Mecanismos de acción y de resistencia a rifampicina e isoniacida en Mycobacterium tuberculosis: nueva información sobre viejos conocidos
A. I. De la Iglesia1 Y H. R. Morbidoni*1,2
1Cátedra de Microbiología,
Virología y Parasitología, Facultad de Ciencias Médicas,
2Consejo de Investigaciones, Universidad Nacional de Rosario, Santa
Fe 3100 (2000) Rosario, Argentina
*Correspondencia. E-mail: hmorbido@unr.edu.ar
RESUMEN
La tuberculosis constituye todavía una de la causas más frecuentes
de mortalidad en el mundo. A pesar de la implementación de tratamientos
con cuatro drogas antituberculosas, la aparición de cepas resistentes
y multirresistentes ha comprometido la eficacia de los mismos. Dos de las drogas
en uso, la rifampicina y la isoniacida, recibieron gran atención por
su importancia terapéutica, incluso se han identificado los genes involucrados
en los mecanismos de resistencia y los que codifican para sus blancos moleculares.
La rifampicina es un inhibidor de la subunidad β de la ARN polimerasa de
procariotas, incluido Mycobacterium tuberculosis. La resistencia a esta
droga está principalmente mediada por mutaciones agrupadas en una región
del gen rpoB. Una pequeña fracción de cepas resistentes
no mostró mutaciones en rpoB, lo que sugiere la existencia de
otros mecanismos de resistencia, posiblemente eflujo de la droga. La isoniacida
es una prodroga que se activa por la catalasa-peroxidasa KatG. Mutaciones en
katG son las más comúnmente identificadas en cepas clínicas
de M. tuberculosis resistentes a isoniacida, confiriendo altos niveles
de resistencia. Sin embargo, el blanco molecular de acción para la isoniacida
es la InhA, una enoil-ACP reductasa involucrada en la vía de síntesis
de los ácidos micólicos. Otras mutaciones involucradas en la resistencia
a la isoniacida afectan al gen ndh, que codifica para la NADH deshidrogenasa.
Palabras clave: tuberculosis, resistencia a drogas, mecanismo de acción,
isoniacida, rifampicina
ABSTRACT
Mechanisms of action of and resistance to rifampicin and isoniazid in Mycobacterium
tuberculosis: new information on old friends. Human tuberculosis is
still one of the most frequent causes of death worldwide. Despite the implementation
of therapeutic regimes combining four drugs, the rise of resistant and multidrug-resistant
Mycobacterium tuberculosis strains has compromised their efficacy. Two
of the most effective anti-tubercular drugs in use, rifampicin and isoniazid,
have been closely studied due to their therapeutic importance. These studies
have led to the identification of the genes involved in resistance mechanisms
and of those encoding the molecular targets for these drugs. Rifampicin is an
inhibitor of the β-subunit of the RNA polymerase of prokaryotes, including
M. tuberculosis. Resistance to rifampicin is mediated by mutations clustered
in a small region of the rpoB gene. A fraction of resistant strains showed
no mutations in rpoB, suggesting that other mechanisms of resistance,
possibly efflux pumps, may exist. Isoniazid is a pro-drug activated by KatG,
a catalase-peroxidase. Mutations in katG, the most commonly found in
M. tuberculosis clinical isolates, give high levels of resistance. In
spite of this, the molecular target for isoniazid is InhA, an enoyl-ACP-reductase
involved in the biosynthesis of mycolic acids. Other mutations causing resistance
to isoniazid have been mapped to ndh, a gene encoding the NADH dehydrogenase.
Key words: tuberculosis, drug resistance, mechanisms of action, isoniazid,
rifampicin
INTRODUCCIÓN
La tuberculosis humana sigue siendo una de las
causas principales de muerte en el mundo y su tratamiento es todavía
una verdadera batalla de pronóstico incierto (26). El escaso arsenal
de drogas antituberculosas disponibles no ha tenido adiciones de nuevos fármacos
antituberculares específicos en los últimos 30 años (47),
por lo que el éxito del tratamiento depende en gran medida de su estricto
cumplimiento (93, 101). La mejora en los resultados de la terapia antituberculosa
se ha debido, fundamentalmente, a la implementación del sistema DOTS
(Directly Observed Treatment, Short Course, o tratamiento breve
directamente observado), basado en la toma de las drogas antituberculosas por
parte del paciente, supervisado por personal de salud para asegurar el cumplimiento
del tratamiento (36, 74). La quimioterapia contra M. tuberculosis es
diferente a la utilizada contra otros patógenos bacterianos debido al
largo tiempo de duplicación de esta micobacteria (18-24 horas, comparado
con los 30-40 minutos requeridos por otras bacterias), a su constitución
estructural, que le confiere una baja permeabilidad celular (56, 73, 90), y
a su capacidad de permanecer en el huésped en estado de latencia (140).
