University Press, 1990, p. 27-47.
16. Shimanuki H, Knox DA. Improved method for the detection of Bacillus larvae
spores in honey. Am Bee J 1988; 128: 353-4.
17. Schuch TDA, Madden RH, Sattler A. An improved method for the detection and
presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores
in honey. J Apic Res 2001; 40: 59-64.
Recibido:19/9/05
Aceptado: 26/6/06