Detección de anticuerpos anti-Brucella spp. en cerdos mediante técnicas de aglutinación y ELISA indirecto en las provincias de Buenos Aires y La Pampa, Argentina
H.A. Castro1*, S.R. González1, M.I. Prat1, P.C. Baldi2
1Cátedra de Inmunología,
Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional
del Sur, San Juan 670, (8000) Bahía Blanca; 2Instituto de
Estudios de la Inmunidad Humoral, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires, Junín 956, (1113) Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: hcastro@uns.edu.ar
RESUMEN
En nuestro país no existe un programa de control sobre brucelosis porcina
y su verdadera situación epidemiológica es desconocida. El objetivo
de nuestro trabajo fue detectar la presencia de anticuerpos anti-Brucella
spp. en porcinos provenientes de criaderos del sudoeste de la provincia de Buenos
Aires y del este de la provincia de La Pampa. La toma de muestras de sangre
se realizó en el momento del faenado de los animales. La detección
de anticuerpos se efectuó mediante las técnicas de aglutinación
con antígeno tamponado en placa (BPA), seroaglutinación en tubo
(SAT), aglutinación con 2-ME (2-ME) y ELISA indirecto, con dos antígenos
diferentes: el antígeno CYT (fracción citoplasmática de
B. abortus S19) y el antígeno CP (extracto citoplasmático
libre de lipopolisacárido). Del total de las muestras analizadas (n=325),
el 17,8% fue positivo para BPA, el 13,8% fue positivo para SAT y sólo
el 8,0% fue positivo para 2-ME. Mediante ELISA-CYT, este porcentaje se elevó
a 21,0%, mientras que a través del ELISA-CP sólo se halló
un 10,0% de muestras reactivas. Estos resultados son compatibles con los informados
en los escasos reportes previos para todo el país y sugieren la necesidad
de extender los estudios a otras zonas, donde sea habitual la cría de
cerdos.
Palabras clave: brucelosis porcina, ELISA indirecto, epidemiología
ABSTRACT
Detection of anti-Brucella spp. antibodies in swine by agglutination
techniques and indirect ELISA in the Buenos Aires and La Pampa provinces, Argentina.
Porcine brucellosis is one of the most important zoonoses in this country. Currently,
there is no control program for porcine brucellosis in Argentina and the epidemiological
situation is still unknown. The purpose of our study was to detect anti-Brucella
spp. antibodies in swine in the southwest of the Buenos Aires province and the
east of the La Pampa province. Blood samples were obtained when animals were
slaughtered. The presence of anti-brucella antibodies was studied by the buffered
plate agglutination test (BPA), the tube agglutination test (SAT), the 2-mercaptoethanol
(2-ME) agglutination test and indirect ELISA tests, using the cytosolic fraction
from Brucella abortus S19 (CYT), and lipopolysaccharide (LPS)-free cytosolic
proteins (CP). Out of a total of 325 samples analyzed, 17.8% reacted positively
to BPA, 13.8% to SAT, 8.0% to 2-ME, 21.0% to ELISA-CYT and 10.0% to ELISA-CP.
These results agree with the few data available in our country and suggest that
brucellosis screening should be extended to other regions.
Key words: porcine brucellosis, indirect ELISA , epidemiology
La brucelosis porcina es una zoonosis causada
principalmente por las biovariedades 1, 2 y 3 de Brucella suis. La verdadera
situación regional de esta infección en nuestro país es
desconocida, si bien algunos datos suministrados entre los años 1960
y 1980 sugieren una prevalencia del 14,5 al 25,0% (3), que coincide con los
resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo de trabajo (2). Las biovariedades
1 y 3 de Brucella suis son especialmente patogénicas para el hombre.
Según datos presentados en el I Congreso Bonaerense de Zoonosis, el 42,3%
de las cepas de Brucella aisladas de material biológico humano
corresponde a B. suis (7) por lo cual es relevante conocer, para su eventual
control, la situación epidemiológica de la enfermedad en el cerdo,
portador natural de esta especie.
El diagnóstico de certeza de la brucelosis porcina es el bacteriológico,
pero los inconvenientes de su implementación hacen que los métodos
de diagnóstico de uso habitual sean los serológicos. Dentro de
éstos, los más ampliamente utilizados se basan en las aglutinaciones
con suspensiones de bacterias enteras y la fijación de complemento. En
ambos casos se detectan anticuerpos contra los componentes de la membrana externa,
de los cuales el lipopolisacárido (LPS) es el más abundante. Dada
la reactividad cruzada existente entre el LPS de Brucella y el de otras
bacterias gram-negativas, es frecuente la aparición de falsos positivos
(6). En el caso de los porcinos, la reactividad cruzada con Yersinia enterocolitica
0:9 es un problema particularmente importante (9). Es de destacar que ninguna
de las pruebas serológicas convencionales es totalmente confiable para
el diagnóstico indirecto de brucelosis en animales individuales, y que
la reacción de fijación de complemento no es adecuada, ya que
el complemento de cerdo interactúa con el complemento de cobayo y disminuye
la sensibilidad de la determinación (11). La Organización Mundial
de Epizootias recomienda las pruebas de ELISA competitivo (C-ELISA) y de polarización
de fluorescencia (FPA) como pruebas confirmatorias para el diagnóstico
individual en porcinos. Son escasos los estudios acerca del uso de reacciones
de interacción primaria para detectar anticuerpos anti-Brucella
en cerdos (9, 12). Es importante considerar que las pruebas de ELISA que utilizan
LPS o su polisacárido O no eliminan el problema de la reactividad cruzada.