También es importante destacar que este patógeno puede ser hallado
en distintas ubicaciones dentro del huésped, donde enfrenta distintas
condiciones ambientales (82, 83). De esta manera, podemos pensar en la enfermedad
activa como la suma de distintas poblaciones dinámicas en el organismo.
Así, dado que los pulmones son los órganos más frecuentemente
afectados, en ellos pueden encontrarse micobacterias dividiéndose activamente
o manifestando un metabolismo reducido en las lesiones caseosas, en condiciones
de bajo pH y bajas tensiones de oxígeno. Estas poblaciones son metabólicamente
distintas y es razonable esperar diferente susceptibilidad a drogas antituberculosas,
como fue postulado por D. A. Mitchison (82, 83). Un modelo matemático
desarrollado por Lipsitch y Levin tomó en cuenta esta hipótesis
y llevó a la conclusión de que el abandono o la irregularidad
del tratamiento eran factores más importantes que la heterogeneidad poblacional
micobacteriana (72).
Las razones mencionadas explican la necesidad de instaurar una terapia basada
en la administración de cuatro fármacos bajo el sistema DOTS,
a fin de llegar a las distintas poblaciones de micobacterias para reducir drásticamente
su número y minimizar la aparición de mutantes resistentes a las
drogas.
En el tratamiento antituberculoso estandarizado se utilizan cuatro drogas, rifampicina
(RIF), isoniacida (INH), etambutol (EMB) y pirazinamida (PZA), durante la primera
fase de dos meses (llamada intensiva), la cual se continúa con una segunda
fase de cuatro meses con dos drogas (RIF e INH) (83, 84). Como se ve, RIF e
INH forman parte de ambas fases y constituyen las drogas más importantes
del tratamiento. La resistencia a ambos agentes antituberculosos obliga a elegir
drogas de menor efectividad, mayor toxicidad y mayor costo en su reemplazo,
denominadas drogas de segunda línea. De lo descrito se desprende lo primordial
de determinar si una cepa en estudio es resistente a RIF, a INH o a ambos antibióticos,
ya que esta situación determinará en gran medida el éxito
del tratamiento y la complejidad y costo del manejo terapéutico (34,
36, 37).
Las herramientas genéticas desarrolladas a partir de 1990 (16, 38, 55,
105) han permitido el análisis de los mecanismos de resistencia a algunas
de las drogas antituberculosas. Dado el valor terapéutico de ambas, la
rifampicina y la isoniacida fueron las primeras drogas cuyos mecanismos de acción
y de resistencia fueron estudiados a nivel molecular. El aislamiento de mutantes
resistentes a RIF o INH en el laboratorio ha permitido el estudio de los genes
más frecuentemente afectados por mutaciones, las cuales han sido validadas
al ser detectadas en cepas clínicas resistentes a estas drogas. En las
secciones siguientes se describe el conocimiento actual de los mecanismos de
acción de la RIF y la INH, así como los mecanismos involucrados
en la resistencia a estos antibióticos.
Bases genéticas de la resistencia a rifampicina
Ha sido claramente demostrado en Escherichia coli que la rifampicina
actúa inhibiendo la síntesis de ARN mensajero, a cargo de la ARN
polimerasa (38). Asimismo, mutantes de esta enterobacteria adquirían
resistencia a RIF mediante mutaciones en rpoB, el gen codificante para
la subunidad β de la ARN polimerasa. Basados en estos indicios, Telenti
et al. clonaron el gen rpoB de M. tuberculosis, determinaron
su secuencia y usaron esta información para amplificar dicho gen en 54
aislamientos clínicos RIFR y en 66 RIFS (128).
