Evaluación de la técnica de MSP-PCR para la caracterización molecular de aislamientos de Rhodotorula mucilaginosa provenientes de la Patagonia noroccidental
D. Libkind*
Laboratorio de Microbiología Aplicada y Biotecnología (MABB), Universidad Nacional del Comahue, Centro Regional Universitario Bariloche (CRUB) - CCT Comahue, UE Bariloche, CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas). Bariloche, Río Negro, Argentina.
* Correspondencia. E-mail: libkind@crub.uncoma.edu.ar
RESUMEN
La identificación rápida de levaduras de origen ambiental o clínico es de importancia para el estudio de la biodiversidad de estos microorganismos y para la detección de posibles patógenos. Rhodotorula mucilaginosa es una levadura ubicua y pigmentada, capaz de producir infecciones en pacientes inmunocomprometidos. En este trabajo se evaluó la utilidad de la técnica de fingerprinting conocida como MSP-PCR (Micro/Minisatellite-Primed PCR) en la caracterización e identificación de aislamientos ambientales de R. mucilaginosa provenientes de la Patagonia noroccidental. Sobre la base de sus caracteres fenotípicos, de un total de 200 levaduras pigmentadas se seleccionaron 110 aislamientos que presuntamente corresponderían a la especie R. mucilaginosa. Se evaluaron los iniciadores (GTG)5, (GAC)5 y M13 en aislamientos representativos, y se seleccionó el iniciador (GTG)5 por ser el que permitió una mejor agrupación de los aislamientos pertenecientes a R. mucilaginosa y una mejor diferenciación de éstos con los de especies filogenéticamente próximas. Utilizando dicho iniciador, el 87% de los aislamientos de R. mucilaginosa presentó un perfil de MSP-PCR similar (> 60%) al de la cepa de referencia CBS 316T de R. mucilaginosa. La técnica de MSP-PCR resultó efectiva, tanto para caracterizar e identificar un número elevado de aislamientos ambientales de R. mucilaginosa como para detectar polimorfismos en la especie.
Palabras clave: Levaduras; Microsatélites; Minisatélites; Patagonia; PCR fingerprinting
ABSTRACT
Assessment of the MSP-PCR technique for the molecular characterization of Rhodotorula mucilaginosa isolates from northwestern Patagonia. The rapid identification of environmental or clinical yeast isolates is important for biodiversity studies and the detection of probable pathogens. Rhodotorula mucilaginosa is a ubiquitous and pigmented yeast capable of infecting immunocompromised patients. In this study, we evaluated the Micro/mini satellite-primed PCR (MSP-PCR) fingerprinting method for the characterization and identification of R. mucilaginosa isolates from natural environments in northwestern Patagonia. There were selected 110 putative R. mucilaginosa isolates from 200 environmental pigmented yeast isolates on the basis of phenotypic criteria. (GTG)5, (GAC)5 and M13 primers were initially evaluated in representative R. mucilaginosa isolates. (GTG)5 allowed a good grouping of these isolates and, at the same time, a good differentiation among closely related species, and thus was selected for subsequent studies. R. mucilaginosa isolates (87%) presented similar (> 60%) MSP-PCR profiles to those of the reference strain CBS 316T. The MSP-PCR technique was effective, both, for the characterization and identification of a large number of R. mucilaginosa environmental isolates as well as for the detection of polymorphisms within the species.
Key words: Yeasts; Micro-satellites; Mini-satellites; Patagonia; PCR fingerprinting
INTRODUCCIÓN
La especie de levadura basidiomicética Rhodotorula
mucilaginosa (Jörgensen) Harrison posee una amplia distribución
en la naturaleza. Tiene la capacidad de colonizar
múltiples sustratos naturales y artificiales, por lo que
se la considera una levadura ubicua (4). Además, presenta
una asombrosa capacidad de adaptarse a ambientes
extremos (3, 11, 17). R. mucilaginosa ha sido también
aislada de muestras clínicas (7, 18) y, en algunos
casos, se la ha considerado un patógeno emergente (8),
dado que puede causar infecciones en huéspedes
inmunocomprometidos (10).
R. mucilaginosa se caracteriza por la coloración rojosalmón
de sus colonias, lo cual es el resultado de la acumulación
de pigmentos carotenoides de interés industrial,
tales como torularodina, toruleno y b-caroteno (14).
