Entorno genético de CTX-M-2 en aislamientos de Klebsiella pneumoniae provenientes de pacientes hospitalizados en Uruguay
R. Vignoli1, N. Cordeiro1, V. Seija1, F. Schelotto1, M. Radice2, J. Ayala3, P. Power2*, G. Gutkind2
1Departamento
de Bacteriología y Virología, Instituto de Higiene, Facultad de
Medicina, Universidad de la República, Alfredo Navarro 3051, Montevideo,
Uruguay; 2Cátedra de Microbiología, Facultad de Farmacia
y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, (1113) Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, Argentina; 3Centro de Biología
Molecular «Severo Ochoa» CSIC-UAM, Campus de Cantoblanco, 28049
Madrid, España.
*Correspondencia. E-mail: ppower@ffyb.uba.ar
RESUMEN
Se estudiaron las cepas de Klebsiella pneumoniae K96005 y K13, productoras
de la b-lactamasa de espectro extendido CTX-M-2, aisladas durante 1996
y 2003, respectivamente, de pacientes hospitalizados en Uruguay. Se realizó
la caracterización del entorno génico del gen blaCTX-M-2
mediante mapeo por PCR y secuenciación de los amplicones. Los resultados
revelan que en ambos aislamientos el gen codificante de dicha enzima se encuentra
en un integrón complejo de clase 1, asociado a la presencia de orf513.
El integrón identificado, cuyo arreglo de genes es aac(6’)-Ib,
blaOXA-2, orfD, asociados a orf513-blaCTX-M-2, parece
estar ampliamente diseminado en la región del Río de la Plata.
Palabras clave: orf513, integrón de clase 1, b-lactamasas de espectro
extendido, blaCTX-M-2
ABSTRACT
Genetic environment of CTX-M-2 in Klebsiella pneumoniae isolates from
hospitalized patients in Uruguay. We studied two CTX-M-2-producing Klebsiella
pneumoniae clinical strains, K96005 and K13, isolated from hospitalized
patients in Uruguay, during 1996 and 2003, respectively. The genomic surroundings
of blaCTX-M-2 were characterized by PCR-mapping and DNA sequencing.
Our results show that blaCTX-M-2 is included in a complex
class-1 integron (InK13), associated with an orf513 in both isolates. The genetic
array of the integron, aac(6’)-Ib, blaCTX-M-2,
orfD (gene cassette region), associated with an orf513-blaCTX-M-2, seems
to be widely disseminated over the Río de la Plata region.
Keywords: orf513, class 1 integron, extended-spectrum b-lactamases, blaCTX-M-2
La producción
de b-lactamasas de espectro extendido (bLEE) en enterobacterias es
un problema creciente en todo el mundo. Estas enzimas son capaces de inactivar
a la mayoría de los antibióticos b-lactámicos (con
la excepción de cefamicinas y carbapenemes).
El uso de antibióticos genera una presión de selección
a favor de aquellas bacterias que son capaces de incorporar nuevo material genético,
en particular genes que confieren resistencia. En este sentido, los integrones
han jugado un papel preponderante en la captura, el rearreglo y la expresión
de genes. De las nueve clases de integrones reconocidas hasta el momento, los
inte-grones de clase 1 son los más frecuentemente asociados a resistencia
en aislamientos clínicos (15).
La arquitectura de un integrón clásico de clase 1 consta de: i)
un segmento conservado 5’ (5’-CS), que incluye el gen codificante
de la integrasa de clase 1 (intI1); los promotores Pc y Pant,
que dirigen la expresión de la integrasa IntI1 y de los genes en cassette,
respectivamente; y un sitio attI1 de recombinación sitio específica;
ii) un segmento conservado 3’ (3’-CS), compuesto básicamente
por una copia trunca de qacED1, un gen que confiere resistencia marginal
a compuestos de amonio cuaternario; y por el gen sul1, que confiere resistencia
a sulfonamidas; y iii) una región variable (RV), que contiene
los genes en cassette (15). Estos últimos carecen de promotor propio,
pero se acompañan de un elemento de aproximadamente 59 pares de bases
(59-be) o attC, de reconocimiento de la integrasa (15). Con esta arquitectura,
los integrones son capaces de incorporar y expresar genes en cassette
que, en general, codifican para resistencia a antibióticos.
Otros integrones derivados de los In6/In7, denominados integrones compuestos,
han sido también descritos (9). Sobre la arquitectura clásica
de un integrón de clase 1, se le agrega corriente abajo de 3’-CS
un orf513, codificante de una hipotética recombinasa (12), algún
gen de resistencia asociado a orf513 (carente del elemento 59-be) y una duplicación
del 3’-CS (3’-CS2). Estos genes de resistencia asociados a orf513
no presentan un sitio de reconocimiento attC, pero sí un elemento
de 26 a 28 bp que incluiría un sitio de reconocimiento de 17 bp para
orf513 (12) y que, por analogía, llamaremos 26-be (Figura
1).