Estos investigadores hallaron que todas las cepas resistentes tenían
mutaciones en rpoB, mientras que las cepas sensibles no presentaban mutaciones
en este gen. Las mutaciones causantes de resistencia a RIF en M. tuberculosis
estaban agrupadas en una pequeña zona de rpoB e involucraban sólo
8 de los 23 aminoácidos presentes en esa región, especialmente
en los residuos 526 y 531 (127, 128). Estos datos fueron corroborados y extendidos
mediante el análisis de numerosos aislamientos clínicos en distintos
países. Se describieron mutaciones puntuales, inserciones y deleciones
que afectan una región de 100 pb en casi la totalidad (95%) de los casos
estudiados (88, 89, 100). Aprovechando las técnicas de manipulación
de ADN existentes y sobre la base del conocimiento reunido acerca de las mutaciones
en rpoB, Kapur et al. secuenciaron 128 cepas clínicas de
EE.UU., entre las que se incluyen 121 cepas RIFR (59). Estos investigadores
detectaron polimorfismos en la zona correspondiente a los 23 residuos de aminoácidos
mencionados; se cuentan entre ellos dos inserciones de tres o seis bases, tres
deleciones de seis y nueve bases y seis mutantes con dos mutaciones puntuales
en esta zona del gen rpoB. Nuevos estudios realizados por una gran cantidad
de laboratorios reportan las mismas mutaciones, hecho que valida estos hallazgos,
(1, 2, 4, 5, 19, 23, 42, 44, 52, 53, 67, 112, 119).
En un reporte reciente, Cummings y Segal analizaron la frecuencia de cambios
de aminoácidos que tenían una incidencia marcada sobre los valores
de concentración inhibitoria mínima (CIM) para RIF (27). Para
ello elaboraron un modelo de análisis de los cambios en la secuencia
de la zona 511-533 de rpoB de diversos aislamientos clínicos,
y los correlacionaron con los valores de CIM. Las mutaciones implicadas en el
cambio de aminoácidos fueron halladas en las posiciones 511, 513, 515,
516, 521, 526, 531 y 533; sin embargo, las mutaciones relevantes que causaban
aumento de la CIM para RIF correspondían solamente a los residuos 526
y 531, con incrementos de entre 100 y 400 veces (Tabla 1).
Por el contrario, cambios polimórficos en los residuos 511, 512, 515,
521 y 529 apenas tenían incidencia en los niveles de CIM (27). Este análisis
indica que la secuenciación de un fragmento de rpoB puede ser
una manera rápida de determinar el nivel de resistencia a RIF de un aislamiento,
en reemplazo de la más lenta técnica clásica de cultivo
(18, 79, 80, 117, 139).
Si bien no hay duda de que mutaciones en una región
pequeña de rpoB son responsables de la resistencia a rifampicina,
no todas ellas confieren resistencia a las demás rifamicinas de uso clínico.
La rifabutina es una rifamicina utilizada como droga de segunda línea
en el tratamiento de infecciones por M. tuberculosis y M. avium.
Mutaciones en los codones 526 y 531 de rpoB causan resistencia a la rifampicina
y a la rifabutina (94, 116); sin embargo, las restantes mutaciones descritas
en esta sección determinan resistencia a la rifampicina pero no a otras
rifamicinas, como lo demostraron Anthony et al. (7). Estos autores también
demostraron que la frecuencia de aparición de mutantes resistentes a
la rifabutina es 10 veces mayor cuando se obtienen a partir de mutantes resistentes
a la rifampicina, comparada con la frecuencia de aparición de mutantes
cuando se selecciona directamente por resistencia a la rifabutina, sin selección
previa para rifampicina. (34, 54, 59, 114).
A pesar de haberse identificado claramente a rpoB como el gen más
frecuentemente asociado a la resistencia a RIF en micobacterias, se ha reportado
un pequeño número de cepas resistentes sin mutaciones en este
gen. Es importante considerar la posibilidad de mecanismos de resistencia alternativos,
como son las bombas de eflujo, encargadas de eliminar una gran variedad de compuestos
del citoplasma de las bacterias (71, 114).
Resistencia a rifampicina y concepto de fitness
bacteriano
RIF e INH son drogas esenciales en el tratamiento de la tuberculosis; el aislamiento
de cepas clínicas resistentes a estas drogas ha creado un gran interés
en la frecuencia de aparición de dichos mutantes y en la identificación
y el análisis de los genes involucrados en los mecanismos de resistencia.