Existen características fenotípicas, tanto bioquímicas
como fisiológicas, que permitirían distinguir a R. mucilaginosa del resto de las especies de levaduras. Sin
embargo, el estudio de estos caracteres fenotípicos es
muchas veces laborioso y poco confiable, e implica la realización de aproximadamente 60 pruebas bioquímicas
y fisiológicas.
En la actualidad, la identificación inequívoca de levaduras
a nivel de especie requiere indefectiblemente la
utilización de técnicas de biología molecular, en particular
de las técnicas de secuenciación de regiones de valor
taxonómico de los genes que codifican para los ribosomas
(ADNr). No obstante, existen técnicas alternativas basadas
en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR
fingerprinting), que permiten caracterizar genéticamente
cepas de levaduras en forma rápida y económica. La técnica
denominada Micro/Minisatellite-Primed PCR (MSPPCR)
es un ejemplo de éstas y se basa en la amplificación
de regiones de ADN repetidas y adyacentes denominadas
micro (repeticiones de 2 - 10 nucleótidos) o minisatélites
(de 15 - 30 nucleótidos), las que se encuentran
típicamente distribuidas a lo largo del genoma de los organismos
eucariotas. Numerosos trabajos han demostrado
la utilidad de la MSP-PCR para estudios de diversidad
genética de diferentes especies y géneros (1, 6, 9,
16), y como herramienta en el estudio de la biodiversidad
de levaduras en ambientes naturales (5, 12, 19). Saracli
et al. (18) estudiaron aislamientos clínicos de R. mucilaginosa
mediante electroforesis en gel de campo pulsante
(PFGE), y constituye éste el único antecedente en el estudio
de un número elevado de cepas de esta especie
por técnicas de biología molecular.
Durante un estudio de diversidad de levaduras en
ambientes acuáticos de la Patagonia noroccidental, se
encontró que R. mucilaginosa representaba más del 50%
de los aislamientos, y que se trataba de la especie de
mayor distribución en los cuerpos de agua estudiados
(12). Aunque con menor frecuencia, en sustratos terrestres
de la región Patagónica también se evidenció la presencia
de R. mucilaginosa (13). El objetivo del presente
trabajo fue evaluar la utilidad de la técnica de MSP-PCR
para la caracterización e identificación rápida de aislamientos
de R. mucilaginosa de origen ambiental; en particular,
de aquellos provenientes de ambientes naturales
de la Patagonia noroccidental argentina.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento y conservación
Se obtuvieron 200 aislamientos de levaduras productoras de
pigmentos carotenoides (pigmentadas) a partir de muestras de
agua (de lagos, lagunas y ríos), de suelo de bosque nativo, de la
superficie del estroma del hongo Cyttaria spp., de néctar de flores
y de frutos silvestres. El estudio de los sustratos mencionados
se realizó dentro del Parque Nacional Nahuel Huapi. Las
metodologías utilizadas para el aislamiento fueron descritas por
Brizzio y van Broock (2) y Libkind et al. (12). Se incluyó la cepa
de referencia R. mucilaginosa CBS 316T, cedida por el Dr. J. P.
Sampaio (Centro de Recursos Microbiológicos, SABT, FCT,
Universidade Nova de Lisboa, Portugal). Los cultivos puros fueron
conservados a 4 °C mediante repiques periódicos en agar
papa glucosado (PDA) en pico de flauta (20).
Caracterización fenotípica
Se realizó la caracterización fenotípica de los 200 aislamientos,
que incluyó estudios micro/macro-morfológicos (pigmentación
de las colonias, producción de balistosporas, margen y textura
de las colonias, forma celular) y fisiológicos (asimilación de
compuestos nitrogenados y de compuestos carbonados, síntesis
de compuestos amiláceos, T° máxima de crecimiento, producción
de ureasa), según lo descrito por Yarrow (20).
