MICROBIOLOGÍA BÁSICA
Amplificación del gen CAP59 en Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii directamente a partir de una suspensión de levaduras
N. Siachoque, V.M. Jewtuchowicz, C. Iovannitti, M.T. Mujica*
Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad
de Buenos Aires. Paraguay 2155 piso 11 (1121) Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: mtmujica@gmail.com
RESUMEN
Cryptococcus es una levadura capsulada de la clase Basidiomycetes y es el agente etiológico de la criptococosis. La criptococosis es una de las infecciones oportunistas más comunes en pacientes inmunosuprimidos, aunque puede afectar a individuos inmunocompetentes. En los últimos años, la identificación de especies fúngicas de importancia médica se ha logrado gracias a la amplificación de determinadas regiones del ADN o de genes fúngicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El gen CAP59 está implicado en la síntesis de la cápsula en Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii, y es de utilidad en la identificación molecular de sus serotipos. En este trabajo utilizamos aislamientos de distintos serotipos provenientes de una colección de cultivos y de C. neoformans recuperados de pacientes con criptococosis. La amplificación del gen CAP59 se realizó a partir de suspensiones estandarizadas de levaduras de los diferentes aislamientos de Cryptococcus, las que actuaron como molde. Este procedimiento fue rápido, sencillo y económico y no requirió ningún paso previo a la PCR, lo que puede facilitar en forma considerable la realización de estudios taxonómicos en los laboratorios que disponen de herramientas de biología molecular.
Palabras clave: Gen CAP59; Cryptococcus neoformans; Criptococosis; Cryptococcus gattii
ABSTRACT
CAP59 gene amplification in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii directly from a yeast suspension. Cryptococcus is an encapsulated yeast of class Basidiomycetes, etiologic agent of cryptococcosis. Cryptococcosis is one of the most common opportunistic infections in immunosuppressed patients, although it can affect immunocompetent individuals. In recent years, the identification of medically important fungal species has been achieved through the amplification of specific regions or genes of fungal DNA by polymerase chain reaction (PCR). The CAP59 gene is involved in the synthesis of the capsule in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, and is useful in the molecular identification of serotypes. In this research, we use yeasts of different serotypes from collection strains and C. neoformans isolates recovered from patients with cryptococcosis. A standardized yeast suspension from different Cryptococcus isolates as template allowed CAP59 gene amplification. This procedure was quick, simple, and inexpensive and required no PCR steps. This is important for taxonomic studies in laboratories with implemented molecular biology tools.
Keys word: CAP59 gene; Cryptococcus neoformans; Cryptococcosis; Cryptococcus gattii
La levadura capsulada Cryptococcus pertenece a la
clase Basidiomycetes y es el agente etiológico de la
criptococosis, una micosis que en las últimas tres décadas
se ha convertido en una de las infecciones oportunistas
más comunes en pacientes inmunosuprimidos,
aunque también puede afectar a individuos inmunocompetentes
(10). C. neoformans es un microorganismo
con distribución universal y es encontrado, sobre todo,
en individuos inmunocomprometidos, particularmente
en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia
humana. En contraste, Cryptococcus gattii puede
infectar a individuos inmunocompetentes y se lo
aísla generalmente de áreas subtropicales o tropicales,
aunque se ha recuperado en regiones más templadas
(6, 7, 11, 14).
Durante varias décadas, la estructura del polisacárido
capsular permitió agrupar a las cepas de C. neoformans en dos variedades que incluían a los 5 serotipos: C.
neoformans variedad neoformans para las cepas de los
serotipos A, D y AD, y C. neoformans variedad gattii para
las cepas con los serotipos B y C (10). Con base en estudios
genómicos, se propuso que el serotipo A fuera
reclasificado como C. neoformans var. grubii, mientras
que el serotipo D continuó perteneciendo a la especie
neoformans y a la variedad neoformans (4). Una especie
nueva e independiente, C. gattii, ha sido recientemente
propuesta para lo que antes se conocía como C.
neoformans var. gattii (8). Estos cambios nos llevan a
considerar como válidos a C. neoformans var. grubii (serotipo A), C. neoformans var. neoformans (serotipo D), C. gattii (serotipos B y C) y el híbrido de C. neoformans
perteneciente al serotipo AD. El significado de los
serotipos de Cryptococcus puede extenderse más allá
de lo taxonómico a lo epidemiológico (1, 15), por la posibilidad
de que, según sea el serotipo, Cryptococcus afecte
pacientes con diferentes estados inmunes, presenten
diferentes cursos clínicos y tengan distinta respuesta a
los antifúngicos (7, 11, 14). En los últimos años se han
desarrollado numerosos métodos basados en la amplificación
de determinados genes o regiones del ADN mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
la identificación de especies fúngicas y serotipos de C.
neoformans (3, 5). Así, el análisis de la secuencia nucleotídica
del gen URA5 y su posterior análisis filogenético
permitió separar los serotipos A y D en dos grupos bien
definidos (5). El gen que codifica la fosfolipasa B1 (PLB1)
resultó útil en la diferenciación de las variedades y
serotipos a través de PCR y un análisis posterior de
polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP) (9). Los genes CAP10, CAP59, CAP60 y
CAP64 se consideran esenciales para la formación de la
cápsula en C. neoformans (12) y están relacionados con
los serotipos A, B, C, D y el híbrido AD (3).
