MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Optimización del procesamiento y la conservación de muestras clínicas destinadas al diagnóstico molecular de coqueluche
L. Pianciola1 *, M. Mazzeo1, D. Flores2, D. Hozbor2
1Laboratorio Central, Subsecretaría de Salud de Neuquén. Gregorio Martínez 65, Neuquén;
2Instituto de Biotecnología y Biología
Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. CCT La Plata CONICET.
Calles 49 y 115 (1900) La Plata. Argentina.
*Correspondencia: luispianciola@yahoo.com.ar
RESUMEN
Coqueluche o pertussis es una infección respiratoria aguda, muy contagiosa y particularmente grave en menores de un año. En la enfermedad clásica, el diagnóstico clínico puede realizarse sin dificultad. En otros casos se requiere la confirmación por el laboratorio. Los métodos usados son el cultivo, la serología y la PCR. Para esta última, la muestra de elección es el aspirado nasofaríngeo y la metodología más sencilla de procesamiento utiliza proteinasa K. Aunque por lo general los resultados son satisfactorios, frecuentemente se presentan dificultades relacionadas con la naturaleza mucosa de los especímenes. Por otra parte, existen incertidumbres respecto de las condiciones óptimas de conservación de las muestras. En el presente estudio se evaluaron distintas técnicas de procesamiento y diversas condiciones de conservación de los materiales. Los resultados obtenidos permitieron seleccionar un método que optimiza el procesamiento de estas muestras, con un desempeño comparable al de los métodos comerciales y costos muy inferiores. Asimismo, las experiencias diseñadas para evaluar la conservación de las muestras nos permitieron elaborar una serie de recomendaciones, que pueden resultar muy valiosas cuando se debe guiar la derivación desde los lugares donde se atienden los pacientes hasta los centros donde se realizan las determinaciones basadas en metodologías moleculares.
Palabras clave: Coqueluche; Extracción de ADN; PCR
ABSTRACT
Optimization of processing and storage of clinical samples to be used for the molecular diagnosis of pertussis. Pertussis or whooping cough is an acute, highly contagious respiratory infection, which is particularly severe in infants under one year old. In classic disease, clinical diagnosis may present no difficulties. In other cases, it requires laboratory confirmation. Generally used methods are: culture, serology and PCR. For the latter, the sample of choice is a nasopharyngeal aspirate, and the simplest method for processing these samples uses proteinase K. Although results are generally satisfactory, difficulties often arise regarding the mucosal nature of the specimens. Moreover, uncertainties exist regarding the optimal conditions for sample storage. This study evaluated various technologies for processing and storing samples. Results enabled us to select a method for optimizing sample processing, with performance comparable to commercial methods and far lower costs. The experiments designed to assess the conservation of samples enabled us to obtain valuable information to guide the referral of samples from patient care centres to laboratories where such samples are processed by molecular methods.
Key words: Pertussis; DNA extraction; PCR
Coqueluche o pertussis es el nombre que recibe una
infección respiratoria aguda, muy contagiosa y particularmente
grave en menores de un año, que luego de más
de 60 años de vacunación aún produce en el mundo 30
millones de casos por año, con más de 300 000 muertes
(3, 12). Bordetella pertussis es el agente etiológico principal
de la patología. Bordetella parapertussis también
causa la enfermedad, aunque con menor frecuencia y,
generalmente, produce cuadros más leves (1). La enfermedad
continúa siendo un problema para la salud pública,
a pesar de décadas de coberturas vacunales adecuadas
(8). En los últimos 20 años, junto con un aumento
del número de casos, se produjo un corrimiento de éstos hacia el grupo etario de los adolescentes y los adultos,
quienes son considerados el reservorio actual de la
enfermedad (11).
En la enfermedad clásica, el diagnóstico clínico puede
realizarse sin dificultad frente a la presencia de tos
paroxística seguida de vómitos, estridor inspiratorio,
marcada linfocitosis y ausencia de fiebre. En cambio, en
aquellos casos en los que la clínica dista de la presentación
clásica, como ocurre en pacientes adultos, en
lactantes o en aquellos individuos con historia vacunal
previa, se requiere de confirmación mediante técnicas
de laboratorio (14). El análisis en el laboratorio también
es requerido para el diagnóstico etiológico diferencial entre B. pertussis y B. parapertussis (1) y para identificar
otros agentes infecciosos que pueden causar síntomas
similares (15). La técnica microbiológica que implica el
aislamiento del agente causal es una metodología altamente
específica y se considera el "estándar de oro"; sin
embargo, su sensibilidad es baja. La serología es más
sensible, pero el formato que se emplea en la actualidad
en nuestro país requiere de dos muestras de suero, una
de las cuales corresponde a la fase convaleciente de la
enfermedad, lo que hace que esta metodología redunde
en un diagnóstico tardío y, por consiguiente, de escasa
utilidad clínica (10).