El empleo de antígenos distintos de LPS disminuye esta reactividad y
otorga mayores niveles de especificidad. Se ha demostrado que un ELISA utilizando
una preparación de proteínas citosólicas de Brucella
libres de LPS (CP) permite un diagnóstico específico de la brucelosis
humana y la brucelosis canina (5, 14). Se ha descrito también un ELISA
para brucelosis porcina que emplea como antígeno el core del LPS,
que disminuye las reacciones cruzadas debidas a Y. enterocolitica 0:9
(9).
El objetivo de nuestro trabajo fue detectar porcinos con serología positiva
para Brucella en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires y este de
la provincia de La Pampa, empleando simultáneamente las pruebas de aglutinación
en placa con antígeno tamponado (BPA), la aglutinación en tubo
(SAT), la aglutinación en tubo con 2-ME (2-ME) y una prueba de ELISA
con dos antígenos diferentes: antígeno CYT, compuesto por proteínas
citosólicas y LPS, y el antígeno CP, antes mencionado.
Los criaderos de la provincia de Buenos Aires correspondieron a las zonas de
Bajo Hondo (n=57), Médanos (n=41), Carhué (n=26), Tres Lomas (n=12),
Bahía Blanca (n=23), Guaminí (n=36), Coronel Suárez (n=21),
Pigüé (n=8), Adolfo Alsina (n=12), Saavedra (n=9) y General Lamadrid
(n=15). Como dato representativo de la provincia de La Pampa se analizaron muestras
provenientes de Macachín (n=65). Se recolectaron 325 muestras de sangre
en el momento del faenado de los animales, bajo la supervisión de un
veterinario. Los sueros se obtuvieron por centrifugación de la sangre
a 3000 rpm durante 10 minutos, y se mantuvieron a -20 °C hasta el momento
de su procesamiento. Para la prueba de BPA se empleó la técnica
descrita por Angus y Barton (1), utilizando como antígeno una suspensión
al 11% de B. abortus 1119-3 con cristal violeta y verde brillante, pH
3,6. Para las pruebas de SAT y 2-ME se empleó como antígeno una
suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5% (Laboratorio del Centro
de Zoonosis Rurales, Azul, Buenos Aires). La fracción citoplasmática
(CYT) empleada para la prueba ELISA se obtuvo a partir de cultivos de B.
abortus S19 tratados con formaldehído, lisados en "X-Press"
y ultracentrifugados, según la técnica de Verstreate et al.
(13). Esta fracción contiene proteínas citosólicas y LPS
(aproximadamente 3 mg/mg de proteínas totales). El antígeno CP
se preparó adsorbiendo el antígeno CYT con un anticuerpo monoclonal
(BC68), específico para el epitope repetitivo del antígeno O,
que retiene al LPS y deja libres las proteínas citoplasmáticas.
Este procedimiento reduce en más de 1000 veces el contenido de LPS de
la fracción citoplasmática, y el LPS residual no es detectable
por ELISA (4). Las microtiras de poliestireno (Costar) se sensibilizaron con
antígeno CYT (2 µg/pocillo) o con antígeno CP (0,5 µg/pocillo)
diluidos en buffer fosfato (PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se bloquearon
con una solución de leche descremada al 3% en PBS, toda la noche en heladera.
Luego de tres lavados con PBS-Tween 20 al 0,05% (PBS-Tween), se incubaron con
una dilución 1:200 de los sueros por analizar durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de sucesivos lavados con PBS-Tween, se agregó
el conjugado anti-inmuno-globulinas porcinas (ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA)
marcado con peroxidasa. El revelado se efectuó con o-fenilendiamina (2
µg/ml). La reacción se detuvo con H2SO4 4
N a los 15 minutos para el antígeno CYT y a los 25 minutos para el CP.
La lectura del color desarrollado se efectuó a 490 nm en un lector de
microtiras de ELISA (Mini Photometer. Model 6. Metertech Inc.) Para el cálculo
del cut off de cada ELISA, se procesaron de igual manera 70 muestras
de porcinos provenientes de establecimientos libres de brucelosis, que habían
resultado negativas para la prueba de BPA. El valor medio obtenido en cada caso,
incrementado en 3 desvíos estándares, fue el valor de corte tomado
para discriminar las muestras positivas de las negativas (15). Para el ELISA-CYT
resultó un cut off de 0,388 y para el ELISA-CP de 0,436 (Figura
1). Para validar las pruebas se emplearon como controles positivos sueros
provenientes de cerdas abortadoras positivas por BPA, pertenecientes a establecimientos
con aislamientos de B. suis, y se incluyeron controles negativos provenientes
de criaderos libres de brucelosis.