El aislamiento y la purificación del ADN es un paso
clave en los estudios de biología molecular. Los métodos
de extracción de ADN fúngico involucran la ruptura
de la pared celular mediante la lisis enzimática o mecánica
y, en general, requieren pasos adicionales para la
obtención de ADN puro.
En este trabajo evaluamos la utilidad de amplificar el
gen CAP59 a partir de suspensiones estandarizadas de
levaduras de Cryptococcus de los distintos serotipos, las
que actuaron como molde en la PCR, sin ningún paso
previo.
Aislamientos en estudio. Se usaron las cepas de referencia
C. neoformans var. grubii serotipo A (ATCC 6352),
C. gattii serotipo B (ATCC 32269), C. gattii serotipo C
(ATCC 32608), C. neoformans var. neoformans serotipo
D (ATCC 28957) y 20 aislamientos de Cryptococcus provenientes
de pacientes con criptococosis, de los cuales
14 se obtuvieron de líquido cefalorraquídeo (LCR) y 6 de
hemocultivos. La identificación de los aislamientos se
realizó mediante criterios morfológicos y bioquímicos:
producción de melanina en medio Staib, crecimiento a
37 ºC, producción de ureasa en medio de Christensen,
estudio de asimilación de fuentes de carbono utilizando
el sistema API ID 32 C (bioMérieux, Marcy-L'Étoile, Francia)
y utilización de la glicina-canavanina-azul de bromotimol
(GCB) (7, 8,10).
Estudios moleculares. Los diferentes aislamientos se
cultivaron en agar Sabouraud y se incubaron a 37 °C
durante 48 h. Para la amplificación del gen CAP59 se
realizaron suspensiones de las levaduras en agua destilada
estéril con opacidades correspondientes a 0,5, 1, 2
y 3 de la escala de Mc Farland; una alícuota de 10 μl de
cada suspensión se usó como molde para la PCR.
Para los aislamientos de C. neoformans provenientes
de cultivos de pacientes con criptococosis se realizaron
suspensiones en agua destilada con opacidad correspondiente
a 2 de la escala de Mc Farland.
PCR. La reacción de PCR se realizó según el siguiente
protocolo: tampón PCR 1 x 5 μl, 200 μM de cada
de-soxirribonucleósido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP), 0,3 mM de MgCl2, 0,4 μM de cada iniciador
(CAP59F: 5'-CCTTGCCGAAGTTCGAAACG-'3 y CAP59R:
5'-AATCGGTGGTTGGATTCAGTGT-'3) (3), 10 μl de molde,
1,25 U/μl Taq DNA polimerasa (Invitrogen, Argentina)
y suficiente agua destilada para que el volumen final de
reacción fuera de 50 μl. La amplificación del gen CAP59 fue optimizada en nuestro laboratorio con los siguientes
ciclos: 1 min a 94 °C seguido de 30 ciclos de 1 min a
94 °C, 30 seg a 65 °C y 1 min a 72 °C, con una extensión
final de 15 min a 72 °C. Se empleó un termociclador
MiniCycler (TM MJ Research Inc, NY, EE.UU.); en cada
experimento se incluyeron controles negativos.
Detección del producto de PCR. Los fragmentos amplificados
se separaron por electroforesis en gel de
agarosa al 1,5% en tampón TBE (0,09 M Tris, 0,09 M ácido bórico y 2 mM de EDTA, pH 8,3) durante 90 minutos
a 90 voltios y se visualizaron con bromuro de etidio
bajo irradiación con luz UV.
Determinación de serotipos. La identificación de los
serotipos de Cryptococcus provenientes de pacientes con
criptococosis se realizó a partir de la amplificación del
gen CAP59 (como ya se detalló) y posterior RFLP con
las enzimas BsmFI (BioLabs Inc®), HpaII (Fermentas®) y
BshTI (Fermentas®), de acuerdo con las indicaciones
dadas por sus fabricantes (3). Los fragmentos digeridos
se separaron por electroforesis en gel de agarosa en tampón
TBE a 90 voltios durante 2 horas y se visualizaron
con bromuro de etidio bajo irradiación con luz UV.
Este estudio demostró que las diluciones correspondientes
a una opacidad igual al tubo 1, 2 ó 3 de la escala
de Mc Farland de las diferentes cepas de referencia de
C. neoformans var. grubii, C. neoformans var. neoformans y C. gattii serotipos B y C con los cebadores correspondientes,
permitieron la amplificación del gen CAP59 directamente
a partir del cultivo, y como se esperaba, se
obtuvo un producto de amplificación de un tamaño aproximado
de 370 pb (3) (Figura 1). La PCR a partir de los
aislamientos clínicos de C. neoformans resultó positiva
para el gen CAP59 en el 100% de los casos. En la Figura
2 se observan los productos amplificados mediante PCR
del gen CAP59 en 9 de los 20 aislamientos estudiados.