Caracterización molecular
La extracción del ADN se realizó mediante el protocolo descrito
por Libkind et al. (12). Para el análisis por MSP-PCR se
emplearon los oligonucleótidos sintéticos (GTG)5 y (GAC)5
(Pharmacia Biotech) en experimentos de micro-satélites, y la
secuencia central del fago M13 (GAGGGTGGCGGTTCT, iniciador
M13, Pharmacia Biotech) para experimentos de
minisatélites. Las reacciones de PCR fueron realizadas en un
volumen de reacción de 25 ml que contenía 1X PCR buffer
(Pharmacia, Biotech); 2 mM de cada uno de los cuatro dNTPs
(Promega); 3,5 mM de cloruro de magnesio; 0,8 mM de iniciador,
10-15 ng del ADN genómico y 1 U Taq ADN polimerasa
(Pharmacia, Biotech). El ADN fue amplificado en un termociclador
Uno II Thermal Cycler (Biometra) mediante un paso inicial de
desnaturalización de 5 min a 95 °C, seguido por 40 ciclos de 45
s a 93 °C, 60 s a 50-55 °C y 60 s a 72 °C, y un paso final de
extensión de 6 min a 72 °C. Los fragmentos de ADN amplificados
fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al
1,4% (Gibco-BRL) en 0,5 X TBE buffer (Buffer tris-Borato-EDTA)
a 90 V por 3,5 h y teñidos en solución de bromuro de etidio (2
mg/ml). En cada gel fue incluido un marcador de peso molecular
como referencia (ADN del fago l cortado con HindIII y ADN de
F X174 cortado con HaeIII - Pharmacia, Biotech). Todas las reacciones
se realizaron al menos por duplicado, a fin de evaluar
la reproducibilidad de los perfiles de bandas obtenidos.
Análisis de los perfiles moleculares
Los perfiles de amplificación de bandas obtenidos fueron
visualizados mediante un transiluminador UV y fotografiados con
el sistema Kodak Digital Science EDA 120. Se empleó el programa
Kodak Digital Science 1D Image Analysis para la interpretación
de la imagen y el GelCompar, versión 4.1 (Applied
Maths 1998, Kortrijk), para analizar los patrones de bandas de
ADN. En el análisis fueron incluidas las bandas de entre 300 y
2000 pb, y en general se analizaron entre 5 y 20 bandas por
perfil. La relación entre los perfiles fue estimada mediante el
coeficiente de Pearson (también conocido como coeficiente de
correlación producto-momento) provisto por el programa
GelCompar, y se generaron dendrogramas mediante el método
UPGMA (Unweighted Pair Group Method)
Análisis de las secuencias del ADNr
Para un número selecto de cepas se efectuó el análisis de la
secuencia de los dominios D1/D2 de la región del ADN que codifica
para la subunidad ribosomal 26S (26S ADNr), de acuerdo
con lo descrito por Libkind et al. (12). Las secuencias obtenidas,
una vez corregidas, fueron comparadas con secuencias equivalentes
disponibles en bases de datos públicas (GenBank), a través
de la herramienta BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De un total de 200 aislamientos de levaduras pigmentadas
provenientes de ambientes naturales de la
Patagonia noroccidental, 110 (55%) fueron asignados
preliminarmente a la especie R. mucilaginosa, sobre la
base de las características fenotípicas observadas, a
saber: elevada mucosidad de las colonias; ausencia de
producción de compuestos amiláceos; ausencia de estructuras
sexuales; ausencia de balistosporas e incapacidad
de asimilar inositol, eritritol y D-glucuronato como
fuentes de carbono y NO3 - como fuente de nitrógeno.
Dichas características concuerdan con las típicas de la
especie (4). Los 90 aislamientos restantes no presentaron
estas características, por lo que se consideró que
pertenecían a especies diferentes de R. mucilaginosa.
A través de la técnica de MSP-PCR y empleando individualmente
los iniciadores (GAC)5, (GTG)5 y M13, se
obtuvieron los perfiles de ADN para 5 aislamientos de R.
mucilaginosa elegidos al azar y para la cepa de referencia.
La Figura 1 muestra estos perfiles, así como los de
especies emparentadas con R. mucilaginosa, también
aisladas de la Patagonia y tomadas a modo de ejemplo.
Los 3 iniciadores arrojaron perfiles de bandas similares
para los aislamientos de R. mucilaginosa, con un patrón
también similar al de la cepa de referencia. El iniciador
(GTG)5 evidenció el perfil de MSP-PCR de mayor similitud
(> 80%, coeficiente de Pearson) entre la cepa de referencia
y las cepas salvajes. Las especies distintas de R. mucilaginosa incluidas en la Figura 1 a modo comparativo
corresponden a especies cercanas filogenéticamente
a la especie en estudio. A diferencia del iniciador
M13, los iniciadores (GAC)5 y (GTG)5 permitieron la correcta
diferenciación de estas 3 especies respecto de R.
mucilaginosa. Los perfiles de ADN obtenidos con el iniciador
M13 fueron en general homogéneos, caracterizados
por una única banda predominante de aproximadamente
575 pb. Estos resultados sugieren que en este
caso el iniciador M13 amplificaría regiones más conservadas
y, por lo tanto, tendría menor grado de resolución
para diferenciar especies emparentadas con R. mucilaginosa.
