Evaluación de dos equipos inmunocromatográficos comerciales para el diagnóstico rápido de la infección por rotavirus
C. J. Téllez 1,2, R. Montava1, Juan M. Ribes1, M. D. Tirado2, J. Buesa1*
1 Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Hospital Clínico Universitario
de Valencia, Avda. Blasco Ibáñez, 17; 46010 Valencia, España.
2 Servicio de Microbiología, Hospital General
de Castellón, Avda. Benicassim, s/n; 12004 Castellón, España.
*Correspondencia. E-mail: Javier.Buesa@uv.es
RESUMEN
Se realizó un estudio prospectivo para evaluar dos equipos comerciales inmunocromatográficos para el diagnóstico rápido de infección por rotavirus a partir de muestras fecales: VIKIA® Rota-Adeno, de bioMérieux, y Simple Rota- Adeno, de Operon. Como método de referencia se utilizó la transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) con cebadores específicos del gen de la proteína VP7 de rotavirus del grupo A. La sensibilidad y la especificidad respecto de la RT-PCR fueron del 98,4% y 84,8% para el Simple Rota-Adeno, y del 100% y 24,2% para el VIKIA® Rota-Adeno. Es de destacar la baja especificidad de este último equipo diagnóstico, que presentó un elevado número de falsos positivos, por lo que el valor predictivo de un resultado positivo es sólo del 71,6%. Asimismo, se identificaron los genotipos de las cepas de rotavirus detectadas; la mayoría de ellas correspondieron al genotipo G9P(8) (65%), seguido de los genotipos G1P(8) (25,4%) y G2P(8) (3,2%).
Palabras clave: Rotavirus; Inmunocromatografía; Diagnóstico rápido; RT-PCR
ABSTRACT
Evaluation of two immunochromatography kits for rapid diagnosis of rotavirus infections. A prospective study was conducted to evaluate two immunochromatography (ICG) commercial kits for diagnosis of rotavirus infection, VIKIA® Rota-Adeno (bioMérieux) and Simple Rota-Adeno (Operon). Reverse transcriptase and polymerase chain reaction (RT-PCR) with specific primers for the VP7 gene of group A rotavirus was used as the reference method. The sensitivity and specificity of the ICG tests compared with those of the reference method were 98.4% and 84.8%, respectively, for Simple Rota-Adeno (Operon), and 100% and 24.2% for VIKIA® Rota-Adeno (bioMérieux). It is remarkable the low specificity of the latter method, which yields a high number of false positive results. The predictive value of a positive result by this method was only 71.6%. Most of the detected rotavirus strains corresponded to genotype G9P(8) (65%), followed by G1P(8) (25.4%) and G2P(8) (3.2%).
Key words: Rotavirus; Immunochromatography; Rapid diagnosis; RT-PCR
Las infecciones por rotavirus son la causa más común
de diarrea grave en niños menores de 5 años y se
producen en todas las regiones del mundo. Se calcula
que estos virus ocasionan más de 125 millones de casos
de gastroenteritis aguda y 611.000 fallecimientos anuales
(12).
El diagnóstico rápido de las infecciones por rotavirus
permite tanto instaurar el tratamiento adecuado y evitar
el uso innecesario de antibióticos, como implantar medidas
preventivas para evitar la transmisión comunitaria o
nosocomial, además de disminuir el número de casos de
diarrea de etiología no filiada (13).
Aunque existen distintos métodos para detectar
rotavirus en las heces, los más habituales en la práctica
clínica son las técnicas inmunológicas (enzimoinmunoensayo,
aglutinación con látex e inmunocromatografía),
que detectan antígeno de rotavirus del grupo
A. Entre estos métodos inmunológicos, el enzimoinmunoensayo
es el considerado de referencia por su elevada
sensibilidad y especificidad (6). La inmunocromatografía
es una técnica introducida más recientemente,
y numerosas casas comerciales han desarrollado pruebas
para el diagnóstico de rotavirus basados en este
método (2). Se trata de métodos diagnósticos sencillos,
rápidos, que no requieren instrumental especial y que
presentan valores de sensibilidad y especificidad muy
similares a los mostrados por el enzimoinmunoensayo
(13).
Existen otros métodos para detectar rotavirus pero no
están disponibles en muchos laboratorios, como la microscopía
electrónica, la inmunomicroscopía electrónica,
la electroforesis en gel de poliacrilamida y la transcripción
reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RTPCR),
tanto convencional como en tiempo real. La RT PCR es la técnica más sensible, aunque de realización
más compleja que las técnicas inmunológicas (3).
El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar dos
de estos equipos diagnósticos inmunocromatográficos
que detectan simultáneamente antígenos de rotavirus y
de adenovirus, tomando como método de referencia la
RT-PCR convencional con cebadores específicos del gen
de la proteína VP7 de rotavirus del grupo A.
