MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL
La textura del suelo como factor regulador de la adsorción de Escherichia coli en una cuenca de la Pampa Ondulada (Argentina)
Filipe Behrends Kraemer1*, Celio I. Chagas1, Diego J. Cosentino2, Marta Paz3, Juan A. Moretton3
1Cátedra de Manejo y Conservación de Suelos y
2Cátedra de Edafología, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires. Av. San Martín 4453, (1417) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina;
3Cátedra de Higiene y Seguridad,
Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. Junín 954, (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: filipebk@agro.uba.ar
RESUMEN
El aumento de la carga animal vacuna en la Pampa Ondulada asociado a áreas frágiles supone un importante riesgo de contaminación biológica. Dicha contaminación está regulada por variables edáficas, como la textura, que controlan el transporte de contaminantes biológicos hacia los cuerpos de agua. En el presente trabajo se correlacionó la adsorción bacteriana del suelo con distintos tamaños de partículas individuales correspondientes a 27 suelos provenientes de una cuenca de la Pampa Ondulada. Para ello se utilizó una técnica de centrifugación lenta. Los valores de adsorción bacteriana, empleando en la determinación Escherichia coli ATCC 8739, variaron entre 25,3% y 73,3%, y el tamaño de partícula que mejor se correlacionó con esta propiedad fue el correspondiente a la fracción de arcillas (R2 = 0,6). Esta correlación mejoró al considerar conjuntamente a todas las partículas menores de 3 μm (R2 = 0,64), lo que resalta la capacidad de los limos muy finos en el fenómeno de adsorción. La curva de ajuste elaborada con los datos experimentales se comparó con la obtenida de acuerdo con el modelo propuesto por Ling et al. (2002). Se encontraron similitudes en la pendiente, no así en la ordenada al origen. Esta diferencia desapareció al emplear en la determinación una cepa autóctona aislada de deyecciones animales provenientes de la cuenca estudiada, dado que dicha cepa evidenció una adsorción 48% superior a la observada con la cepa de colección.
Palabras clave: Contaminación biológica; Argiudoles; Natracualfes; Cuenca agropecuaria; Calidad de aguas
ABSTRACT
Soil texture as a regulating factor of Escherichia coli adsorption in a Rolling Pampa basin (Argentina). Increase of bovine livestock rates in fragile areas of the Rolling Pampa entails a high risk of biological contamination. This biological contamination is regulated by edaphic variables such as texture, which control biological contaminants transport towards water bodies. In this work bacterial adsorption was correlated with individual particle sizes in 27 soils of a typical basin of the Rolling Pampa with slow centrifugation techniques. Bacterial adsorption values, using E. coli (ATCC 8739), ranged between 25.3 and 73.3% and significant correlation (R2 = 0.6) was found between bacterial adsorption and clay content. This correlation was improved when particles smaller than 3 μm were considered (R2 = 0.64) highlighting the capacity of very fine silt in adsorption mechanisms. Data obtained were compared with those proposed by Ling et al. (2002), finding similar slope but different intercept. This difference disappeared when a wild strain, isolated from bovine manures present in the basin, was used, since a bacterial adsorption increase of 48% was found.
Key words: Biological contamination; Argiudolls; Natraqualfs; Agricultural basin; Water quality
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas se produjo una importante concentración de la ganadería en la región pampeana, debido a la expansión agrícola y a la aparición de feed-lots. Esta circunstancia, sumada a la fragilidad de los suelos de la región, incrementó la degradación física edáfica y la contaminación química y biológica del sistema
hídrico (4). Según Tian et al. (30), las prácticas de pastoreo pueden contribuir de forma determinante a la contaminación biológica de las cuencas agropecuarias. Cabe señalar que en la Pampa Ondulada, los animales en pastoreo tienen acceso directo a los cursos de agua y a sus cárcavas asociadas. La información disponible indica que los problemas de contaminación de los cursos de agua generalmente están asociados con el aumento de la producción de sedimentos y de la concentración de bacterias fecales en aguas de escurrimiento (18,24,27). Esto podría resultar peligroso, tanto para los animales como para el ser humano (22).