En relación con los métodos moleculares, se recomienda
la PCR en tiempo real, ya que es más sensible y
específica. Ésta presenta el inconveniente de su mayor
costo respecto del formato convencional de PCR, que es
el usado en nuestro medio. Si se opta por esta última
metodología, es importante guiarse por el algoritmo que
exige confirmación de los resultados positivos mediante
ensayos independientes. El uso de las técnicas de amplificación,
en cualquiera de los formatos antes descritos,
ha permitido disminuir los tiempos de obtención de
resultados de días a horas y ha incrementado la sensibilidad
del método considerado el estándar de oro (cultivo)
en casi un 40%, con una especificidad estimada del 97
al 98% respecto del cultivo. Estas ventajas han motivado
su uso masivo.
Tanto para las metodologías moleculares como para
el diagnóstico microbiológico, la muestra de elección es
el aspirado nasofaríngeo y, como una alternativa, especialmente
en adolescentes y adultos, el hisopado
nasofaríngeo. El procedimiento más sencillo propuesto
para la extracción de ADN a partir de estas muestras es
su tratamiento con proteinasa K (7). Si bien los resultados
obtenidos con esta metodología son satisfactorios,
a menudo se presentan dificultades relacionadas con la
naturaleza mucosa de las muestras. Esto trae aparejado
la necesidad de realizar repeticiones del análisis (que en
nuestra experiencia suele comprender el 30% del total
de muestras recibidas), para poder interpretar adecuadamente
el resultado. Estos inconvenientes deslucen las
ventajas de la metodología, además de aumentar los
costos.
El objetivo de este trabajo fue optimizar el procesamiento
de las muestras destinadas al diagnóstico
molecular de coqueluche y evaluar las condiciones óptimas
de conservación y derivación de estos materiales,
aspectos que son fundamentales en una región como la
nuestra, en la que las distancias a los centros de complejidad,
donde son procesadas, son grandes.
Para la primera etapa del trabajo, que tuvo por finalidad
lograr una mejor calidad de la muestra utilizada para
el diagnóstico molecular de coqueluche, se seleccionaron
de la bibliografía y analizaron distintos métodos de
preparación de muestras para especímenes respiratorios
(Tabla 1). Para la segunda parte se determinaron
las temperaturas más adecuadas para conservar las
muestras y el período máximo en el que no se observa
deterioro del material. También se determinó si el procesamiento
de las muestras antes de su derivación permitiría
prolongar el período máximo de conservación.
Tabla 1. Descripción de los métodos de procesamiento de muestras nasofaríngeas destinadas al diagnóstico molecular de
coqueluche
(1) ANF: aspirado nasofaríngeo.
En relación con el primer objetivo, se analizaron comparativamente
las metodologías de obtención de ADN
descritas en la Tabla 1 y algunas de sus variantes. Como
material de partida se empleó un pool de 10 muestras de
aspirado nasofaríngeo con resultado negativo por la
metodología convencional y que habían sido conservadas
en congelador a - 80 °C hasta su utilización. Dicho
pool fue contaminado con una suspensión de B. pertussis cepa Tohama (CIP 8132), cedida por el Laboratorio Nacional
de Referencia. La suspensión de B. pertussis se
preparó a partir del desarrollo bacteriano obtenido en placas
de agar Bordet Gengou (Difco, Sparks, MD, EE. UU.)
suplementado con sangre de carnero al 15%, luego de
72 horas de incubación a 37 °C y de un repique posterior
de 24 h en el mismo medio y condiciones de incubación.
La suspensión bacteriana se preparó de forma de obtener
una concentración final de B. pertussis de 103 UFC/ml en el pool de aspirados nasofaríngeos. Sobre las
muestras así preparadas se aplicaron las distintas
metodologías para la extracción del ADN (Tabla 1). El
ADN molde obtenido en cada caso fue utilizado en la
reacción de PCR convencional, que emplea los cebadores
que hibridan con la secuencia promotora de la toxina
pertussis y que genera como producto de la reacción
una secuencia de 191 pb (8). Como control positivo se
usó una suspensión de B. pertussis cepa Tohama calentada
10 min en baño a 100 °C y centrifugada a 8 000 x g
durante 5 minutos. Para evaluar los distintos métodos,
se analizaron y compararon los límites de detección de
cada uno de ellos. Como puede observarse en la Figura
1, los métodos 1, 2 y 4, que no utilizan agentes
mucolíticos, no permitieron una buena resolución de bandas.
