AREA: GENÉTICA Y BIOLOGÍA
Endocria y coancestria en poblaciones naturales de Anadenanthera colubrina var. cebil
Inbreeding and coancestry in natural populations of Anadenanthera colubrina var. cebil
Tamara M. Mazo1, Maria E. Barrandeguy1, 2,3, Maria V. Garcia1, 2, 3,*
1 Facultad de Ciencias Exactas, Quimicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones.
2 Instituto de Biologia Subtropical, Universidad Nacional de Misiones - CONICET.
3 Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas - CONICET
* E-mail: vgarcia@fceqyn.unam.edu.ar
Resumen
La endocria y la coancestria aumentan la homocigosis generando genotipos autocigotas sin afectar a las frecuencias alelicas. Puede considerarse que una muestra de loci selectivamente neutros permite hacer inferencias acerca del coeficiente de endocria de una poblacion porque sus efectos son expresados en todos los loci de cada individuo. Esto permite estudiar la posible presencia de depresion por endocria y su efecto sobre los valores fenotipicos de los caracteres poligenicos inferida desde loci neutrales a traves de la media de un caracter cuantitativo en k subpoblaciones y las estimas del indice de fijacion FITk. Se analizaron individuos adultos de Anadenanthera colubrina var. cebil. Se pudo concluir que los caracteres poligenicos analizados no presentaron reduccion de sus valores fenotipicos medios indicando ausencia de depresion por endocria, las poblaciones presentaron niveles bajos de coancestria y tamanos efectivos elevados en tanto que no se detecto aumento de homocigosis en los caracteres poligenicos analizados.
Palabras clave: Endocria; Coancestria; Tamaño efectivo; Poblaciones naturales; Anadenanthera colubrina var. cebil.
Abstract
Inbreeding and coancestry increase homozygosis and create autozygous genotypes but they do not modify allelic frequencies. Inbreeding coefficient could be estimated by neutral loci because its effects are expressed by all loci in each individual. Putative presence of inbreeding and its effect on phenotypic values of polygenic traits could be studied from neutral loci and the mean of quantitative trait in k subpopulations together to fixation index FITk. Adult individuals of Anadenanthera colubrina var. cebil were analyzed. The conclusions of this study arethat polygenic traits did not show mean reduction in phenotypic values which indicate that there was no inbreeding depression, populations showed low levels of coancestry and high effective sizes.
Keywords: Inbreeding; Coancestry; Effective size; Natural populations; Anadenanthera colubrina var. cebil.
Introduccion
La endocría y la coancestría, junto con la depresión
por endocría, son temas centrales de discusión al momento
de tomar decisiones tendientes a la conservación de las
poblaciones naturales tanto de plantas como de animales,
especialmente cuando el tamaño de las poblaciones se
ve reducido debido a la fragmentación del hábitat [1]. A
medida que las poblaciones reducen su tamaño efectivo
y quedan aisladas tienden a perder diversidad genética
debido a la acción de la deriva genética y de la endocría
[2]. Esta última es resultado del apareamiento entre individuos
emparentados, incluso si el apareamiento es al
azar dentro de subpoblaciones [3], llevando a un aumento
de la homocigosis mediante la aparición de genotipos
autocigotas pero sin afectar a las frecuencias alélicas. La
depresión por endocría surge como un fenómeno dentro
de las poblaciones cuando al incrementarse el nivel de
homocigosis, disminuye el valor fenotípico medio [4].
Es ampliamente aceptado que la depresión por endocría
es una consecuencia inevitable del componente de
dominancia de la varianza genotípica. Cuando la acción
génica es puramente aditiva, el valor fenotípico promedio
asociado con los alelos es independiente del complemento
alélico. Así, la depresión por endocría no ocurre en caracteres
que presenten una base genética puramente aditiva.
Sin embargo, en caracteres que presenten una base genética
con dominancia el valor fenotípico medio varía con el
cambio en las frecuencias genotípicas debido a que la expresión
alélica es una función del complemento alélico [4].
Aunque la depresión por endocría ha sido un tema
central de las investigaciones biológicas por más de un
siglo, poco se sabe de las bases moleculares subyacentes a
este proceso. Dado que muchos caracteres de importancia
ecológica son poligénicos puede esperarse que una gran
proporción del genoma esté involucrada en la depresión
por endocría [2]. Diversos autores argumentan que la
depresión por endocría puede resultar de la suma del efecto
pequeño de un gran número de genes mientras que otros
sostienen que unos pocos genes de efecto mayor conducen
a una severa depresión por endocría [3].