Actualmente se han intensificado a nivel nacional e internacional los estudios de las variables que vinculan la dinámica de contaminantes biológicos con los suelos y sedimentos (4, 25, 30). Diversos estudios muestran cómo inciden en la supervivencia y en el transporte bacteriano el grado de asociación entre las bacterias entéricas y el suelo (o sedimentos) (17, 30). Jamieson et al. (9) destacan
que esta asociación modifica la supervivencia y el transporte bacteriano hacia los cuerpos de agua, al establecerse
numerosas y complejas interacciones entre los suelos y los microorganismos. La cuantificación de esta asociación tiene aplicaciones directas en el tratamiento de desechos, en el manejo de suelos contaminados y en la generación de modelos de contaminación de aguas de áreas agrícolas y ganaderas (16). El índice más comúnmente
utilizado para cuantificar la asociación entre el suelo y los microorganismos es el porcentaje de adsorción.
Aunque en la década pasada se efectuaron muchos estudios de adsorción bacteriana a distintos medios sólidos, la información respecto de las bacterias fecales en los suelos todavía es muy limitada. Esta propiedad está afectada por numerosos factores tanto físicos como biológicos, en donde el tipo de suelo puede influir debido a diferencias en las propiedades de adsorción relativas al material edáfico (26). En este sentido, la textura del suelo es clave en la comprensión de este fenómeno, ya que puede regular la adsorción y la distribución de los microorganismos en dicho medio (2, 9). Ling et al. (16) usaron modelos matemáticos con la concentración de arcilla como única variable explicativa de la adsorción bacteriana de una cepa de E. coli autóctona, dentro de un rango de pH de 4,9 a 7,5.
Si bien se considera que las arcillas son las principales responsables de la capacidad de adsorción bacteriana que presentan los suelos, no debe olvidarse la diversidad
de compuestos minerales y orgánicos que podrían contener otras fracciones, como el limo y la arena. Para el caso particular de los limos finos, se ha documentado la presencia de un importante porcentaje de fitolitos en dicha fracción edáfica de la Pampa Ondulada (6), los que podrían incidir sobre esta propiedad biológica. Por otro lado, en la citada región se han realizado estudios sobre la existencia de fenómenos electrostáticos en ese mismo tamaño de partículas, principalmente evidenciados por la aparición de sitios de intercambio catiónico que favorecerían los procesos de adsorción bacteriana (19).
También existe evidencia de que la adsorción es dependiente de la cepa bacteriana utilizada para evaluar
este parámetro (20). El tipo de célula presente y sus características (p. ej., tamaño, forma, presencia de polisacáridos) puede modificar el balance de las fuerzas electrostáticas y la fuerza de colisión, entre otros mecanismos,
por lo que variarán las resultantes de adsorción (17). A partir de los elementos señalados, surge como interrogante la validez de la extrapolación de las funciones presentadas por Ling et al. (16) en suelos de la Pampa Ondulada.
Por lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue cuantificar
la relación que existe entre la textura y la capacidad de adsorción de dos cepas de E. coli (cepa de colección vs. cepa autóctona) en suelos Argiudoles y Natracualfes pertenecientes a una cuenca representativa de la Pampa Ondulada (Argentina). Además, se evaluó la validez de la relación entre la adsorción bacteriana y el contenido de arcillas para los suelos de la cuenca en estudio (16).
MATERIALES Y MÉTODOS
Caracterización de los sitios estudiados y estrategias de muestreo
Se muestrearon 27 sitios diferentes de la cuenca del arroyo del Tala, partido de San Pedro, provincia de Buenos Aires (Argentina).