Otros autores reportaron resultados que apoyan
esta hipótesis (6). Si bien el iniciador M13 no sería de
utilidad para diferenciar especies cercanas a R. mucilaginosa,
es de destacar que sí lo es para diferenciar
especies pertenecientes a otros grupos taxonómicos (9,
12, 15). El comportamiento de los distintos iniciadores
en la técnica de MSP-PCR varía con el grupo filogenético
en estudio.
Figura 1. Caracterización de 5 aislamientos de Rhodotorula mucilaginosa mediante MSP-PCR
utilizando los iniciadores (GAC)5 (a), (GTG)5 (b) y M13 (c). T: cepa de referencia CBS 316T; RB: Rhodosporidium babjevae CRUB 1113; RG: Rhodotorula graminis CRUB 1118; RK: Rhodosporidium kratochvilovae CRUB 0014; M: marcador de peso molecular (l ADN cortado
por HindIII y F X174 ADN cortado con HaeIII).
Dado que el iniciador (GTG)5 arrojó los perfiles de
mayor similitud entre los distintos aislamientos de R.
mucilaginosa y también entre éstos y la cepa de referencia,
al mismo tiempo que permitió diferenciarlos de especies
próximas, fue seleccionado para estudiar la totalidad
de los aislamientos mediante la técnica de MSP-PCR fingerprinting. Los perfiles obtenidos fueron variables, lo
que permitió rápidamente confirmar que los 90 aislamientos
no considerados R. mucilaginosa, sobre la base de
criterios fenotípicos, diferían en más del 60% en sus perfiles
MSP-PCR con la cepa de referencia. Asimismo, al
analizar los perfiles obtenidos para los 110 aislamientos
a priori considerados R. mucilaginosa, se observó que el
75,5% de éstos (83 aislamientos) exhibía al menos 60%
de similitud entre sí y con la cepa de referencia R.
mucilaginosa CBS 316T.
En la Figura 2 se presenta un análisis de los perfiles
obtenidos a partir de un grupo representativo del total de
aislamientos estudiados, incluyendo 13 de los 27 aislamientos
que tuvieron perfiles de similitud menores al 60%.
Como se puede observar, no se detectaron correlaciones
entre los distintos clusters obtenidos en el análisis
de perfiles de MSP-PCR y el origen de los aislamientos.
Las secuencias D1/D2 de aislamientos representativos
que poseían perfiles de similitud mayor al 60% resultaron
ser idénticas en un 100% a R. mucilaginosa CBS
316T (AF070432), lo que confirma su pertenencia a dicha
especie (datos no publicados).
Figura 2. Análisis de los perfiles MSP-PCR obtenidos con el
iniciador (GTG)5 procesados mediante el programa GelCompar
y el algoritmo UPGMA. Coeficiente de correlación cofenético:
0,883. L.: Lago; La.: Laguna; R.: Río; CBS: Centraalbureau voor
Schimmelcultures; CRUB: Centro Regional Universitario
Bariloche. La línea punteada representa el límite de similitud de
perfiles del 60%.
La evidencia recolectada en el presente trabajo sugiere
que una similitud en los perfiles de MSP-PCR con
(GTG)5 de al menos 60% sería suficiente para permitir
una identificación inequívoca de aislamientos de R.
mucilaginosa. De los 27 aislamientos con perfiles de similitud
menor al 60%, tan solo 12 pertenecían verdaderamente a R. mucilaginosa considerando los resultados
de secuenciación del ADNr. Las 15 cepas identificadas
incorrectamente como R. mucilaginosa por métodos
fenotípicos fueron clasificadas en las especies Rhodosporidium
babjevae, Rhodosporidium kratochvilovae y Rhodotorula graminis. De este modo, se confirma un total
de 95 aislamientos patagónicos de R. mucilaginosa.