Recién al diluir las muestras 1:10, fue posible vislumbrar
la banda esperada. También puede observarse
que el método 2 resulta menos sensible que el método
1. Los métodos 3A (calles 5 y 6), 3B (calles 7 y 8) y 5
(calles 12 y 13) arrojaron un resultado similar al método
6 (comercial), utilizado como método de referencia (calles
14 y 15).
Fig. 1. Electroforesis en gel de agarosa 2% (p/v) de los productos
de PCR obtenidos a partir de una muestra clínica de
naturaleza mucosa contaminada con una suspensión
bacteriana de B. pertussis (B. pertussis Tohama 105 UFC/ml).
Calle 1: método 1 sin diluir la muestra, calle 2: método 1 con
muestra diluida 1/10, calle 3: método 2 sin diluir la muestra, calle
4: método 2 con muestra diluida 1/10, calle 5: método 3A con
muestra sin diluir, calle 6: método 3A con muestra diluida 1/10,
calle 7: método 3B con muestra sin diluir, calle 8: método 3B con
muestra diluida 1/10, calle 10: método 4 con muestra sin diluir,
calle 11: método 4 con muestra diluida 1/10, calle 12: método 5
con muestra sin diluir, calle 13: método 5 con muestra diluida 1/10, calle 14: método 6 con muestra sin diluir, calle 15: método 6
con muestra diluida 1/10. Como control de la reacción se empleó el material obtenido de la lisis de una suspensión bacteriana de
B. pertussis (calle 9) y como control negativo agua (calle 16).
Para la visualización se empleó bromuro de etidio a 0,5 mg/ml.
Para investigar si la extracción con fenol/cloroformo y
posterior precipitación con alcohol incrementaba la sensibilidad,
se compararon los métodos 3A y 3B entre sí.
Los dos métodos ensayados brindaron resultados similares,
ya que dieron un resultado positivo hasta una concentración
de bacterias en la muestra de 1,6 x 102 UFC/ml. Dado que el método 3B es mucho más laborioso,
más caro y presenta mayores posibilidades de introducir
contaminaciones por incluir más pasos, se descartó su
utilización.
Al comparar los métodos 3 y 5 se observó que el método
5, que introduce la utilización de CHELEX®, permitió detectar hasta una dilución más de la muestra (1,6 x
101 UFC/ml), lo que indica mayor sensibilidad en la determinación.
El método 5 finalmente fue comparado con
el empleo de un equipo comercial de extracción y purificación
de ADN (método 6), considerado un método de
alto rendimiento. Ambos métodos mostraron un comportamiento similar, ya que permitieron detectar señal hasta
una dilución 10-5 de la muestra (0,42 UFC/reacción). Este
dato es de gran importancia, ya que el método propuesto
representa un costo inferior (un quinto del valor del
método comercial), lo que lo hace muy aplicable al diagnóstico
de rutina, especialmente cuando se procesa un
número considerable de muestras. Esta metodología
(método 5) plantea, sin embargo, la necesidad de realizar
varias etapas, lo que potencialmente podría introducir
contaminaciones en el proceso. Por esa razón, se
adecuó el método para realizarlo en un solo paso (método
5 modificado). Los resultados alcanzados fueron similares
a los obtenidos originalmente, por lo que se recomienda
realizar la metodología en un solo paso. Este
método de procesamiento está siendo validado en nuestro
laboratorio frente a muestras clínicas. Durante el año
2009 hemos procesado simultáneamente por el método
convencional y por este método un total de 425 muestras.
Los resultados preliminares muestran un desempeño
muy satisfactorio, que disminuye la necesidad de repeticiones,
desde un promedio de 30% de las muestras,
a menos de 5%.
Para evaluar las condiciones de conservación de las
muestras se ensayaron las distintas posibilidades al alcance
de los laboratorios clínicos: temperatura ambiente,
heladera o congelador. Se trabajó con un pool de 10
muestras clínicas adicionado con una suspensión de B.
pertussis cepa Tohama (CIP 8132) con un título de 1,6 x
105 UFC/ml, determinado por recuento en placa (por triplicado).
Una parte de ese pool fue procesada empleando
el método 5 modificado ya descrito, y el material resultante
fue dividido en 15 alícuotas de 10 ml cada una,
las que fueron rotuladas con la letra "P" (muestras procesadas).