Los sitios corresponden a vaguadas y a cubetas (estas últimas generadas por erosión hídrica) ubicadas en tierras tanto agrícolas (Argiudoles) como ganaderas (Natracualfes) del tercio medio y superior de esta cuenca (Figura 1). Por lo general, dichas áreas forman parte de ambientes en donde se han acumulado sedimentos originados por erosión hídrica provenientes de áreas más elevadas. Las muestras del tercio medio de la cuenca corresponden al campo "Los Patricios" (FAUBA), mientras que las del tercio superior fueron tomadas de tres establecimientos ubicados en Colonia Velaz, partido de San Pedro. De cada sitio se obtuvo una muestra de suelo compuesta por submuestras extraídas a los 0-50 mm de profundidad.
Luego de homogeneizarlas, se procedió a tamizarlas por 2 mm y a determinar el pH (1:2,5 sólido: agua) mediante potenciómetro, y de carbono orgánico (CO) por el método de Walkley y Black (31). Para determinar el porcentaje de sodio intercambiable (PSI), se estableció el contenido de Na en el complejo
de intercambio del suelo (extracción con acetato de amonio 1 N y fotometría de llama) (23) y la capacidad de intercambio catiónico (extracción con cloruro de potasio) (13). La distribución de tamaño de partículas elementales se analizó por el método de la pipeta de Robinson (29); se determinaron las siguientes fracciones:< 2 μm (arcillas); 2-3 μm (limos muy finos); 3-20 μm (limos finos); 20-50 μm (limos gruesos); > 50 μm (arenas). Este método está basado en la velocidad diferencial de sedimentación de partículas en medios líquidos (ley de Stokes).
Figura 1. Localización geográfica de los suelos evaluados.
Cuantificación de la adsorción de los microorganismos a los suelos
Para realizar las determinaciones de la adsorción bacteriana a los suelos, las muestras previamente tamizadas fueron esterilizadas
en el reactor de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA) mediante la aplicación de una dosis mínima y altamente uniforme de radiación ionizante equivalente a 25 kGy, con el fin de no provocar cambios en la estructura de las partículas intervinientes.
De esta forma se evitó emplear altas temperaturas, las que podrían desnaturalizar la materia orgánica. Además, no se usaron biocidas químicos, los que por su residualidad podrían afectar a los microorganismos inoculados a posteriori. La efectividad de esta técnica de esterilización fue comprobada en trabajos anteriores (4, 14).
Para la realización de los ensayos biológicos se utilizaron una cepa de colección, E. coli ATCC 8739, y una cepa de E. coli autóctona, aislada de una zona ganadera del tercio medio de la cuenca en estudio. La cepa aislada fue identificada con la utilización de un medio de cultivo cromogénico (CHROMOBRIT, Britania). Este medio, específico para E. coli, basa su acción en la detección de la actividad ß-D- glucuronidasa. Los inóculos de cada cepa se prepararon a partir de cultivos de 24 horas en medio agar triptosa soja (Biokar Diagnostics). Las muestras de suelo se inocularon con una suspensión bacteriana de 1×107 UFC/ml, que representa una concentración máxima de microorganismos
en escurrimientos sobre materia fecal, usualmente citada en la bibliografía (8, 21). La concentración fue ajustada a ese valor mediante una curva patrón de absorbancia a 600 nm confeccionada para tal fin. Ambas cepas bacterianas fueron
fotografiadas con un fotomicroscopio Carl Zeiss Aixiolab MC80DX (1000X).
La metodología utilizada para la medición de la adsorción bacteriana fue la propuesta por Ling et al. (16), con algunas modificaciones. Alícuotas de 6 g de suelo fueron inoculadas con 6 ml de la suspensión bacteriana. Luego se agitó manualmente la suspensión durante 1 min y se la dejó en reposo durante 5 min. Este período de reposo es suficiente para que se establezca una asociación reversible entre las bacterias y el suelo (16). Dada la similitud de tamaños entre las bacterias (0,2-1,3 μm) y las partículas de arcilla (< 2 μm) y la gran diferencia entre sus densidades
(1,1 g/cm3 y 2,6 g/cm3, respectivamente) (33), se decidió separarlas por centrifugación poniendo como límite entre ambas un diámetro de 1 μm (32). La energía para dicha separación fue de 50 G, calculada a partir de la fórmula de sedimentación en centrífugas (10), la cual está basada en la ley de Stokes.
