Diagnóstico de pseudotuberculosis en ovinos patagónicos
S. Estevao Belchior1*, A. Gallardoz1, A. Ábalos1, Y. Díaz1, L. Álvarez1, R. Callejo2, M. Prieto2, N. Jodor1, O. Jensen3
1Centro
Regional de Investigación y Desarrollo Científico Tecnológico
(CRIDECIT), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia
San Juan Bosco, Ciudad Universitaria Km 4 (9000) Comodoro Rivadavia, Chubut;
2Servicio de Bacteriología Especial, INEI-ANLIS "Dr
Carlos G. Malbrán", Avda. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad
Autónoma de Buenos Aires; 3Departamento de Zoonosis, Secretaría
de Salud de la Provincia de Chubut, Chacra N° 18 (9020) Sarmiento, Chubut.
Argentina.
* Correspondencia. E-mail: sbelchior@unpata.edu.ar
RESUMEN
La linfadenitis caseosa (LAC) es una enfermedad bacteriana supurativa crónica
que afecta a ovinos. El agente etiológico es Corynebacterium pseudotuberculosis.
El diagnóstico diferencial con otras afecciones que presentan manifestaciones
clínicas similares sólo puede hacerse sobre la base del aislamiento
y la identificación del agente etiológico. El objetivo de este
trabajo fue caracterizar metabólica y genéticamente al agente
causal de abscesos granulomatosos observados en ovinos en la región patagónica.
En las muestras, se observó un contenido caseoso rodeado de una membrana
fibrosa, y en el examen histopatológico, un centro de necrosis caseosa
rodeado por células epitelioides, linfocitos y polinucleares. Mediante
estudios microscópicos, bacteriológicos y moleculares fue confirmada
la infección causada por C. pseudotuberculosis biovar ovis.
Palabras clave: pseudotuberculosis, ovinos, Corynebacterium
pseudotuberculosis
ABSTRACT
Diagnosis of caseous lymphadenitis in sheep from Patagonia. Caseous
lymphadenitis (CLA) is a chronic bacterial, infectious and contagious disease
caused by Corynebacterium pseudotuberculosis. It affects sheep and
results in abscesses of the lymph nodes in subcutaneous tissue, as well as in
internal organs such as lungs, liver and kidneys. Differential diagnosis of
the disease is based on the isolation and biochemical identification of the
etiological agent. The purpose of this study was to characterize the bacteria
isolated from typical CLA lesions in sheep from Patagonia, Argentina, at metabolic
and genetic levels. Macroscopic observations show a fibrous membrane containing
caseous necrotic tissue. Histopathological analysis shows an eosinophilic necrotic
area surrounded by epitheloid cells and polymorphonuclear infiltration. Other
analyses performed such as microscopic observations, in vitro culture, biochemical
tests and 16s rDNA sequencing confirmed diagnosis of caseous lymphadenitis due
to C. pseudotuberculosis.
Key words: pseudotuberculosis, sheep, Corynebacterium pseudotuberculosis
La linfadenitis caseosa
(LAC), pseudotuberculosis, apostema de los ovinos o enfermedad de Preisz-Nocard,
es una enfermedad bacteriana supurativa crónica que afecta principalmente
a pequeños rumiantes (1, 2). Puede causar enflaquecimiento y deterioro
del estado general de los animales enfermos, que se traduce en la disminución
de la producción de lana, carne y leche (11). La enfermedad se presenta
en las formas cutánea y/o visceral. La primera se caracteriza por la
formación de abscesos en el sistema linfático subcutáneo,
que se palpan a través de la piel. En la forma visceral, los abscesos
se manifiestan en ganglios internos de la cavidad torácica y órganos
importantes, como pulmones, hígado y riñones (2, 7). El hallazgo
de abscesos en ganglios linfáticos y órganos en ovinos de la región
patagónica de Argentina es común durante la faena (3).
El agente causal de la LAC es Corynebacterium pseudotuberculosis. En
estudios realizados por Songer et al. (13), se identificaron dos biotipos
basados en la producción de la enzima nitrato reductasa, y se han propuesto
los términos "biovar equi" para las especies que
reducen nitratos y "biovar ovis" para aquellas que no cumplen
con esa condición. La última biovariedad es el agente etiológico
de LAC en pequeños rumiantes (2, 7, 8, 13).
El objetivo de este trabajo fue caracterizar metabólica y genéticamente
al agente causal de abscesos granulomatosos observados en ovinos de la región
patagónica argentina.