Mediante las pruebas empleadas se detectaron anticuerpos específicos en animales de Bajo Hondo, Médanos, Bahía Blanca, Coronel Suárez, Saavedra y Macachín. No se encontraron muestras positivas en Carhué, Tres Lomas, Guaminí, Pigüé, Adolfo Alsina y General Lamadrid. En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de muestras positivas encontrados para cada una de las pruebas ensayadas en las distintas zonas.
Del total de muestras analizadas, 58 sueros (17,8%)
fueron positivos para la prueba de BPA. De estos 58 sueros, 45 (77,5%) fueron
positivos para SAT, 26 (45%) para 2-ME, 51 (88%) para ELISA-CYT y 33 (57%) para
ELISA-CP. Un suero negativo para BPA, SAT y 2-ME fue positivo para ELISA-CYT
y ELISA-CP. Nueve sueros negativos para BPA, SAT y 2-ME fueron positivos para
ELISA-CYT y negativos para ELISA-CP. Seis sueros negativos para BPA, SAT, 2-ME
y ELISA-CYT fueron positivos para ELISA-CP. Todos los sueros negativos para
BPA y para ambos ELISAs presentaron un título de 25 UI en SAT y 2-ME,
o fueron no reactivos.
El porcentaje de muestras positivas obtenido (18%, por BPA) coincide con los
escasos datos reportados en la bibliografía (3). La prueba de ELISA con
el antígeno CYT permitió detectar otros diez sueros positivos,
que habían resultado negativos para BPA, SAT y 2-ME, lo que eleva el
porcentaje de muestras positivas a un 21% (n=68). Entre las muestras positivas
por BPA, el mayor porcentaje de muestras positivas para CYT, en relación
con las positivas para CP, probablemente se deba a que el antígeno CYT
contiene LPS (antígeno dominante en la prueba de BPA), mientras que el
antígeno CP carece de él. Asimismo, los sueros positivos por ELISA-CYT
y BPA pero negativos por ELISA-CP podrían deberse a falsos positivos
originados en la reactividad cruzada con los LPS de otras bacterias (6). En
ese sentido, cabe señalar que el antígeno CP parece brindar una
mayor especificidad diagnóstica, ya que en los estudios realizados hasta
el momento con CP no se han detectado reacciones cruzadas con proteínas
de otras bacterias (5, 6, 14). Por otra parte, se ha demostrado en humanos y
animales que han padecido la enfermedad, pero que no tienen una infección
activa, la persistencia de positividad para anticuerpos anti-LPS pero no para
anti-CP (5). No obstante, la positividad para ELISA-CP observada en seis sueros
negativos para BPA, ELISA-CYT, SAT y 2-ME podría deberse a la existencia
de reacciones cruzadas con proteínas citosólicas, todavía
no descritas. Las pruebas de aglutinación convencionales para el diagnóstico
de brucelosis porcina, en particular SAT, poseen una baja especificidad debido
a la presencia de IgM no específica. Las pruebas de BPA y 2-ME son usadas
frecuentemente para determinar la infección por B. suis en piaras
infectadas, sin embargo no son confiables para un diagnóstico individual.
Otros ensayos, como C-ELISA y FPA, que parecen ser altamente específicos,
presentan algunos inconvenientes. El C-ELISA es complejo en su realización
y las muestras contaminadas pueden interferir en los resultados (10), mientras
que la FPA, si bien es de fácil realización y relativamente poco
costosa en cuanto a insumos, necesita un equipamiento especial que no está
al alcance de todos los laboratorios. Los resultados expuestos sugieren planificar
ensayos que permitan evaluar la sensibilidad y, muy especialmente, la especificidad
del método de ELISA utilizado en este trabajo, ya que podrían
indicar la conveniencia de sustituir en el futuro los métodos de serología
convencionales por el ELISA descrito, con los dos antígenos empleados,
no sólo por su mayor confiabilidad sino por sus ventajas técnicas,
al utilizar menor volumen de muestra y permitir un procesamiento múltiple
en menor tiempo.
El hallazgo de animales con serología positiva alerta sobre el riesgo
potencial de infección para el hombre en contacto con ellos y sugiere
la necesidad de aplicar medidas preventivas y extender estos estudios serológicos
a otras zonas del país donde sea frecuente la cría de cerdos.
Agradecimientos: Agradecemos al Médico Veterinario Dr. Ariel Sarachaga por proveer las muestras y a las Dras. Mirta Arestegui y Graciela Scharovsky, de la Universidad Nacional de Rosario, por facilitarnos los controles positivos y negativos.
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Recibido: 3/1/06
Aceptado: 5/6/06