Tanto de las muestras provenientes de ambientes
acuáticos como de las terrestres, se aisló R. mucilaginosa
(Tabla 1). Sin embargo, esta especie fue considerablemente
más abundante en los ambientes acuáticos, en
particular en los cuerpos de agua lénticos, donde fue la
especie predominante. Hasta el momento, no ha sido
posible obtener aislamientos de R. mucilaginosa a partir
de muestras de suelo o frutos silvestres. En conjunto, los
resultados sugieren una amplia distribución de esta especie
de levadura en los ambientes naturales de la
Patagonia noroccidental.
Tabla 1. Distribución y abundancia relativa de aislamientos de Rhodotorula mucilaginosa en ambientes naturales de la Patagonia noroccidental
Los resultados aquí presentados indican que la identificación
de R. mucilaginosa de muestras ambientales
mediante técnicas fenotípicas puede arrojar resultados
incorrectos, por lo tanto, ésta debería ser complementada
por métodos moleculares. La técnica de microsatélites
utilizando el iniciador (GTG)5 se presenta como una alternativa
promisoria, dado que en el presente trabajo permitió
la correcta identificación de más del 87% de los
aislamientos de R. mucilaginosa. Como ya fue reportado
con anterioridad (12), es evidente que esta técnica, además,
detecta variabilidad intraespecífica en R. mucilaginosa.
En el trabajo citado se analizaron un número limitado
de aislamientos de R. mucilaginosa provenientes
exclusivamente de ambientes acuáticos, mientras que el
presente estudio abarca un mayor número de aislamientos
ambientales, tanto de origen acuático como terrestre.
Esto permite una mejor evaluación de la técnica de MSPPCR
en el estudio de esta especie. En nuestro laboratorio
se encuentran actualmente en desarrollo estudios tendientes
a evaluar el valor taxonómico de la heterogeneidad
intraespecífica de R. mucilaginosa aquí observada.
Saracli et al. (18) llevaron a cabo un estudio epidemiológico
con aislamientos de origen clínico de R.
mucilaginosa. En dicho trabajo, uno de los pocos (si no
el único) que aborda la caracterización molecular de aislamientos
de R. mucilaginosa, se analizaron 6 aislamientos
utilizando los métodos RAPD (Random Amplification
of Polymorphic DNA, o amplificación al azar de fragmentos
polimórficos de ADN) y PFGE. Ambas técnicas permitieron
separar los 5 aislamientos obtenidos de muestras
de sangre de aquel obtenido de próstata. Sin embargo,
se consideró que los aislamientos estudiados correspondían
a R. mucilaginosa teniendo en cuenta los
resultados de la asimilación de algunas fuentes de carbono,
lo cual, como se ha demostrado en el presente
estudio, puede arrojar identificaciones incorrectas. Más
aún, todos los aislamientos estudiados mostraron perfiles
de RAPD y PFGE diferentes de la cepa de referencia
utilizada. Sería necesaria la confirmación de la identidad
de los aislamientos por secuenciación de ADNr para permitir
la correcta interpretación de los resultados obtenidos
en el citado estudio.
La técnica de MSP-PCR se destaca por su sencillez
metodológica, bajo costo y rápida obtención de resultados,
en comparación con otras técnicas moleculares como
PFGE, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,
o polimorfismo en la longitud de los fragmentos
de restricción) o secuenciación del ADNr. La alta reproducibilidad
de esta técnica también le da ventajas respecto
de técnicas similares, como el RAPD. A su vez, la
técnica de MSP-PCR presenta elevada versatilidad por
la existencia de iniciadores con diferente grado de resolución,
los que permitirían la diferenciación tanto a nivel
de especie como de subespecie. En el presente trabajo,
esta técnica fue fundamental para lograr una rápida caracterización
e identificación de un número elevado de
aislamientos ambientales de R. mucilaginosa provenientes
de la Patagonia noroccidental.
Agradecimientos: el presente trabajo ha sido financiado por la Universidad Nacional del Comahue (proyecto B121), del CONICET (proyecto PIP6536) y la ANPCyT (proyecto PICT 22200, PMT - BID 1728/OC-AR). Se agradece al Dr. J. P. Sampaio (Centro de Recursos Microbiológicos, SABT, FCT, Universidade Nova de Lisboa, Portugal) por proveer la cepa de referencia de R. mucilaginosa y facilitar su laboratorio para la realización de este trabajo. D. Libkind fue beneficiado por una beca del CONICET y por el convenio con Portugal PO/PA02-BI/ 002 financiado por la SECYT. Se agradece el permiso de muestreo a la administración de Parques Nacionales.
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Recibido: 4/12/06
Aceptado: 4/7/07