CTX-M-2 es
la bLEE más frecuentemente detectada en Uruguay y Argentina (13,
17). Hace pocos años se ha descrito su ubicación en un integrón
compuesto de clase 1 de estructura similar a la descrita en el párrafo
anterior, el cual ha sido secuenciado a partir de aislamientos de Salmonella
enterica serovar Infantis (InS21) (4), Morganella morganii (In116)
(12) y Proteus mirabilis (In35) (1).
En Uruguay, los primeros informes de bLEE (año 1990) hacen referencia
a enzimas derivadas de SHV en aislamientos de K. pneumoniae y E. coli
(10). En 1991 se aislaron cepas de E. coli enteropatogénicas (EPEC)
resistentes a oximino-cefalosporinas, que producen PER-2 y TEM-116 (18). Finalmente,
corresponden al año 1996 los primeros aislamientos de K. pneumoniae
con CTX-M-2 (17). Sin embargo, no han sido comunicados los entornos génicos
de ninguna de ellas.
En este estudio, describimos el entorno genético de blaCTX-M-2
de un aislamiento de K. pneumoniae proveniente de un paciente hospitalizado
durante el año 2003 en Uruguay (K13), comparándolo con uno de
K. pneumoniae portador de CTX-M-2 de 1996 (K96005) (17).
Se estudiaron las cepas de K. pneumoniae K13 y K96005, ambas productoras
de CTX-M-2. La primera fue seleccionada entre 11 aislamientos con idéntico
perfil de multirresistencia, provenientes de hospitales de Montevideo, Canelones
y Colonia, colectados durante 2003 (3). La segunda proviene de un estudio previo
sobre aislamientos realizados en 1996 en Montevideo (17). Las cepas J53/pK13
y J53/pK05 fueron obtenidas mediante ensayos de conjugación, utilizando
como cepa receptora E. coli J53 resistente a azida (Azr),
con el objeto de determinar si los marcadores de resistencia son transferibles
por elementos extracromosómicos.
Se determinó la susceptibilidad frente a una amplia variedad de antibióticos
mediante paneles de microdilución (sistema Wider Fco. Soria Melguizo)
y la concentración inhibitoria mínima (CIM) por dilución
en agar, de acuerdo con las recomendaciones del CLSI (ex NCCLS) (8). Los resultados
se muestran en la Tabla 1.
Luego de realizar
un isoelectroenfoque analítico, los extractos crudos de ambas cepas,
así como sus correspondientes transconjugantes, demostraron la presencia
de tres bandas con actividad de b-lactamasas cuando se empleó ampicilina
500 µg/ml como sustrato revelador en un sistema iodométrico: pI
aparentes de 5,4, 7,4-7,6 y 8,1. El revelado con ceftriaxona 1.000 µg/ml
mostró una única banda de actividad con pI aparente de 8,1. La
inhibición de las bLEE por clavulanato de litio (4 µg/ml)
fue efectiva sobre dos de ellas (pI aparentes de 5,4 y 8,1) y solo parcial sobre
la tercera (pI aparente de 7,4-7,6). Las actividades remanentes se revelaron
con ampicilina 500 µg/ml.
Luego de amplificación por PCR se obtuvieron tres amplicones, de 0,85,
0,5 y 0,9 kb. Se utilizaron cebadores específicos de blaTEM
(OTR3 y OTR4), blaOXA (OXA-2 A y OXA-2 B) y del grupo de blaCTX-M-2
(bla1 y bla2), respectivamente (ver Tabla 2); y ADN plasmídico.
Los amplicones
correspondientes a blaCTX-M-2 y blaOXA fueron
secuenciados en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores, en un secuenciador
ABI PRISM 377. Para ambos aislamientos se confirmó la presencia de los
genes blaCTX-M-2 y blaOXA2.
La detección
de integrones de clase 1 se realizó mediante amplificación por
PCR de las regiones conservadas 5’ (utilizando los cebadores I5 e I3)
y 3’ (mediante los cebadores QacE 1F y Sul1B (ver Tabla
2). Los integrones fueron caracterizados de forma completa mediante mapeo
por PCR y secuenciación de los amplicones, utilizando los cebadores descritos
en la Tabla 2. Las combinaciones utilizadas, tanto para
el mapeo como para la secuenciación, pueden verse en la Figura
1.
La secuenciación de los amplicones confirmó que el gen blaCTX-M-2
se encuentra en un integrón compuesto de clase 1 (Figura1),
denominado InK13 en K. pneumoniae K13 (número de acceso AM040450),
el cual presenta igual arquitectura que In116, InS21 (4, 12), e incluso, que
el integrón de K. pneumoniae K96005, denominado InK05 (resultado
no mostrado).
