Aislamientos de Histoplasma capsulatum con morfología aberrante obtenidos en la República Argentina
M.F. Zuiani1, M.C. Rivas1, W. Lee1, L. Guelfand2, G. Davel1, C.E. Canteros1*
1Departamento Micología, INEI
(Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas) - ANLIS «Dr. Carlos G.
Malbrán», Vélez Sarsfield 563 (1281), Ciudad Autónoma
de Buenos Aires; 2Hospital General de Agudos
Juan A. Fernández, Cerviño 3356 (C1425AGP), Ciudad Autónoma
de Buenos Aires, Argentina
*Correspondencia. E-mail: ccanteros@anlis.gov.ar
RESUMEN
Por primera vez en la Argentina se describe una cepa de Histoplasma capsulatum
var. capsulatum con morfotipo aberrante, obtenida de un paciente con
SIDA. En los primocultivos desarrollados en agar Sabouraud a 25-28 °C, las
colonias de la fase micelial fueron blancas, glabras, umbilicadas, centralmente
radiadas y de bordes regulares, más semejantes a las de hongos hialinos
ambientales que a las de H. capsulatum. Al examen microscópico
llamó la atención la ausencia de conidios característicos,
la presencia de clamidoconidios solitarios, terminales e intercalares, de 4
µm de diámetro, y el engrosamiento de las hifas. La identificación
del hongo se confirmó mediante la detección de exoantígenos
específicos (H y M) en los sobrenadantes de cultivos de la fase micelial
y por la reversión a la fase levaduriforme típica, obtenida al
incubar en agar cerebro-corazón adicionado con cisteína a 37 °C.
Mediante RAPD-PCR con los iniciadores 1281-1283, el perfil del ADN genómico
coincidió con el genotipo de H. capsulatum predominante entre
los aislamientos de pacientes argentinos.
Palabras claves: Histoplasma capsulatum, morfología aberrante,
RAPD-PCR, identificación
ABSTRACT
Histoplasma capsulatum with aberrant morphology isolated in Argentina.
For the first time in Argentina, we describe a strain of Histoplasma capsulatum
var. capsulatum with an aberrant morphology that was isolated from a
single patient with AIDS. Mycelial phase cultures on agar Sabouraud at 25-28
°C showed white, glabrous, umbilicated and centrally radiated colonies.
Unusual microscopic findings were the absence of typical conidia, the presence
of terminal/intercalary chlamydoconidia with a diameter of 4 µm and of
thickened hyphae. Fungal identification was confirmed by the detection of bands
H and M species specific antigens in mycelial culture supernatants and reversion
to the typical yeast phase on agar brain-heart-cysteine at 37 °C. The genomic
DNA profile obtained by RAPD-PCR with primers 1281-1283 coincided with the predominant
profile of H.capsulatum among isolates from Argentine patients.
Key words: Histoplasma capsulatum, atypical morphology, RAPD-PCR,
identification
La histoplasmosis o enfermedad de Darling, producida
por el hongo termodimorfo Histoplasma capsulatum var. capsulatum,
es la tercera micosis sistémica en frecuencia diagnosticada anualmente
en la República Argentina, después de las fungemias por levaduras
y la criptococosis (5). La forma clínica diseminada de esta enfermedad
es considerada marcadora de SIDA, y la asociación SIDA-histoplasmosis
en nuestro país oscila entre 5,3 y 6% (14, 17).
El diagnóstico de la enfermedad se realiza por examen microscópico
directo, previa coloración de Giemsa, y por cultivo de los materiales
clínicos. La observación directa, considerada presuntiva, permite
visualizar levaduras intracelulares (forma parasítica) en macrófagos
y otras células del sistema fagocítico. Esta técnica posee
una sensibilidad limitada, dependiente de la cantidad de levaduras presentes
en el espécimen estudiado. El aislamiento de H. capsulatum en
cultivo es el método de diagnóstico definitivo y el más
sensible, especialmente en muestras de sangre, líquidos de punción
y biopsias. La fase micelial desarrolla a partir de especímenes clínicos
entre los 5 y 10 días de incubación a 25-28 °C en agar Sabouraud
(glucosa 2%, peptona 1%, agar 1,5%). La identificación de la especie
se realiza considerando las características morfológicas de la
fase micelial y la capacidad de convertirse en levaduras al incubar a 37 °C
en medios enriquecidos con cisteína (9).