También resultó de interés estudiar el efecto que estas
mutaciones ocasionan en la fisiología celular. Este concepto, desarrollado
para otros géneros bacterianos, es conocido como bacterial fitness
(28, 46, 62, 77, 118). El mismo postula que la reducción en el uso de
drogas antimicobacterianas causaría la desaparición de las cepas
resistentes debido a que toda mutación tendría un costo adverso
en la fisiología de la célula mutante, traducido en una velocidad
de crecimiento menor comparada con las células salvajes. Esto llevaría
al desplazamiento de las células mutantes en la población total
de micobacterias. M. tuberculosis muestra una amplia variedad de fenotipos
medibles de fitness, incluidos tiempo de duplicación, transmisibilidad,
infectividad y patogenicidad, que podrían significar diferencias in
vivo (131). Estudios recientes han añadido más polémica
al tema, al demostrar que la medición del fitness puede variar
según el ensayo utilizado y, más aún, que pueden obtenerse
distintos resultados si se comparan valores obtenidos in vitro con los
obtenidos in vivo. Al mismo tiempo, los costos ocasionados por las mutaciones
que confieren resistencia a drogas pueden ser minimizados por mutaciones compensatorias,
sin pérdida de la resistencia y sin afectar mayormente la capacidad de
crecimiento (15, 28, 46, 62, 118). Estas mutaciones pueden ser de costo mínimo
para las células, como demostraron Sander et al. mediante un modelo
en el que utilizan la micobac-teria no patógena M. smegmatis (110).
Estos hechos sugieren que, lejos de desaparecer, las mutantes resistentes pueden
persistir en la población. Es por ello que es necesario estudiar la velocidad
de aparición de mutantes, así como también los efectos
de las mutaciones sobre el ciclo celular. Un ejemplo de esto es la reciente
publicación de Mariam et al. (77), donde se reporta el aislamiento
in vitro de mutantes RIFR. La secuenciación de rpoB
en estos mutantes mostró mayoritariamente la presencia de las mutaciones
Ser531Trp, His526Tyr y Ser522Leu, con valores de CIM superiores a 32 µg/ml.
Estos autores determinaron los tiempos de duplicación para la cepa salvaje
y las cepas mutantes, la capacidad de crecimiento en macrófagos y el
fitness relativo (tiempo de duplicación de la cepa salvaje/ tiempo de
duplicación de la cepa mutante) en ensayos de cultivo puro y de competencia
con la cepa salvaje (77). Los valores hallados, mostrados en la Tabla
2, ejemplifican el efecto que las mutaciones ejercen sobre la capacidad
metabólica celular. Por ejemplo, la mutante Harlingen rpoB Ser531Trp
ha sido aislada de pacientes con baja frecuencia (14% del total de aislamientos),
lo que podría atribuirse al bajo fitness de esta mutante in
vivo. En cambio, los reemplazos Ser531Leu e His526Tyr en el gen rpoB
de la misma cepa presentan una mayor capacidad de crecimiento in vivo
(0,84), lo que explica su mayor prevalencia de aislamiento (12).
Si bien el análisis de impacto de la resistencia a INH sobre el fitness de M. tuberculosis es un tópico de evidente importancia, el mismo deberá aguardar hasta la identificación de todos los genes involucrados en la resistencia y la comprensión del rol celular de los mismos.
Resistencia a isoniacida en micobacterias: mutantes
deficientes en catalasa-peroxidasa (KatG) son resistentes a la isoniacida
La isoniacida (forma hidracida del ácido isonicotínico) es una
droga de gran actividad sobre M. tuberculosis, con una CIM de 0,05 µg/ml.
Trabajos pioneros de F. Winder (139-149) y su posterior expansión por
K. Takayama (120-124), demostraron que INH inhibía específicamente
la síntesis de los ácidos micólicos, sin afectar la síntesis
de otros ácidos grasos. Los ácidos micólicos son ácidos
grasos ramificados de cadena muy larga (hasta 90 átomos de carbono),
constituyen uno de los componentes principales de la envoltura de la célula
micobacteriana y contribuyen, en gran medida, a su impermeabilidad (73). Sin
embargo, se debió esperar hasta los años noventa para que los
avances en la manipulación genética de micobacterias permitieran
el clonado y la expresión de los genes responsables de la resistencia
a INH. Uno de los primeros avances en este sentido lo constituyó la dilucidación
del rol en la actividad an-tituberculosa de INH de la enzima KatG, una catalasa-peroxidasa.