Esta energía se tuvo que modificar en 2 de las 27 muestras, dado que su densidad real se alejaba significativamente del valor utilizado para los cálculos de la energía a emplear (2,65 g/cm3), por lo que se debió aumentar el tiempo de centrifugación. La pureza de las fracciones separadas fue corroborada por microscopía óptica (fotomicroscopio Wild MZ8 Leica). El sobrenadante de cada muestra fue incubado a 36 °C durante 24 h en el medio agar rojo bilis (Britania) para el posterior recuento de colonias (1). Las determinaciones se realizaron por triplicado.
La proporción de bacterias adheridas al suelo (porcentaje de adsorción) se calculó como:
Ads (%) = (Nt - Ns) / Nt x 100
siendo Nt = número total de bacterias adicionadas al suelo (UFC/ml) y Ns = número total de bacterias en el sobrenadante (UFC/ml).
Se compararon los datos observados con aquellos predichos por la ecuación formulada por Ling et al. (16): Adsorción = 50,5 Ln (arcilla) - 102,2 (R2 = 0,89)
Métodos estadísticos
Se llevaron a cabo análisis de regresión lineal y múltiple sucesivos entre los valores de adsorción bacteriana (variable dependiente) y la textura (variable independiente) (23). Además, se evaluó el comportamiento de la adsorción bacteriana en relación con las arcillas, según lo propuesto por Ling et al. (16), y los porcentajes de adsorción bacteriana a partículas < 2 μm y < 3 μm obtenidos experimentalmente. Para ello se realizaron análisis de regresión lineal con variables categóricas probando las diferencias entre las pendientes y las ordenadas al origen mediante ANOVA (Tukey, alfa = 0,05). En todos los casos se cumplieron los supuestos de independencia y homogeneidad de varianzas. Todos los análisis estadísticos fueron realizados mediante el programa Infostat/P v1.1 (10).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los suelos evaluados presentaron una gran variabilidad en el contenido de CO (0,6 a 5,1 %), asimismo el pH osciló entre 5,3 y 9,3 y la fracción de arcillas varió entre 23 % y 52,5 %, con un predominio importante de la fracción limos finos y gruesos (Tabla 1). Esta considerable variabilidad en las propiedades estudiadas permitió abarcar un amplio espectro de condiciones edáficas, que pueden hallarse en la cuenca bajo estudio. En cuanto al CO, no se encontraron diferencias significativas entre suelos, los Argiudoles presentaron valores promedios de 2,23 % y los Natracualfes de 2,88 %. Los Argiudoles presentaron una media de pH de 5,97, que resultó en una diferencia significativa (p < 0,001) en comparación con los Natracualfes, cuya media de pH fue de 7,41. El PSI mostró diferencias significativas entre ambos suelos (p < 0,001), con valores de 1,7 % en los Argiudoles y 8,8 % en los Natracualfes. Si bien estas diferencias de pH y PSI entre ambos suelos modificarían la adsorción bacteriana y actuarían como covariables de la relación entre la textura y la adsorción bacteriana, dichos efectos presentaron una misma tendencia en ambos tipos de suelos (11). Por ello, el análisis de la regulación de la adsorción bacteriana por parte de la textura se pudo analizar de forma conjunta para estos suelos.
Tabla 1. Características físicas y químicas de los suelos estudiados.
Los valores de adsorción bacteriana correspondientes a los 27 suelos estudiados variaron en el rango de 25,3 % a 73,3 %, con un promedio de 64,4 % para los Argiudoles y de 48,8 % para los Natracualfes. La adsorción de los Argiudoles resultó baja en comparación con lo reportado por Ling et al. (16), teniendo en cuenta que dichos autores obtuvieron una adsorción bacteriana de más del 90 % en suelos semejantes a los de la cuenca del arroyo del Tala. A su vez, Oliver et al. (21) midieron un 35 % de adsorción bacteriana en un suelo franco arcilloso, mientras que Characklis et al.(5) encontraron que un 20 % a un 35 % de E. coli estuvo asociado con agregados sedimentables, al evaluarlo mediante técnicas de centrifugación.