La población en estudio fueron ovinos procedentes de la región
patagónica austral de Argentina, de las razas Merino y Corriedale, de
ambos sexos y de todas las categorías de ovinos adultos: borregos, ovejas,
capones y carneros. Para el análisis se consideraron aquellos ovinos
que mediante inspección ocular y palpación de canales y órganos
presentaron ganglios y vísceras de consistencia y tamaño anormal.
Se observaron 600 animales sacrificados en un frigorífico local, de los
cuales 180 (30%), cumplieron con los criterios de inclusión fijados.
Una porción de cada espécimen fue fijada en formol al 10%, procesada
por la técnica clásica de inclusión y cortes en bloques
de parafina y coloreada con hematoxilina-eosina.
Una alícuota de aproximadamente 1 g del contenido interior de las lesiones
se homogeneizó con 9 ml de solución fisiológica estéril
mediante vórtex. De esta suspensión se realizó microscopía
y aislamiento. Las muestras se colorearon con las técnicas de Gram y
de Ziehl Neelsen y se sembraron en agar sangre e incubaron en atmósfera
normal a 37 °C durante 48 a 72 h. La caracterización de las colonias
se realizó de acuerdo al tamaño, pigmento, olor y presencia de
hemólisis (15).
Las colonias aisladas se identificaron de manera preliminar, previa coloración
de Gram, con las pruebas de catalasa, oxidasa, oxidación/fermentación
de glucosa en agar cistina tripteína, producción de hemólisis
y efecto de los lípidos sobre el crecimiento. Además, se realizaron
las pruebas de hemólisis sinérgica frente a Rhodococcus equi
(prueba de CAMP) y de inhibición de la β-hemolisina del Staphylococcus
aureus (CAMP reversa), de sensibilidad frente al factor 0/129 e hidrólisis
de gelatina a 22 °C. Estas pruebas se practicaron e interpretaron de acuerdo
a metodología estandarizada (6, 15). El sistema comercial API® Coryne
(bioMérieux, France) fue utilizado de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. Los ensayos se incubaron 48 h a 37 °C.
La identificación de las cepas se confirmó por técnicas
moleculares mediante la secuenciación del gen 16S rDNA. La amplificación
de este gen se realizó con los primers correspondientes a la
posición 827 y 1492 del gen 16S rDNA de Escherichia coli. Los
productos de PCR fueron secuenciados utilizando el equipo Big Dye Terminator
v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems) y analizados en el ABI 377 Genetic
Analyzer (PE Applied Biosystems). El alineamiento de las secuencias se realizó
con el programa BLAST, comparándolas con secuencias disponibles en la
base de datos del National Center for Biotecnology Information (NCBI). Para
la identificación bacteriana se utilizó el programa BIBI (Bioinformatics
Bacterial Identification), cuya dirección electrónica es, http://pbil.univ-lyon1.fr/bibi/,
y mediante el programa CLUSTAL W se construyó el árbol y se establecieron
las distancias filogenéticas.
La sensibilidad a antibióticos se determinó utilizando el método
de difusión con discos, de acuerdo a metodologías estándar
ya establecidas (4). Para ello se utilizó agar Mueller-Hinton suplementado
con 5% de sangre ovina. Las lecturas de los halos de inhibición se realizaron
a las 48 h y, dado que no hay valores de corte aceptados que específicamente
asignen categorías interpretativas para las corinebacterias, se utilizaron
los valores recomendados por el National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS) para Staphylococcus spp. (10).
Se analizaron 123 muestras de ganglios y vísceras, de consistencia y
tamaño anormal, obtenidas de diferentes animales que cumplieron con el
criterio de inclusión. Su distribución fue la siguiente: ganglios
superficiales (78), ganglios mediastínicos (18) y abscesos granulomatosos
observados en pulmones (16), hígados (4) y riñones (7). Debido
a problemas operativos, no fue posible determinar con certeza a qué número
de animales pertenecían los órganos analizados.
Macroscópicamente, se observó en el interior de las muestras tejido
necrótico de consistencia caseosa en el 47% de los materiales, el 21%
presentó núcleos de calcificación, el 19% con disposición
en catáfila de cebolla, y con contenido de pus verdoso y espeso en el
13%. Histológicamente, se determinó un centro eosinófilo
de necrosis de tipo caseosa rodeado por células epitelioides, linfocitos
y polinucleares, más externamente tejido conectivo fibroso. Algunas muestras
presentaron focos de calcificación rodeados de envoltura fibrosa, con
linfoplasmocitos y corona de linfocitos. Con la microscopía se pudieron
reconocer formas bacilares gram-positivas agrupadas. No se observaron bacilos
ácido-alcohol-resistente.