Así, Zhang et al. demostraron que INH era, en realidad, una prodroga
que se activaba por KatG, lo que da origen a una variedad de especies reactivas
(151, 152). Posteriormente, trabajos de Heym et al. identificaron katG
en el cromosoma de varias micobacterias, entre ellas M. tuberculosis,
y estudiaron además las mutaciones que afectaban a este gen en los aislamientos
clínicos INHR (49, 51). Hasta el presente, una larga serie
de reportes indican que katG es responsable de casi el 60% de los casos
de INHR en cepas aisladas de pacientes (3, 34, 39, 45, 49, 53, 54,
78, 109, 110, 134, 152). La mutación más comúnmente observada
en katG es en el codón 315, que causa el cambio del aminoácido
Serina 315 por Treonina (Ser315Thr), y está asociada con altos niveles
(5-10 µg/ml) de resistencia a INH (53, 78). La información generada
ha servido, como en el caso de la resistencia a RIF, para identificar las mutaciones
en katG responsables de la resistencia, lo que ha permitido diseñar
sistemas de detección basados en la secuenciación de ADN, en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o en polimorfismos de cadena
simple de ADN (SSCP) (33, 34, 54, 59, 61, 76). Estos estudios son de gran valor
para determinar rápidamente si una cepa clínica puede ser INHR
debido a la pérdida de la activación de INH ya que, como se ha
señalado, las mutaciones en katG son las más comunes. Sin
embargo, la existencia de otros genes implicados en la resistencia (como se
describe en las próximas secciones) deja una fracción importante
de aislamientos clínicos en los que las técnicas de PCR no son
aplicables para determinar la resistencia o sensibilidad a INH, al no conocerse
la identidad de los genes mencionados.
Otro interesante punto para remarcar es que katG es un gen no esencial
y, por lo tanto, no se ajusta a la definición de blanco de acción
de una droga. Entonces, la pregunta es: ¿cuál(es) es(son) la(s)
enzima(s) inhibida(s) por la forma activada de INH en micobacterias y cuántos
genes están involucrados en la resistencia a esta droga?
La isoniacida inhibe a la enoil-ACP reductasa,
enzima requerida para la síntesis de ácidos micólicos
Una de las mayores sorpresas deparadas por la secuenciación del genoma
de M. tuberculosis fue la observación de la presencia de gran
cantidad de genes dedicados a la degradación, síntesis y modificación
de ácidos grasos (24). Uno de los genes presentes en el cromosoma de
este patógeno (así como también en el de otras especies
de micobacterias) codifica para una enzima que contiene todos los dominios funcionales
requeridos para la síntesis de ácidos grasos, denominada sintetasa
de ácidos grasos de tipo I o FASI (Fatty Acid Synthase I). Lo
llamativo de la presencia de esta enzima en micobacterias es que es la misma
que sintetiza ácidos grasos en eucariotas, desde la levadura Saccharomyces
cereviseae hasta el ser humano (20, 57, 63, 115, 137). Estudios realizados
por K. Bloch en la década del setenta mostraron una actividad enzimática
de alto peso molecular presente en M. smegmatis, capaz de sintetizar
ácido palmítico in vitro (13, 14, 92, 96). Esto es sorprendente
si se considera que en la gran mayoría de los géneros bacterianos,
la síntesis de ácidos grasos procede a través de las mismas
reacciones químicas pero catalizadas por varias enzimas (o sea, por distintas
proteínas), cada una de las cuales lleva a cabo una etapa de la reacción
de síntesis (75, 107). Este conjunto de proteínas, físicamente
independientes, se asocian para llevar a cabo las reacciones de síntesis
y recibe la denominación de sintetasa de ácidos grasos de tipo
II o FASII (Fatty Acid Synthase II). Como se ha mencionado en la sección
precedente, trabajos publicados por Winder (139-149) y por Takayama (122-124)
demostraron que INH inhibía la síntesis de ácidos micólicos.
Sin embargo, no se conocían cuáles eran las enzimas implicadas
en dicha síntesis. La identificación del blanco de acción
de INH en micobacterias fue realizada, en su mayor parte, por el grupo de W.R.