Se estudiaron 96 muestras de heces correspondientes
a otros tantos pacientes que presentaban clínica compatible
con gastroenteritis aguda vírica y que procedían
de las áreas de salud 2 y 4 de la Comunidad Valenciana
(España). Las muestras fueron recogidas durante los
meses de invierno de 2006-2007, período con elevada
prevalencia de infecciones por rotavirus, especialmente
en niños menores de 5 años.
Se utilizaron dos ensayos de inmunocromatografía:
VIKIA® Rota-Adeno (bioMérieux) y Simple Rota-Adeno
(Operon) para detectar antígeno de rotavirus del grupo A
en las heces. Todas las muestras fueron además procesadas
por RT-PCR para investigar la presencia de ARN
vírico, siendo este método considerado en nuestro estudio
como el de referencia.
VIKIA® Rota-Adeno es una técnica inmunocromatográfica
que se utiliza para la doble detección cualitativa
de rotavirus del grupo A y adenovirus (antígeno de género).
La prueba se realiza mediante un dispositivo que
contiene un pocillo para dispensar la muestra, donde se
mezcla con un conjugado constituido por microesferas
de poliestireno de colores azul y rojo, unidas respectivamente
a anticuerpos monoclonales anti-rotavirus y antiadenovirus;
una zona de prueba con una membrana de
cromatografía con un anticuerpo monoclonal anti-rotavirus
y un anticuerpo monoclonal anti-adenovirus fijados, y una
zona de control con un anticuerpo policlonal anti-IgG de
ratón. La muestra migra a lo largo de la membrana durante
diez minutos (tiempo de la prueba). La zona de control
sirve para comprobar que el procedimiento se ha llevado
a cabo correctamente. Si las heces contienen rotavirus se
forman complejos antígeno-anticuerpo con anticuerpos
monoclonales anti-rotavirus unidos a microesferas de
poliestireno que se fijan a los anticuerpos anti-rotavirus de
la zona de prueba, visualizándose una línea azul.
La única diferencia entre la técnica anterior y la prueba
de Simple Rota-Adeno de Operon es que en esta última
los anticuerpos monoclonales contra el antígeno de
rotavirus están conjugados a partículas de látex de color
rojo. El fundamento y procesamiento de ambas es prácticamente
idéntico.
Para la RT-PCR, a partir de suspensiones de las muestras
de heces al 10% en tampón fosfato salino (PBS) se
efectuó la extracción del ARN bicatenario vírico mediante
fenol-cloroformo y purificación con celulosa CF11.
Posteriormente se sintetizó el ADN complementario mediante
la reacción de transcripción reversa y amplificación
ótidos descritos por Gouvea et al. (9).
Los amplificados de PCR de 1.062 pb de longitud se analizaron
por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en
tampón Tris-borato y se observaron trastinción con bromuro
de etidio en un transiluminador de luz UV. Además,
se procedió a determinar los genotipos G (VP7) y P (VP4)
de las cepas detectadas en este estudio, para analizar si
existía alguna correlación entre los resultados obtenidos
por ambos métodos inmunocromatográficos y los genotipos
de las cepas encontradas. El análisis de los genotipos
G y P se realizó por RT-PCR utilizando los cebadores
descritos por Gouvea et al. (9) y Gentsch et al. (8). No se
óla detección de adenovirus.
Para determinar la sensibilidad, la especificidad y los
valores predictivos de los equipos comerciales, sus resultados
se consideraron verdaderos positivos o verdaderos
negativos según su concordancia con los resultados
de la RT-PCR. Para estudiar dicha concordancia se
utilizó la prueba de Kappa (5).
De las 96 muestras estudiadas, 62 (64,5%) resultaron
positivas para rotavirus por las tres técnicas. El equipo
Simple Rota-Adeno presentó 5 falsos positivos y un solo
falso negativo, frente a VIKIA® Rota-Adeno que ofreció
25 falsos positivos y ningún falso negativo (Tabla 1). La
sensibilidad y la especificidad respecto de la RT-PCR
fueron del 98,4% y del 84,8%, respectivamente, para el
Simple Rota-Adeno; y del 100% y del 24,2% para VIKIA®
Rota-Adeno (Tabla 2).
Tabla 1. Resultados del diagnóstico de infección por rotavirus mediante el uso de dos equipos
comerciales basados en técnicas inmunocromatográficas. Método de referencia: RT-PCR.
Tabla 2. Análisis comparativo de dos equipos inmunocromatográficos comerciales para el
diagnóstico de infección por rotavirus
La prueba de Kappa mostró una concordancia del 30% entre el equipo VIKIA® Rota-Adeno y la RT-PCR; y del 88% entre el equipo Simple Rota-Adeno y la RT-PCR. En la Tabla 3 se muestran las combinaciones de genotipos G/P detectadas en este estudio. Se logró determinar el genotipo G y P de las 63 cepas diagnosticadas, y se encontró que el 65% correspondió a la combinación G9P[8]. No se ha encontrado una relación significativa entre los resultados negativos obtenidos por los métodos inmunocromatográficos y los genotipos encontrados en esas muestras.