En plantas, el coeficiente de endocría es estimado, generalmente,
utilizando poblaciones o progenies experimentales
con niveles de endocría conocidos. En la mayoría de
los casos se asume que las poblaciones con apareamiento
completamente al azar presentan un coeficiente de endocría
de cero (F = 0) y son comparadas con progenies obtenidas
por autofecundación (F = 0,5) desde la población de
referencia [1]. Otra posibilidad es el análisis de múltiples
generaciones usando el coeficiente de regresión de la media
fenotípica del carácter sobre el coeficiente de endocría
de cada generación [4]. Chaves et al. [1], basándose en la
hipótesis que una muestra de loci neutrales permite hacer
inferencias acerca del coeficiente de endocría de una población,
y teniendo en cuenta que los efectos de la endocría
son expresados en todos los loci de cada planta, analizaron
112 progenies maternas de 10 subpoblaciones naturales de
Eugenia dysenterica DC en condiciones controladas. En el
presente trabajo se ensayó la utilidad de este método para
estudiar la posible presencia de depresión por endocría y su
consecuente efecto sobre los valores fenotípicos de los caracteres
poligénicos en individuos adultos de poblaciones
naturales de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan var.
cebil (Griseb) Altschul [5]. Las poblaciones naturales de A.
colubrina var. cebil pueden ser consideradas como modelo
biológico para el estudio de los efectos del aumento de
la homocigosis en las poblaciones naturales debido a los
cambios en la distribución de esta especie resultantes de
la fragmentación de una distribución histórica más extensa
que condujeron a la reducción del tamaño poblacional y
al incremento del aislamiento espacial de las poblaciones
remanentes [6]. Además, esta especie es alógama y la
floración ocurre al final de la época seca e inicio de la
húmeda; la polinización es entomófila y la diseminación
de semillas es por autocoria-anemocoria.
A. colubrina var. cebil presenta una distribución
disyunta a lo largo de los Bosques Secos Estacionales
Neotropicales (Seasonally Dry Tropical Forests - SDTFs)
[7]. Pueden identificarse tres núcleos en la distribución de
esta especie, dos de los cuales se localizan en Argentina: el
núcleo Misiones que incluye a la provincia biogeográfica
Paranaense y el núcleo Pedemonte Subandino, que incluye
a las Yungas y en el cual A. colubrina var cebil es una
especie frecuente [7]. Estas provincias fitogeográficas aún
mantienen altos niveles de biodiversidad aunque diferentes
condiciones de temperatura, altitud, suelos y precipitaciones
han llevado a un patrón no uniforme en la distribución
de la misma [8]. Además, las actividades humanas han
provocado un gran impacto en estas áreas debido a una
reciente deforestación como consecuencia del avance de
la frontera agropecuaria [8].
Los antecedentes descriptos anteriormente permiten
postular como hipótesis de trabajo que los individuos
de las poblaciones remanentes de A. colubrina var. cebil
presentan aumento de homocigosis en los caracteres
poligénicos analizados como consecuencia de endocría,
siendo los objetivos planteados para testar esta hipótesis:
I. Determinar el aumento de la homocigosis por endocría
en los caracteres poligénicos mediante el empleo de loci
neutrales de herencia biparental; II. Cuantificar posibles
efectos de depresión por endocría en los valores fenotípicos
de los caracteres poligénicos analizados y III. Estimar el
coeficiente de coancestría y el tamaño efectivo poblacional.
Materiales y Metodos
Se colectaron hojas y frutos desde ramas ubicadas en
la mitad de la copa de cada individuo durante la época de
fructificación. Se analizaron 69 individuos adultos de A.
colubrina var. cebil localizados en dos provincias fitogeográficas:
Paranaense y Yungas. En la provincia fitogeográfica
Paranaense el área de estudio se delimitó en el S de la
provincia de Misiones, localizándose en el departamento
de Candelaria y comprendió a las localidades de Santa Ana
(27° 25' 55,92" S 55° 34' 16,68" W, altitud 153 msnm) y
Candelaria (27° 26' 58,2" S 55° 44' 20,22" W, altitud 104
msnm). Por su parte, en la provincia fitogeográfica de las
Yungas el área de estudio se delimitó en las provincias de
Tucumán y de Jujuy comprendiendo a dos localidades una
localizada en el área del cerro San Javier (26° 47' 26,10" S
65° 18' 58,14" W, altitud 610 msnm) y la otra en el Parque
Nacional Calilegua (23° 45' 15,012" S 64° 51' 12,996" W,
altitud 950 msnm), respectivamente.
Se analizaron de 8 a 20 individuos adultos en cada localidad
agrupándolos en subpoblaciones. Se consideró una
separación mínima entre individuos de 3 m. de radio. Los
individuos fueron geo-referenciados mediante el sistema
de posicionamiento global (GPS).