Otra porción de la muestra original sin procesar
fue dividida en 15 alícuotas de 100 ml cada una y
fueron rotuladas "NP" (muestras no procesadas). Cinco
tubos rotulados como P y 5 como NP fueron conservados
a temperatura ambiente, otros 5 P y 5 NP se colocaron
en heladera, y finalmente, un número igual de tubos
de P y NP fueron colocados en congelador. Las temperaturas
oscilaron durante los 30 días de la experiencia
entre los 18 y los 24 °C a temperatura ambiente, entre
los 4 y los 6 °C en la heladera, y entre -18,5 y -21,5 °C en
el congelador. De cada una de las condiciones analizadas
se tomaron muestras a las 24 y 72 horas, y a los 7,
14 y 30 días. Las muestras P fueron utilizadas directamente
en las PCR y las NP fueron procesadas por el
método 5 modificado, antes de incluirlas en los ensayos
moleculares. El producto final del procesamiento de los
tubos NP y los tubos P fue diluido en forma seriada abarcando
concentraciones entre 1,6 x 104 y 1,6 x 100 UFC/ml. Se emplearon alícuotas de cada una de las diluciones
como templados en el procedimiento de PCR
estándar de nuestro laboratorio. La experiencia completa
se realizó por triplicado en tres momentos sucesivos,
no superpuestos. Los resultados obtenidos se muestran
en la Tabla 2. Luego de 24 h de conservación, en todas
las muestras se observó el mismo resultado, es decir,
presencia de amplicón hasta la dilución 10-2 (equivalente
a 0,5 UFC/tubo de reacción). La calidad de las muestras
no se vio alterada por haber sido conservadas 24 h bajo
distintas condiciones. Tampoco parece haber influido en
el resultado la preparación previa del material. A las 72
h, en todas las condiciones ensayadas se observó el
mismo resultado: presencia de amplicón hasta la dilución
de 0,5 UFC/tubo de reacción. Sin embargo, es posible
advertir un leve deterioro en las muestras que fueron
conservadas sin procesamiento previo. Ya a los 7 días
se hace evidente el deterioro de las muestras conservadas
sin preparación previa, especialmente las conservadas
a temperatura ambiente y en congelador. En estas
condiciones de conservación, el límite de detección disminuyó en relación con las otras condiciones, puesto que
se observó amplicón sólo hasta diluciones 10-1 de las
muestras (5 UFC/tubo de reacción). Es de destacar los
resultados obtenidos a partir de las muestras procesadas:
si las muestras se conservan procesadas por el
método 5 modificado, los resultados que se obtienen son
similares a los de las 24 h, con un límite de detección de
0,5 UFC/tubo de reacción. Asimismo, las muestras no
procesadas parecen no continuar deteriorándose más
allá de los 7 días, ya que a los 14 días se observan los
mismos resultados que los alcanzados luego de 7 días
de conservación. Respecto de las muestras procesadas,
puede observarse un deterioro en las muestras conservadas
a temperatura ambiente, en las cuales la positividad
desciende a diluciones de 10-1 (5 UFC/tubo de reacción).
Las otras condiciones de conservación siguen rindiendo
un límite de detección de 0,5 UFC/tubo de reacción. Finalmente,
a los 30 días de conservación, el deterioro fue
evidente en las muestras conservadas a temperatura ambiente, tanto en aquellas no procesadas como en las
que habían sido procesadas con anterioridad. Las muestras
conservadas en heladera se mantuvieron adecuadamente,
tanto las que fueron procesadas como las que
no lo fueron. Las muestras conservadas en congelador
durante 30 días no mostraron variación respecto de lo
observado a los 14 días, aunque fue evidente que las
muestras se conservaron mejor en heladera, tanto cuando
fueron procesadas como cuando no lo fueron.
Tabla 2. Evaluación de la estabilidad de las muestras clínicas empleadas para
PCR frente a distintas condiciones ambientales de conservación
(1)NP: muestras clínicas conservadas sin ningún tratamiento previo; (2)P: muestras clínicas conservadas
luego de ser procesadas por el método 5 modificado.
En resumen, las muestras no procesadas se deterioran
en mayor medida que las procesadas cuando la conservación
se hace a temperatura ambiente o en congelador.
La conservación en heladera se muestra como la
condición más adecuada, tanto para las muestras procesadas
como para las no procesadas, aun durante períodos
prolongados de conservación.
Teniendo en cuenta estos resultados, y que el procesamiento
previo de las muestras en los laboratorios de
baja complejidad puede significar una sobrecarga de difícil
manejo, recomendamos que las muestras clínicas
para el diagnóstico molecular de coqueluche sean refrigeradas
en heladera desde el momento de su obtención,
y que se deriven refrigeradas. No es necesario ningún
procesamiento previo a la derivación. Si por cualquier
razón de fuerza mayor fuera necesaria una conservación
prolongada de la muestra, ésta deberá realizarse
en heladera. Sin embargo, para el diagnóstico oportuno,
se recomienda no sobrepasar las 72 horas desde la obtención
de la muestra hasta el arribo de ésta al laboratorio
de referencia.
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Recibido: 6/10/09
Aceptado: 3/3/10