La macromorfología típica de las colonias a 25-28 °C en agar
Sabouraud es inicialmente algodonosa y blanca, tornándose pulverulenta
y parda con el tiempo. Al microscopio, se observan macroconidios esféricos,
de pared gruesa con proyecciones digitiformes, de 8-15 µm de diámetro;
microconidios ovales, de 1-4 x 2-6 mm de diámetro e hifas delgadas y
ramificadas, de 1,2-1,5 µm (6). Algunas colonias pueden ser albinas y
presentar macroconidios de pared lisa (1). En la Argentina, por lo general,
los aislamientos clínicos de H. capsulatum en los primocultivos
son típicos de la especie (4).
La existencia de aislamientos con características morfológicas
poco sugestivas de H. capsulatum fue comunicada en escasas oportunidades
por algunos investigadores. Se han descrito variantes morfológicas macroscópicas
para este hongo, con colonias glabras y verrugosas e incluso aislamientos de
suelo con pigmento rojo o rosado, características infrecuentes para la
especie (13, 18). Sutton et al. (21) comunicaron aislamientos aberrantes
de H. capsulatum con colonias húmedas, cerebriformes y pigmentadas
a 25-28 °C, con escasos clamidoconidios al examen microscópico. Tian
y Shearer (23) observaron hifas septadas, ligeramente engrosadas y flexuosas,
en mutantes de laboratorio deficientes en un gen que codifica para una proteína
de 21 kDa involucrada en el proceso de termodimorfismo. También fueron
descritos aislamientos incapaces de convertirse in vitro en levaduras
cuando se cultivaban a 37 °C, mientras que a 25-28 °C presentaban abundantes
macroconidios, característicos de H. capsulatum. Estas variantes
deben ser diferenciadas de Renispora flavissima, Sepedonium spp.
y Chrysosporium spp. por el parecido morfológico de los macroconidios
(7, 9, 10, 19).
Nuestro objetivo es comunicar la presencia de aislamientos de H. capsulatum
con características morfológicas aberrantes para la especie en
la Argentina.
Se estudiaron cinco aislamientos, cuatro provenientes de hemocultivos y uno
de lavado broncoalveolar, recuperados en dos episodios diferentes de histoplasmosis
asociada a un paciente con SIDA.
Los tres primeros aislamientos fueron recuperados de igual número de
hemocultivos seriados, obtenidos entre el 23-7-02 y el 2-9-02. En el laboratorio
de origen, los cultivos desarrollados en los medios de rutina a 25-28 °C
presentaron características morfológicas atípicas. Ante
la sospecha de H. capsulatum, se realizó la prueba de conversión
dimórfica y se obtuvo la fase levaduriforme característica de
este hongo. Los aislamientos fueron derivados al Departamento Micología
del INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” para corroborar
la identificación.
Los especímenes fúngicos fueron analizados fenotípicamente
siguiendo la metodología indicada en el Manual de procedimientos del
Departamento Micología del INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
(3). A los 30 días de cultivo en agar Sabouraud a 25-28 °C desarrollaron
colonias blancas, glabras, umbilicadas, centralmente radiadas, con márgenes
regulares y sin pigmentación (Figura 1). En el examen
microscópico se observaron hifas hialinas con clamidoconidios aislados
terminales, subterminales e intercalares, de 4 µm de diámetro;
hacia el centro de la colonia se observaron hifas ligeramente engrosadas y tortuosas.