Sobre tres a cinco hojas herborizadas, se midieron los
caracteres vegetativos (veg): Largo y Ancho de lámina (LL
y AL, respectivamente) y la relación Largo de Lámina/
Ancho de Lámina (LL/AL). Además, se midieron los
caracteres reproductivos (rep): Longitud y Ancho de Vaina
(LV y AV, respectivamente) sobre cinco a ocho frutos y
Número de semilla por fruto (NSF) y Longitud y Latitud de
semillas (LS y LtS, respectivamente) en todas las semillas
de los frutos analizados. Dichas mediciones se registraron
en centímetros (cm).
Además, se consideraron 8 loci microsatélites nucleares
específicos para A. colubrina var. cebil: Ac34.3, Ac48.1,
Ac11.2, Ac28.3, Ac157.3, Ac41.1, Ac172.1 y Ac162.1 [9].
Para el alcance de los objetivos se aplicó el método
propuesto por Chaves et al.[1]. Así, los efectos de la
endocría en los caracteres poligénicos, bajo el supuesto de
que la endocría afecta a todos los loci por igual, se infirió
desde loci neutrales a través de la media de un carácter
cuantitativo, medida en un conjunto de k subpoblaciones
(M0k), y las estimas del índice de fijación FITk mediante la
ecuación
la cual es usada como un modelo de regresión lineal para estimar la depresión por endocría (ID) de cada carácter y la media esperada del carácter poligénico (MP) en la población panmíctica de referencia:
Este modelo asume que los efectos epistáticos son insignificantes, llevando a una respuesta lineal del carácter poligénico a la endocría y las estimas FITk realizadas sobre marcadores neutrales codominantes representan el promedio del coeficiente de endocría en las k subpoblaciones. Desde (1), MP puede ser estimado por el intercepto de la línea de regresión mientras que la depresión por endocría (ID) es definida por el coeficiente de regresión o pendiente (ß). Las desviaciones desde la regresión (εk), junto con Δk, incluyen las diferencias entre las subpoblaciones debidas a la selección natural, errores asociados con las estimas de M0k y de FITk y otras variaciones no explicadas por la regresión lineal. Finalmente, la depresión por endocría se cuantificó a partir del porcentaje de la media esperada de la población de referencia como
A partir de las variables cuantitativas se estimaron los valores parciales necesarios para la aplicación de este método realizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para estimar la variación intrapoblacional de cada carácter analizado para, de esta manera, obtener la Suma de Cuadrados (SC) dentro de cada subpoblación. Además, se estimó el índice de fijación total (FIT) de cada subpoblación en relación al conjunto de individuos, mediante la siguiente ecuación
donde HOK es la heterocigosis observada promedio de la subpoblación y HE es la heterocigosis esperada global [1]. Ambas heterocigosis fueron estimadas usando el programa GenAlEx versión 6.5 (disponible en http://biology.anu. edu.au/GenAlEx/Welcome.html) en tanto que el índice se calculó de manera manual. En el análisis de regresión realizado para cada carácter el índice FITk y la SC de cada carácter dentro de cada subpoblación definieron la variable independiente x y la variable dependiente y, respectivamente. Este análisis se realizó aplicando el programa GenAlEx versión 6.5. Se testó la significancia estadística de la pendiente ß mediante la implementación de una prueba de Hipótesis T [10] cuya hipótesis nula fue:
donde toma el valor de cero el cual representa una pendiente nula. El test estadístico T empleado se define mediante la siguiente ecuación:
donde
Este test estadístico presenta una distribución t con n- 2 grados de libertad cuando se cumple Ho. SY/X es el desvío estándar de la muestra calculado como la raíz cuadrada de la varianza S2 Y/X la cual se estimó a partir de la siguiente ecuación:
donde Yi es la SC dentro de cada subpoblación y el valor estimado de ŷi= ß0+ ßXi, donde es el intercepto (Mp) u ordenada al origen de la regresión y Xi es el valor de FITk. En tanto que Sx representa el desvío estándar de los valores de X el cual fue calculado mediante la siguiente ecuación:
donde es el promedio de los valores de FITk obtenidos para cada subpoblación. Mediante la presente prueba de hipótesis puede ser rechazada para un nivel de confianza del 95% cuando |T|>tn-2,1-α/2, donde tn-2,1- denota el punto de la distribución t para el 95% de confianza con n - 2 grados de libertad. El coeficiente de coancestría de las poblaciones (Θ) corresponde a la correlación entre los estados alélicos de dos individuos tomados al azar de la misma población y fue estimado mediante el promedio del coeficiente de coancestría calculado entre todos los pares de individuos empleando la siguiente ecuación:
donde n es el número de individuos muestreados en cada población, FIS es el coeficiente de endocría de cada población y θXY es el coeficiente de coancestria entre los individuos x e y [11]. El coeficiente de endocría FIS se estimó aplicando un Análisis de la Varianza Molecular (AMOVA) de cuatro niveles jerárquicos (Entre regiones, entre poblaciones dentro de regiones, entre individuos dentro de poblaciones y dentro de individuos). Para datos codominantes, el estimador de Fij enunciado por Loiselle et al. [12] es el más apropiado para el cálculo de θXY [13]. El estimador Fij se basa en la probabilidad de que un alelo i tomado al azar sea idéntico al alelo j también tomado al azar y queda definido como Fij = (Qij− Q)/(1 − Q) [13]. Para la estimación de este coeficiente se empleó el programa SPAGEDI 1.4 (disponible en http://ebe.ulb.ac.be/ebe/SPAGeDi.html). El tamaño efectivo (Ne) de las poblaciones puede ser definido como el número de genotipos no endocriados y no relacionados los cuales producen descendientes con el mismo coeficiente de endocría medio que los genotipos de la progenie de la población panmíctica [14]. Se estimó Ne a partir de la ecuación descripta en el trabajo de Sebbenn et al. [15]
Resultados y Discusion
Para determinar posibles efectos de la endocría en los valores medios de los caracteres poligénicos analizados se realizaron sendos análisis de regresión. Las regresiones fueron estimadas a partir de los índices de fijación total (variable independiente x) y la suma de cuadrados (SC) dentro de cada subpoblación (variable dependiente y) calculados (Tabla 1).