En la Figura 3 se observa el patrón de RFLP que se obtuvo
con la enzima BsmFI; se aprecia un sitio de restricción
de aproximadamente 200 pb en 8 de los 19 aislamientos
que se identificaron como C. neoformans var.
grubii (serotipo A). El aislamiento que no presentó sitio
de restricción (Figura 3) fue posteriormente identificado
como C. gattii serotipo B, al presentar un corte con la
enzima BshTI (dato no mostrado).
Figura 1. Productos de la amplificación del gen CAP59 en C. neoformans y C. gattii. Calles 2, 3, 4 y 5:
C. neoformans var. grubii; calles 6, 7, 8 y 9: C. gattii serotipo B; calles 10, 11, 12 y 13: C. gattii serotipo
C; calles 14, 15, 16 y 17: C. neoformans var. neoformans. En todos los casos se partió de suspensiones
celulares con opacidad correspondiente al tubo 0,5; 1; 2 y 3 de la escala de Mc Farland, respectivamente.
Calle 18: control negativo; calles 1 y 19: marcador de peso molecular de 100 pb.
Figura 2. Productos de la amplificación del gen CAP59 en aislamientos
de C. neoformans provenientes de pacientes con diagnóstico
de criptococosis. La amplificación se realizó a partir de
suspensiones celulares con opacidad igual al tubo 2 de la escala
Mc Farland. Calle 1: marcador de peso molecular de 50 pb;
calles 2-7: aislamientos de Cryptococcus obtenidos de líquido
cefalorraquídeo; calles 8-10: aislamientos de Cryptococcus obtenidos
de hemocultivos; calle 11: control negativo.
Figura 3. Amplificación del gen CAP59 a partir de suspensiones
celulares con opacidad igual al tubo 2 de la escala Mc Farland
de cultivos de Cryptococcus recuperados de pacientes, y posterior
RFLP con la enzima BsmFI. Calle 1: marcador de peso
molecular de 50 pb; calle 2: no existió para ese aislamiento,
proveniente de líquido cefalorraquídeo (LCR), sitio de restricción
de la enzima; calles 3-10: fragmentos de la restricción
enzimática de 200 bp obtenidos a partir de aislamientos recuperados
de hemocultivos y de LCR correspondientes al serotipo
A de C. neoformans var. grubii.
La extracción de ADN es un paso esencial para el
análisis molecular de especies fúngicas. Está ampliamente
aceptado que la extracción de ADN puro y de elevado
peso molecular a partir de la célula fúngica es dificultosa
debido a la característica de su pared. En Cryptococcus,
además de la pared celular, la presencia de la cápsula
podría dificultar aún mucho más la extracción del material
genético. Sin embargo, nosotros desarrollamos y
estandarizamos este método sensible, rápido y simple
para amplificar ADN a partir de C. neoformans y C. gattii,
en donde las células de levaduras no requieren un
precultivo en medio líquido, no es necesario usar solventes
orgánicos potencialmente tóxicos (como el fenol, el
alcohol isoamílico o el cloroformo) ni tampoco procedimientos
de ruptura mecánica o enzimática de la pared (13), ya que el ADN se obtiene a partir de una suspensión de
levaduras en el mismo proceso de amplificación de la
PCR; en este caso, para el gen CAP59. Este método
también nos permitió la amplificación de la región rADN
a partir de una suspensión de la levadura de Cryptococcus con opacidad igual al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland
(resultados no mostrados). La omisión de los procedimientos
de extracción y purificación del ADN disminuyen
significativamente el tiempo necesario para hacer una
identificación mediante PCR. Como limitación a esta metodología
podemos mencionar la imposibilidad de disponer
de stock de ADN para estudios posteriores.
La amplificación del gen CAP59 y el posterior análisis
mediante la técnica de RFLP con diferentes enzimas de
restricción permitió la determinación molecular de los
serotipos de C. neoformans y C. gattii (3). Esto representa
una alternativa de análisis molecular importante debido a
que, si bien la serotipificación de los aislamientos de C.
neoformans por métodos inmunológicos fue el método de
diferenciación más difundido y aceptado por los laboratorios
de microbiología, actualmente no se realiza, ya que
depende de los reactivos comerciales (que no están fácilmente
disponibles), de la presencia de la cápsula en la
levadura y de la estabilidad del polisacárido capsular (2).
Así, para la definición de los serotipos de C. neoformans y
C. gattii, las técnicas moleculares mediante el análisis de ácidos nucleicos son más adecuadas, pues usan como
blanco el ADN en lugar de un carácter expresado (producción
de cápsula). En este contexto, los métodos que
permitan una extracción sencilla, fácil y económica resultan
de utilidad para posteriores estudios taxonómicos en
laboratorios que tengan implementadas herramientas de
biología molecular.
Agradecimientos: este trabajo fue realizado con el subsidio M - 426 de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad de Buenos Aires.
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Recibido: 08/09/09
Aceptado: 12/01/10