No se observaron macro ni microconidios (Figura 2). El crecimiento
a 25-28 °C no fue inhibido por cicloheximida. En agar cerebro-corazón
adicionado con cisteína, incubado a 37 °C, se obtuvo la fase levaduriforme
típica. La identificación de H. capsulatum se confirmó
por la presencia de los exoantígenos H y M específicos en cada
uno de los aislamientos, mediante la técnica de inmunodifusión
doble utilizando como control antígenos y antisueros comerciales (Histoplasma
ID Antigen (H & M) H50110 e Histoplasma ID Control Serum (Anti-H
& M) H60110, IMMY Immuno-Mycologics, INC. Norman, USA) (15).
Dos nuevos aislamientos del mismo paciente, provenientes
de un hemocultivo y de un lavado broncoalveolar, fueron obtenidos luego de seis
meses postratamiento con anfotericina B, e intratratamiento con itraconazol
(ITZ). Estos eran fenotípicamente idénticos a los tres primeros
y se identificaron como H. capsulatum.
Los cinco aislamientos mantuvieron las características descritas por
el período de un año y no pudo demostrarse presencia de conidios,
aun en medios que favorecen su formación .
Una vez caracterizados, los aislamientos fueron incluidos en la colección
de cultivos del Departamento de Micología del INEI - ANLIS “Dr.
Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires, Argentina, con los números
031450 (acrónimo 1487/02, hemocultivo del 23 de julio del 2002), 021196
(acrónimo 1570/02, hemocultivo del 6 de agosto del 2002), 031451 (acrónimo
1742/02, hemocultivo del 2 de septiembre del 2002), 031846 (acrónimo
3162/03, hemocultivo postratamiento con anfotericina B e intra-tratamiento con
ITZ, del 7 de marzo del 2003) y 031847 (acrónimo 3229/03, lavado broncoalveolar
del 17 de marzo del 2003).
Los cinco aislamientos de H. capsulatum se compararon genéticamente
utilizando una técnica de RAPD-PCR con los iniciadores 1281-1283 (5’-AACGCGCAAC-3’
y 5´-GCGATCCCCA-3’), técnica que permite identificar el origen
geográfico de los aislamientos (4, 22).
La extracción y purificación del ADN se efectuó a partir
de un cultivo de 84 h en agitación orbital (120 rpm) a 37 °C en GYE
(glucosa 2%, extracto de levadura 1%), utilizando las técnicas descritas
por Möller et al. (12) y Perrotta et al. (16). La PCR fue
realizada en un volumen final de 25 µl con 2 mM cloruro de magnesio, 200
µM dNTPs, 1 U Taq polimerasa, 0,6 µM de cada iniciador y
2 ng de ADN genómico, en buffer de reacción 1X. La amplificación
se realizó en un termociclador Perkin Elmmer Mod 9600 ver. 2.01 (Cetus
Norwalk, CT). El programa de amplificación fue 94 °C 7 min, 35 ciclos
de 94 °C 10 s, 36 °C 30 s, 72 °C 1 min y una extensión final
de 72 °C 5 min. Los productos amplificados fueron sometidos a electroforesis
en gel de agarosa 1,5% (Agarosa ultrapura, Gibco, Biological Co., NY) en buffer
TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 2 mM pH 8,5) y teñidos con bromuro de
etidio (10 µg/ml). Los perfiles de los fragmentos de ADN amplificados
fueron capturados con un fotodocumentador (BioRad Gel Doc 1000, CA). Como estándar
de pares de bases se utilizó 100 bp DNA Ladder (Invitrogen, Tech-line
Life, CA).
Los perfiles electroforéticos de los aislamientos aberrantes obtenidos
por PCR fueron comparados con ocho aislamientos clínicos de pacientes
argentinos (sin antecedentes de haberse trasladado fuera del área endémica
de histoplasmosis de la Argentina) y con cuatro aislamientos clínicos
obtenidos en otros países americanos: Downs, de los Estados Unidos de
América; G186B, de Panamá; y EH-46 y EH-325, ambos de México.
Los perfiles de los cinco aislamientos atípicos resultaron idénticos
entre sí y a los aislamientos obtenidos de los pacientes argentinos,
pero diferían de los de otros países (Figura 3).