La adsorción bacteriana se asoció significativamente con algunos tamaños de fracciones edáficas. En la Tabla 2 se muestran los coeficientes de determinación y los correspondientes modelos de regresión lineal ajustados
entre los valores de adsorción bacteriana (variable dependiente) y las diferentes fracciones de partículas elementales de los suelos estudiados (variable independiente).
El porcentaje de arcilla fue la variable que mejor se correlacionó con la adsorción bacteriana; se observó una pendiente positiva y un coeficiente de determinación R2 = 0,6 (p < 0,001) (Tabla 2, parte a). Otros investigadores
como Gromyko et al. (7) encontraron una tendencia similar. Sin embargo, algunos autores como Guber et al. (8) no encontraron relaciones significativas con la fracción arcilla, hecho posiblemente relacionado con el estrecho rango de arcillas utilizado en el citado estudio.
Tabla 2. Relaciones entre la adsorción bacteriana y la textura edáfica. a) Adsorción bacteriana en función de la distribución unitaria de partículas elementales; b) Adsorción bacteriana en función de la distribución acumulada de partículas elementales.
En la Tabla 2 se observa que también existió una relación
positiva de la adsorción bacteriana con la fracción limo muy fino y limo fino, aunque en estos casos no hubo significancia estadística. Por otro lado, las fracciones de limo grueso y de arena presentaron ambas pendientes de signo negativo y alta significancia estadística (p < 0,001).
Al considerar en forma conjunta a todas las partículas < 3 μm (Tabla 2, parte b), el coeficiente de determinación aumentó 7 % respecto de la regresión ajustada exclusivamente
con la fracción arcilla (< 2 μm), y se obtuvo la siguiente ecuación: y = 1,11x + 12,05 (R2 = 0,64). Dicho ajuste se vio disminuido al intentar relacionar la adsorción bacteriana con un rango aún más amplio de partículas elementales, en este caso inferiores a 20 μm. La afinidad
diferencial de los microorganismos por las arcillas y limos muy finos podría deberse a la elevada superficie específica y la alta densidad de cargas que caracterizan a estas fracciones. Como se mencionó anteriormente, es probable que en el rango de limos muy finos y finos existan fenómenos de aparición de cargas superficiales (capacidad de intercambio catiónico - CIC) y estructuras del tipo de fitolitos, lo que incrementa la posibilidad de captación
y atrapamiento de los microorganismos. Además, la presencia de partículas pequeñas en el medio líquido aumentaría
la probabilidad de colisión de microorganismos con el medio sólido y ello incrementaría su interacción a través de fenómenos electrostáticos entre las cargas superficiales
de estas partículas y las entidades biológicas.
Comparación de modelos de edafotransferencia de la adsorción bacteriana
Los valores de adsorción obtenidos cuando se utilizó la cepa de colección fueron comparados con los calculados
a partir de un modelo planteado por Ling et al. (16). Como se observa en la Figura 2, la curva confeccionada con datos propios mostró una tendencia muy similar a la predicha por el modelo. Aplicando logaritmos sobre los datos propios y ajustando luego un modelo de regresión lineal, no se hallaron diferencias significativas entre las pendientes de ambas ecuaciones (p < 0,57), aunque éstas
presentaron distinta ordenada al origen (p < 0,0063). Los mismos resultados se observaron al incluir los limos muy finos (< 3 μm). Este comportamiento es esperable teniendo en cuenta que en los ensayos de Weaver et al. (32) y de Ling et al. (16) se utilizaron bacterias autóctonas,
mientras que en este trabajo se utilizó una bacteria alóctona. Cuando se repitieron algunos de los ensayos utilizando una cepa autóctona en cuatro suelos incluidos en la Tabla 1 con contenidos de arcilla contrastantes, los valores observados prácticamente coincidieron con 0,001 los simulados (Figura 3). La cepa autóctona presentó un promedio de adsorción a los sólidos un 48 % superior a la cepa de colección, con lo que se desestimó la posibilidad de interacciones con las propiedades físicas y químicas de dichos suelos. Muirhead et al. (20) informaron resultados similares, ya que la cepa autóctona de E. coli presentó en el citado trabajo una adsorción del 81 % y la cepa de colección una adsorción de tan sólo 24 %.