Tabla 3. Combinaciones de genotipos G y P de las cepas de
rotavirus detectadas en las muestras de heces analizadas.
La necesidad de realizar un diagnóstico rápido de las
gastroenteritis por rotavirus y de instaurar un tratamiento
eficaz de la diarrea ha impulsado el desarrollo de técnicas
diagnósticas que disminuyan el tiempo necesario para
la obtención de los resultados y que tengan altos niveles
de fiabilidad, para orientar el tratamiento de las gastroenteritis
y restringir la transmisión de los virus. Las técnicas
de aglutinación de látex sensibilizado y, más recientemente,
los métodos inmunocromatográficos cumplen
estos requerimientos y, por tanto, tienen utilidad en
el diagnóstico de las infecciones por rotavirus.
En este estudio se llevó a cabo el análisis de los
genotipos G y P de las cepas víricas mediante técnicas
de PCR multiplex semianidada (8, 9), que han servido,
además, para confirmar los resultados positivos de la PCR
inicial. Las técnicas de PCR anidada o incluso la PCR en
tiempo real pueden actualmente incrementar la sensibilidad
de la PCR como método diagnóstico (7).
No hemos encontrado en la bibliografía estudios que
evalúen alguna de estas dos técnicas inmunocromatográficas
utilizando la RT-PCR como técnica de referencia.
Existen estudios en los que se comparan otros
métodos inmunocromatográficos comerciales para la
detección de rotavirus en heces con técnicas de PCR.
Nguyen et al. (10) observaron una sensibilidad y una
especificidad del 87,8% y 93,3%, respectivamente, para
Dipstick "Eiken" Rota kit, de SA Scientific (8); y Wilhelmi
et al. del 98,5% y 96,2%, respectivamente, para Rota-
Strip, de Coris BioConcept (13). La sensibilidad encontrada
para VIKIA® Rota-Adeno de bioMérieux fue del
100% y superó tanto las cifras anteriores como la hallada
para Simple Rota-Adeno de Operon, (98,4%). Sin
embargo, la especificidad de VIKIA® Rota-Adeno fue muy
baja (24,2%) y, aunque la de Simple Rota-Adeno de
Operon fue mucho mejor (84,8%), tampoco alcanza los
Bon et al. compararon el test VIKIA® Rota-Adeno con
una técnica de enzimoinmunoensayo (Argene, Varilhes,
Francia), y encontraron una sensibilidad del 92,5% y una
especificidad del 100% (2). Estos resultados difieren
mucho de los encontrados por nosotros al comparar dicha
técnica con la RT-PCR. En ese estudio se compararon
siete ensayos inmunocromatográficos comerciales
con un método de ELISA (Argene) y, curiosamente, con
ninguno de ellos detectaron falsos positivos.
Las técnicas inmunocromatográficas detectan antígenos
de la cápside del virus, mientras que la RT-PCR
identifica el ARN viral. En principio, las técnicas inmunológicas
son menos sensibles que la RT-PCR (11), pero
también depende de los métodos de extracción de los
ácidos nucleicos, de los cebadores utilizados, de la ausencia
de inhibidores inespecíficos de las reacciones
enzimáticas y de la estabilidad de los ácidos nucleicos
víricos de la muestra (3). Los resultados falsos positivos
obtenidos por inmunocromatografía, especialmente
con el método Vikia® Rota-Adeno, fueron detectados
al realizar la RT-PCR, debido a la mayor especificidad
de esta técnica. No se ha podido relacionar la aparición
de un resultado positivo con ninguno de los parámetros
de las muestras analizadas ni de los datos clínicos de
los pacientes. Se ha señalado que la presencia de sangre
en las heces puede originar resultados falsos positivos
con los métodos inmunocromatográficos (Dr. Pierre
Pothier, Universidad de Dijon, Francia, comunicación
personal). Otra posibilidad es que se produzca una reacción
cruzada de alguno de los anticuerpos con
antígenos distintos de los de rotavirus presentes en la
muestra.
En el periodo en que se llevó a cabo este estudio, la
prevalencia de cepas de genotipo G9 ha sido muy elevada,
como queda reflejado en el hecho de que el 65% de
las cepas de este ensayo fueron G9P(8). La alta prevalencia
del serotipo G9 en nuestra zona geográfica en el
periodo estudiado es un dato ya observado (1), y contrasta
con la ausencia de este genotipo antes del año
2004 (4).
En conclusión, los métodos inmunocromatográficos
pueden ser de gran utilidad en el diagnóstico rápido de
las infecciones por rotavirus, si bien es necesario valorar
la sensibilidad y la especificidad de los métodos comerciales
disponibles, pues pueden existir variaciones importantes
entre ellos. Son aplicables como métodos de
cribado por su elevada sensibilidad, pero las muestras
positivas deberían ser confirmadas con un ELISA de captura
o una técnica de RT-PCR.
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Recibido: 06/05/08
Aceptado: 08/08/08