Este análisis permite inferir que los aislamientos aberrantes estudiados
son autóctonos y estarían circulando en la República Argentina.
Con frecuencia, las características macro
y/o microscópicas de los primoaislamientos de H. capsulatum desarrollados
a 25-28 °C sufren, a través de sucesivos cultivos in vitro,
un cambio morfológico mal denominado “pleomorfismo”, que
se traduce en la presencia de un micelio algodonoso y en la pérdida de
la pigmentación y la conidiación. Algunos autores describen alteraciones
en las estructuras microscópicas luego de tratamientos con antifúngicos
(9). Sin embargo, los cinco aislamientos estudiados fueron atípicos desde
su primocultivo, aun antes de iniciar el tratamiento antifúngico, lo
que indicaría que las alteraciones morfológicas no se debieron
a las causas antes mencionadas. Se ha postulado que los cambios en el fenotipo
pueden interferir en la interacción hospedero-parásito, y en algunos
casos los pacientes con SIDA pueden ser susceptibles a infecciones con microorganismos
que comúnmente no causan enfermedad en otros grupos de pacientes (8,
20). El hecho de que este aislamiento aberrante haya producido enfermedad en
un paciente con SIDA podría reafirmar este postulado; sin embargo, se
han descrito previamente aislamientos atípicos obtenidos a partir de
pacientes inmunocompetentes (10). Cabe mencionar que estamos estudiando otras
cepas de estas características, provenientes de pacientes sin causa aparente
de inmunocompromiso y sin antecedentes de tratamientos previos (datos no publicados).
Los sucesivos aislamientos de una misma cepa antes y durante el tratamiento
específico podrían deberse a resistencia a los antifúngicos
administrados. Esto no puede demostrarse y queda en el terreno de lo especulativo,
porque hasta el momento no han sido estandarizadas las pruebas de sensibilidad
a antifúngicos in vitro para H. capsulatum. Otra causa
de la persistencia de la cepa podría ser la falta de adherencia del paciente
al tratamiento, hecho que no surgió de la anamnesis.
Este es el primer informe de aislamientos aberrantes de H. capsulatum
en la Argentina. Se desconoce la frecuencia de aparición de este tipo
de cepas relacionadas con casos clínicos. Consideramos importante, desde
el punto de vista epidemiológico, la comunicación de estos aislamientos
para conocer su verdadera incidencia y alertar a los microbiólogos sobre
la posibilidad de aparición de colonias atípicas de H. capsulatum,
que pueden confundirse con hongos hialinos ambientales. Existen kits comerciales
basados en técnicas moleculares para identificar H. capsulatum,
como el AccuProbe (GenProbe, San Diego, CA) (19), pero son costosos para el
sistema de salud argentino y se han detectado resultados falsos positivos (2).
Actualmente se están desarrollando técnicas de PCR con iniciadores
diseñados a partir de la secuencia que codifica para la proteína
antigénica M y PCR en tiempo real, para la identificación rápida
de aislamientos (7, 11). Hasta el momento, estas técnicas no han sido
adaptadas como insumos comerciales para laboratorios, y su utilidad aún
debe ser evaluada con un mayor número de aislamientos.
Debido a lo expuesto, la detección de exoantígenos específicos
y la prueba de dimorfismo siguen siendo los estudios de elección en todos
los casos que sea necesario confirmar la identidad de H. capsulatum;
en especial, en aislamientos con características poco sugestivas para
la especie obtenidos de pacientes con múltiples tratamientos o con inmunocompromiso
grave, en los que cabe sospechar histoplasmosis.
Agradecimientos: los autores agradecen las sugerencias realizadas por la Dra. Viviana Ritacco para la elaboración de este manuscrito. Las cepas Downs, G186B, EH-46 y EH-325 fueron gentilmente cedidas por la Dra. Lucia Taylor.
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Recibido: 12/12/05
Aceptado: 26/06/06