Jacobs, y contribuyó no solamente a aclarar el mecanismo de acción
de la isoniacida sino también a comprender la ruta biosintética
de los ácidos micólicos, como se describe a continuación.
El grupo de Jacobs aisló cepas mutantes de la mico-bacteria no patógena
de crecimiento rápido M. smegmatis resistentes a INH, y clonó
e identificó el gen responsable (8). Este gen, también presente
con alto grado de homología en M. tuberculosis y M. bovis
BCG, fue denominado inhA y se vio que mostraba gran similitud con el
gen fabI de E. coli, involucrado en la síntesis de ácidos
grasos de bacterias mediada por FASII (Figura 1). Esta información
adquiere relevancia si se recuerda que INH causa inhibición de la síntesis
de los ácidos micólicos en micobacterias, pero no afecta la síntesis
de los ácidos grasos de cadena más corta producidos por FASI.
Al mismo tiempo podría estar señalando la existencia de dicho
sistema en micobacterias, dado que fabI es parte de FASII. Esta posibilidad
estaría sustentada por la necesidad de contar con un sistema de síntesis
para los ácidos micólicos, con lo cual las micobacterias tendrían
sistemas específicos para la síntesis de ácidos grasos
“normales” (necesarios para la síntesis de membrana citoplasmática)
y “extra-largos”.
La secuenciación del gen mutado en cepas
de M. smegmatis INHR mostró que el cambio del aminoácido
Serina 94 por Alanina (Ser94Ala) era el responsable de la resistencia a INH.
Asimismo se demostró que esta cepa mutante presentaba resistencia cruzada
a la droga antuberculosa de segunda línea etionamida (8), la que también
actúa inhibiendo la síntesis de ácidos micólicos
(97). Sin embargo, numerosos aislamientos clínicos INHR eran
ETHS, lo que sugiere blancos distintos. Estudios llevados a cabo
por Ortiz de Montellano y otros investigadores mostraron recientemente que la
etionamida es también una prodroga activada por una monooxigenasa denominada
EthA (10, 31, 131), y esto justificaría la proporción de aislamientos
clínicos INHR-ETHS. El hecho de que cepas clínicas
mostraran resistencia tanto a INH como a ETH indicaba un mecanismo de resistencia
compartido, lo que fue confirmado al clonar y secuenciar el gen inhA
en cepas INHR katG (+) y ETHR ethA (+).
En todas las cepas analizadas se encontraron mutaciones en inhA que eran
suficientes para impedir la unión de INH* (INH activado) y ETH* (ETH
activado) (48, 65, 69, 86, 106).
La identificación de InhA como blanco de acción de INH en micobacterias
llevó a la secuenciación del gen inhA en numerosos aislamientos
clínicos, y se encontró que las mutaciones más frecuentes
eran de dos tipos: 1) en la región promotora de inhA (este gen
está ubicado corriente abajo del gen mabA, con el cual forma un
operón) y 2) en la región codificante de inhA. Dos trabajos
muy completos en cuanto a la naturaleza de las mutaciones detectadas en katG
e inhA son los de Morlock et al. (86) y Cardoso (17), donde se
analizan cepas clínicas de EE.UU., Rusia y Brasil. Las mutaciones más
frecuentemente halladas en las zonas promotora y codificante de mabA-inhA
se muestran en la Figura 2. En todos los casos estudiados,
las mutaciones que afectaban inhA otorgaban bajos niveles de resistencia
a INH, en contraposición a la alta resistencia mediada por mutaciones
en katG. En cierta manera es lo esperable, dado que InhA es una enzima
esencial y, por lo tanto, sólo puede soportar una cierta cantidad de
reemplazos de aminoácidos sin alterar su función enzimática.
En cambio KatG es una enzima no esencial y su pérdida impide la activación
de INH. En este contexto es interesante comentar que mientras M. tuberculosis
INHR acepta relativamente pocas mutaciones en el marco de lectura
y zona del promotor del gen inhA (Figura 2), M.
smegmatis INHR, que ha sido usado como un microorganismo modelo,
tolera muchas más mutaciones en dicho gen (89). Dado que ambos genes
son conservados, estos resultados sugieren que la expresión y actividad
de la enoil-ACP reductasa está más estrictamente controlada en
M. tuberculosis (H.R. Morbidoni et al., manuscrito en preparación).
Trabajos posteriores llevados a cabo por Jacobs
y sus asociados incluyeron la caracterización bioquímica y biofísica
de la enzima InhA, y comprobaron que la forma activada de INH (INH*) se unía
a NADH (cofactor de la reacción catalizada por InhA) y luego el complejo
reaccionaba con InhA causando su inactivación (9, 32, 98).