Con respecto a la región variable de genes en cassette de InK13,
el arreglo aac(6’)-Ib - blaOXA-2 - orfD ha sido descrito,
hasta el momento, únicamente para los integrones In116, InS21 e In35
de M. morganii, S. Infantis y P. mirabilis, respectivamente
(1, 4, 12). Este trabajo aporta la primera descripción en K. pneumoniae.
Los genes involucrados en la resistencia observada poseen una identidad nucleotídica
del 100% con los descritos en el integrón In116 (12), y son éstos
aac(6’)-Ib, blaOXA-2, sul1 y blaCTX-M-2.
La presencia de los genes blaCTX-M-2 y aac(6’)-Ib
podrían explicar la resistencia a oximino-cefalosporinas y a aminoglucósidos,
respectivamente.
La incorporación de genes bla en integrones permite agruparlos
junto a otros que codifican para resistencia a diversos antibióticos,
principalmente aminoglucósidos (1, 4, 12), en un entorno genético
óptimo para su expresión. La diseminación de blaOXA-2
en K. pneumoniae, escasamente comunicada en la bibliografía (5),
puede constituir un amplio reservorio de b-lactamasas relativamente resistentes
a los inhibidores del tipo ácido clavulánico, que podrían
derivar en bLEE resistentes a inhibidores, como fuera sugerido en Pseudomonas
aeruginosa (11).
La secuencia del promotor Pant de intI1 en InK13 (regiones
–35 [TTGACA] y –10 [TAAACT]) se presenta conservada con respecto
a InS21 (número de acceso AJ311891), con una transversión T/A
dos nucleótidos corriente abajo de la región –35, ausente
en otras integrasas que han sido ingresadas en bases de datos. Se requieren
estudios adicionales para determinar si esta modificación altera los
niveles de expresión de los genes regulados por Pant.
El entorno génico corriente arriba del gen blaCTX-M-2
puede dividirse en tres zonas: una región inmediata de 506 bp, que abarca
266 bp con un 97% de similitud con respecto a una región homóloga
corriente arriba de blaKLUA-1 (AJ272538) y que incluiría
vestigios de su ubicación original en el cromosoma de Kluyvera ascorbata,
y 240 bp con estricta identidad con la región común de integrones
complejos derivados de In6/In7 (4, 12); una segunda región correspondiente
a la hipotética recombinasa orf513, postulada como responsable de la
escisión de blaCTX-M-2 desde su ubicación original
(12) y, ubicado entre ambas regiones, se encuentra el elemento 26-be que contiene
el sitio propuesto de reconocimiento de orf513 (AAAGGTGGTTTATACTTCCTATACCC).
Este 26-be conserva un 100% de identidad corriente arriba de diversos genes
de resistencia, como qnr (AY655485), blaCMY-1 (X92508)
o dhfrX (AY049746), entre otros. Se postula que 26-be actuaría
por sí mismo como un promotor para el gen de resistencia a quinolonas
qnr (AY655485) mediante la secuencia TTTATA (7). Coincidentemente, 26-be comparte
la secuencia AAAGGTGGTT con la secuencia de inserción ISEcp1 (16).
Todos estos elementos sugieren que 26-be podría ser importante tanto
para la movilización como para la expresión de genes de resistencia.
Para el caso de las b-lactamasas, tal movilización de genes ha permitido
el reclutamiento de enzimas denominadas “cefotaximasas nacidas”,
que no habrían evolucionado de precursores con menor espectro de actividad,
como las derivadas de TEM y SHV (14). Los precursores de las enzimas del grupo
CTX-M han sido encontrados, prácticamente inalterados, en el cromosoma
de especies del género Kluyvera (6, 14), y han demostrado actividad
bLEE al ser incluidos en un entorno favorable para su expresión (14).
Es interesante resaltar que los aislamientos estudiados (incluso K96005) corresponden
a mediados de los años 90 en la región del Río de la Plata,
al igual que los primeros aislamientos productores de CTX-M-2 estudiados en
Argentina (1, 4, 12). Esta etapa podría corresponder a un período
de diseminación regional de este tipo de integrones en diferentes especies.
Sin embargo, estas estructuras del tipo de InK13 son relativamente estables,
como lo señala el hecho de que se continúen detectando en aislamientos
recientes. Por otro lado, su ubicación en un plásmido conjugativo
contribuye a explicar, al menos en parte, la amplia diseminación interespecie
de esta enzima tanto en Argentina como en Uruguay.
En este trabajo hemos descrito por primera vez el entorno genético de
blaCTX-M-2 de cepas aisladas de pacientes hospitalizados en Uruguay.
Los resultados obtenidos sugieren la diseminación regional de esta enzima,
codificada en un integrón de clase 1 complejo.
Las secuencias parciales de los integrones InK13 e InK05 (de K. pneumoniae
96005) fueron depositadas en la base de datos EMBL bajo los números de
acceso AM040450 y AM040449, respectivamente.
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Recibido:14/11/05
Aceptado: 26/6/06