Figura 2. Porcentaje de adsorción de E. coli (cepa de colección) en función del contenido de partículas para datos observados y para datos simulados mediante el modelo de Ling et al. (2002) (n = 27).
Figura 3. Adsorción bacteriana en función del porcentaje de arcillas (< 2 µm) para la cepa de E. coli de colección (ATCC 8739) y para la cepa de E. coli autóctona calculada a partir de datos observados y adsorción bacteriana simulada mediante el modelo de Ling et al. (2002) (n = 4).
Una de las causas posibles de esta adsorción diferencial es la existencia de diferencias morfológicas entre las especies y cepas bacterianas, que podrían modificar el balance y la distribución de cargas electrostáticas en la superficie bacteriana. En la Figura 4 se observan fotografías de las bacterias de colección y las bacterias autóctonas utilizadas en el presente ensayo; en ellas se advierten morfologías de cocobacilo y de bacilo, respectivamente. De igual manera, podrían haber influido diferencias en otras propiedades, como la producción de sustancias extracelulares, el estado fisiológico, la hidrofobicidad y la motilidad (3). Debido al comportamiento disímil en cuanto a la adsorción a sólidos que pueden presentar las distintas especies y cepas bacterianas, sería de gran utilidad poder contar con una cepa patrón a fin de estandarizar este tipo de mediciones.
Figura 4. (a) Fotografía de la cepa de E. coli de colección (ATCC 8739). (b) Fotografía de la cepa de E. coli aislada de heces bovinas
encontradas en suelos del establecimiento "Los Patricios", San Pedro, provincia de Buenos Aires.
Implicancias en la contaminación hídrica
Los resultados obtenidos en la cuenca bajo estudio pueden aportar elementos en la evaluación de estrategias de manejo de los rodeos en explotaciones pecuarias extensivas ubicadas en áreas frágiles y cercanas a los principales cursos de agua de dicha cuenca. Esta cuenca ha experimentado recientemente un incremento de su carga animal por el avance de la soja hacia las tierras otrora ganaderas, lo cual podría aumentar el escurrimiento y el transporte de sedimentos y microorganismos a los cursos de agua. En aquellas áreas afectadas por erosión hídrica, la presencia de altos contenidos de arcilla en superficie favorecería las condiciones de adsorción bacteriana,
tanto en los suelos como en los sedimentos allí presentes. Esto aumentaría la supervivencia de diversos microorganismos, entre ellos la de las enterobacterias, en el medio externo al intestino animal, y esto incrementaría
aún más el riesgo de contaminación biológica de los cuerpos de agua aledaños.
Mediante las determinaciones de la adsorción bacteriana
utilizando la cepa autóctona se pudo inferir que los procesos de adsorción en el campo serían de mayor magnitud
comparados con los obtenidos en este trabajo con la cepa alóctona. Sin embargo, esta afirmación debería corroborarse mediante la experimentación con más suelos y mayor número de cepas autóctonas. En conclusión, las relaciones entre la textura y la adsorción bacteriana señaladas
permitirían aportar información básica para elaborar futuros modelos de alerta temprana de contaminación de aguas superficiales en la región bajo estudio.
Agradecimientos: se agradece al Ing. Agr. O. J. Santanatoglia, FAUBA; al Ing. Agr. A. Buján y a la Dra. E. Pawlac, Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA) y al Dr. H. Morrás, Instituto de Suelos,Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA - Castelar). Trabajo realizado dentro del marco de los proyectos de investigación UBACyT G023 y G045.
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Recibido: 12/10/10
Aceptado: 16/03/11