Para validar el rol de InhA como enzima esencial y blanco de acción de
INH, Vilcheze et al. aislaron mutantes termosensibles (TS) de M. smegmatis
resistentes a INH (133, 134). Una de estas mutantes fue caracterizada y se encontró
que la mutación que causaba la resistencia a INH y la termosensibilidad
afectaba a InhA, por lo tanto quedaba inequívocamente demostrado que
inhA es un gen esencial y que es el blanco de acción de la forma
activada de INH. Cultivos en fase de crecimiento exponencial de esta mutante
cambiados a temperaturas no permisivas, mostraban inhibición de la síntesis
de ácidos micólicos y cinética de lisis indistinguible
de cultivos salvajes de M. smegmatis o M. bovis var. BCG tratados
con INH (135). Conjuntamente con esos resultados, Larsen et al. demostraron
que la sobrexpresión de inhA era suficiente para incrementar la
CIM para INH y ETH en M. tuberculosis, M. bovis var BCG y M.
smegmatis, lo que prueba que InhA es el blanco de acción de ambas
drogas antituberculosas (64). Estos resultados son de importancia ya que ETH
es una droga de segunda línea que se usa en reemplazo de INH cuando la
cepa es INHR; como se ve, ETH puede ser utilizada si se comprueba
que la resistencia a INH es causada por mutaciones en katG.
El mecanismo de acción de INH involucra otros genes desconocidos, ya
que se han aislado cepas clínicas resistentes a INH que no presentaban
mutaciones en katG ni en inhA (66, 68). Estudios llevados a cabo
en el laboratorio del Dr. W. R. Jacobs identificaron un nuevo gen involucrado
en la resistencia a INH, ndh, que codifica para la enzima NADH deshidrogenasa
(81). Las mutantes aisladas mostraban corresistencia a INH y ETH, con valores
de CIM de 2 a 6 veces más altos que los de la cepa salvaje (M. bovis
BCG var. Pasteur) (136). Este resultado es esperable dado que, como se mencionó
anteriormente, la forma activada de INH se une a una molécula de NADH
(cofactor de la reacción) para inhibir a InhA (32, 99). Mutaciones en
el gen ndh fueron descritas en cepas clínicas, hecho que valida
los estudios basados en mutantes espontáneas de M. bovis BCG resistentes
a INH con mutaciones en dicho gen, aisladas en el laboratorio (68).
La Tabla 3 resume el conocimiento actual de los genes involucrados
en la resistencia a la isoniacida, así como también los valores
de CIM observados en cada caso. El rol de otros genes (como los que participan
en la regulación de la expresión de katG y que, por lo
tanto, influyen en el nivel de actividad de KatG en la célula) queda
fuera de los alcances de esta revisión y será considerado en futuras
publicaciones. Los mecanismos de acción identificados o propuestos para
INH se muestran esquematizados en la Figura 3.
En resumen, tanto INH como ETH son prodrogas activadas por la catalasa-peroxidasa KatG y la monooxi-genasa EthA, respectivamente. Ambas prodrogas, luego de su activación, inhiben a InhA, la enoil-ACP reductasa involucrada en la síntesis de ácidos micólicos, lo que explica la aparición de cepas clínicas resistentes a ambas drogas antituberculosas. La información generada sobre el mecanismo de acción y de resistencia a INH y ETH debe ser tenida en cuenta al identificarse cepas clínicas de M. tuberculosis resistentes a INH, por la probabilidad de que también presenten resistencia cruzada a ETH.
Diagnóstico de resistencia a isoniacida:
¿termociclar o no termociclar?