En los cultivos predominaron colonias de 1 mm de diámetro, de color blanco
y de consistencia seca, rodeadas de un halo tenue de β-hemólisis.
Se seleccionaron 89 cepas de bacilos gram-positivos pequeños, agrupados
en empalizada, compatibles con corinebacterias. Los aislamientos fueron no lipofílicos,
con metabolismo fermentativo; presentaron reacción positiva para las
pruebas de catalasa, oxidasa, α-glucosidasa, ureasa, CAMP, CAMP reversa, producción
de ácido a partir de glucosa y ribosa; y fueron negativos para reducción
de nitrato, pirazinamidasa, pirrolidonil-arilamidasa, β-glucuronidasa, β-galactosidasa,
N-acetil-β-glucosaminidasa, hidrólisis de gelatina a 37 y 22 °C,
fermentación de: xilosa, manitol, lactosa y glucógeno, y resistentes
al factor 0/129. El 50% de las cepas fueron fosfatasa alcalina positiva, el
70% fermentó maltosa y el 40% sacarosa.
Con el método molecular, se obtuvo una similitud del 99% con las secuencias
de referencia de C. pseudotuberculosis CIP 102968T y NCTC 3450, depositadas
en el GenBank.
Todas las cepas fueron sensibles a: penicilina (10U), vancomicina (30 µg),
cefotaxima (30 µg), gentamicina (10 µg), kanamicina (120 µg),
eritromicina (30 µg), tetraciclina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg),
norfloxacina (10 µg), ampicilina (10 µg), rifampicina (5 µg),
trimetoprima-sulfametoxazol (25 µg), cloranfenicol (30 µg). El 16%
mostró sensibilidad intermedia a amicacina (AMK-30 µg) y el 6%
a nitrofurantoína (NIT-300 µg). La resistencia a oxacilina (1 µg)
fue de 37%, a AMK 19% y a NIT 2%.
Las características macroscópicas e histológicas de las
muestras examinadas se correspondieron con las lesiones patognomónicas
de la enfermedad LAC (7).
Teniendo en cuenta los resultados de las observaciones microscópicas
y las pruebas preliminares, el microorganismo estudiado se consideró
perteneciente al género Corynebacterium. El resultado negativo
de la prueba de pirazinamidaza permitió agrupar las cepas dentro del
grupo Corynebacterium diphteriae, del que forman parte las especies
C. diphteriae, ulcerans y pseudotuberculosis (6).
Las pruebas de ureasa y resistencia al factor O/129 diferenciaron a C. pseudotuberculosis
de las especies C. diphteriae y C. ulcerans, respectivamente
(6, 15). El análisis molecular permitió confirmar la identidad
taxonómica de la cepa como perteneciente a la especie C. pseudotuberculosis.
Dado que las cepas no fueron productoras de nitratorreductasa, se clasificaron
como biovariedad ovis (13). Las pruebas de CAMP y CAMP reversa confirmaron la
producción de la toxina fosfolipasa D (FLD), determinante de patogenicidad
de C. pseudotuberculosis. In vivo, la FLD hidroliza la esfingomielina
de las membranas celulares endoteliales de vasos sanguíneos y linfáticos,
facilitando la colonización y diseminación del patógeno
en el huésped (14).
Las características bioquímicas obtenidas coincidieron con las
informadas en publicaciones de autores que estudiaron cepas de C. pseudotuberculosis
en Francia (12), República Checa (8), Australia, Sudáfrica, Estados
Unidos y Canadá (13). El perfil de sensibilidad a los antibióticos
fue similar al comunicado por Lipky et al. (9) y Judson y Songer (5).
Si bien las cepas resultaron sensibles a la mayoría de los antibióticos,
ha sido demostrado que la eficacia de éstos in vivo resulta
prácticamente nula (9).
Mediante las metodologías de laboratorio empleadas se confirmó
el diagnóstico de linfadenitis caseosa en las muestras analizadas. Este
estudio permitió, además, caracterizar metabólicamente
cepas autóctonas de C. pseudotuberculosis biovar ovis
aisladas de ovinos de la región patagónica.
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Recibido:
14/08/06
Aceptado: 11/12/06