Si se considera el tiempo de duplicación de M. tuberculosis (18-24
h) y el tiempo de aparición de colonias en medios de cultivo sólidos
(de uno a dos meses), la determinación de la sensibilidad o resistencia
a las drogas antituberculosas difícilmente se pueda informar al infectólogo
tratante en menos de dos meses. Es clara la necesidad de contar con metodologías
que permitan realizar estos estudios en un lapso sensiblemente menor, para evitar
la instauración de tratamientos empíricos que quizás no
sólo resulten inefectivos sino que, tal vez, favorezcan la propagación
de cepas resistentes a drogas en la comunidad.
La utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
constituyó uno de los mayores avances en las ciencias biológicas
en los últimos veinte años. Una de sus consecuencias más
visibles ha sido la aplicación de técnicas de amplificación
de material genético para revelar la presencia de diversos microorganismos
(virus, bacterias, hongos) en muestras biológicas, aun presentes en muy
baja cantidad, lo que permite un diagnóstico rápido y sensible
(6, 40, 70, 120). De la misma manera, la amplificación de secuencias
específicas (junto con otras técnicas fenotípicas de detección),
ha permitido evidenciar la presencia de genes que codifican enzimas involucradas
en mecanismos de patogénesis, tales como la producción de toxinas
(11, 60, 87) o la resistencia a antibióticos (25, 29, 35, 43, 91, 102,
113). Los mecanismos de resistencia a drogas en micobacterias involucran genes
cromosomales (50), a diferencia de otras especies donde varios de los mecanismos
de resistencia están codificados en plásmidos, como ocurre con
las β-lactamasas (58, 95, 103, 108, 121). En estos casos, los genes que
causan la resistencia a antibióticos son mucho más fácilmente
evidenciables, ya que no tienen un correlato cromosomal y su detección
implica el carácter de resistencia (104, 112). En comparación
con otros grupos, la determinación de la resistencia a drogas por métodos
moleculares en micobacterias no es tan fácil y depende de la cantidad
de genes cromosomales implicados. Un ejemplo, basado en lo comentado en las
secciones precedentes, es la resistencia a RIF, donde la mayoría de las
mutaciones se concentran en una pequeña zona del gen, de relativamente
fácil amplificación y análisis (21, 30, 85). Sin embargo,
si bien las técnicas de amplificación de ADN se utilizan para
demostrar la resistencia a RIF, no son sencillas de aplicar en la determinación
de resistencia a INH. Esto es debido a que la resistencia a INH requeriría
el análisis de varios genes, aun teniendo en cuenta que la mayoría
de las mutaciones deberían afectar a katG, que contienen un número
variable de mutaciones, no siempre agrupadas dentro del gen. Sin embargo, se
han publicado trabajos donde se reporta la utilización de métodos
moleculares para la determinación rápida de resistencia a INH,
la mayoría de los cuales son en general costosos y requieren personal
entrenado y equipamiento de complejidad media o alta (22, 33, 41, 104, 129,
130, 132).
Resistencia a RIF: ¿marcador presuntivo
de resistencia a INH?
Uno de los misterios pendientes de resolución en esta historia es la
frecuente aparición simultánea de resistencia a RIF y a INH. Dado
que ambas drogas son la columna vertebral del tratamiento antituberculoso, es
de vital importancia conocer a la brevedad si la cepa en estudio es resistente
o sensible a estos antibióticos. Desafortunadamente para el éxito
del tratamiento terapéutico, la literatura basada en los casos clínicos
analizados reporta la resistencia a RIF como un marcador de resistencia a INH.
Si bien los datos experimentales avalan la teoría según la cual
las mutaciones causales de resistencia a RIF pueden disminuir la capacidad transcripcional
de las mutantes (15, 28), hasta el momento se desconoce la razón capaz
de explicar por qué cepas RIFR son muy frecuentemente INHR . Es de tener
en cuenta el modelo matemático sugerido por Lipsitch y Levin (72), en
el cual la existencia de distintos compartimentos con micobac-terias en distinto
estado metabólico (y por consiguiente, con distinta sensibilidad a drogas)
explicaría la posibilidad de aparición de mutantes resistentes
a una droga, y en estadios posteriores, de resistencia secundaria. En este análisis,
la resistencia a INH, la droga más potente, aparece y se convierte en
predominante en la población cuando no hay adherencia al tratamiento.
Agradecimientos: los autores agradecen la excelente labor secretarial del Sr. Adrián Fornasari. HRM es Investigador Independiente del CIUNR (Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Rosario).
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Recibido:
31/10/05
Aceptado: 5/6/06