Tabla 1: Valores medios error estandar, suma de cuadrados (SC) e Indice de Fijacion total () para cada carácter
LL: Largo de Lamina, AL: Ancho de Lamina, LL/AL: relacion Largo de Lamina/Ancho de Lamina, LV: Longitud de Vaina, AV: Ancho de Vaina, LS: Longitud de semillas, LtS: Latitud de semillas NSF: Numero de
semillas por fruto.
Los valores del estadístico T empleado para el cálculo de la significancia estadística de los coeficientes de regresión para cada carácter analizado se presentan en la Tabla 2. La totalidad de los caracteres poligénicos analizados no presentaron coeficientes de regresión estadísticamente significativos (|Tveg|<t6, 0,95=1,943 y (|Trep|<t5, 0,95= 2,015) con lo cual puede afirmarse que los valores medios de los caracteres cuantitativos no presentan efectos de endocría. Sin embargo, se debe considerar que como consecuencia de la acción de la selección natural, la cual suele manifestarse en los primeros estadios ontogénicos, en generaciones adultas como las analizadas en este trabajo podrían estar sobrerrepresentados aquellos genotipos heterocigotas y por lo tanto, detectarse niveles de endocría más bajos que los esperados [1].
Tabla 2: Valor medio para cada caracter, componentes de la recta de regresion y estimacion porcentual de la depresion por endocria
LL: Largo de Lamina, AL: Ancho de Lamina, LL/AL: relacion Largo de Lamina/Ancho de Lamina, LV: Longitud de Vaina, AV: Ancho de Vaina, LS: Longitud de semillas, LtS: Latitud de semillas NSF: Numero de
semillas por fruto
ns: no significativo estadisticamente (T ≥ 1,943 caracteres vegetativos y T ≥ 2,015 caracteres reproductivos)
En el presente trabajo seis de los ocho caracteres analizados mostraron marcadas diferencias entre los valores medios de MP y la media del carácter (Tabla 2) a pesar de esperarse valores similares entre MP y la media del carácter en casos de ausencia de endocría [1]. Debe considerarse que cuando el método de regresión es utilizado en caracteres morfológicos los cuales son analizados en plantas adultas en el campo, la variación fenotípica entre subpoblaciones incluye un componente ambiental el cual podría tender a reducir la porción de esta varianza explicada por la regresión lineal [1]. El índice FIS presentó un valor promedio de 0,032 (Tabla 3).
Tabla 3: Indice de fijacion (FIS), coeficiente de coancestria (Θ) y tamano
efectivo poblacional (Ne) basados en marcadores microsatelites.
Asumiendo apareamiento aleatorio, este valor
indica una tasa esperada de endocría biparental baja (entre
3-4%). A partir de los coeficientes de coancestría estimados
fue posible calcular el tamaño efectivo de las poblaciones
(Tabla 3). El tamaño efectivo promedio representó el
90% del tamaño de las poblaciones analizadas, indicando
que la mayoría de los individuos no están genéticamente
relacionados y no están endocriados (Tabla 3).
La fragmentación de los bosques expone a las poblaciones
de árboles a los efectos de la reducción del flujo
génico [6] generando que en poblaciones pequeñas se
espere un aumento de la coancestría, una reducción del
tamaño efectivo poblacional y pérdida de la diversidad
genética [15]. Los valores estimados del coeficiente de
coancestría poblacional indicarían una tasa esperada de
endocría biparental reducida. El tamaño efectivo de cada
una de las poblaciones estimado a partir de este coeficiente
fue elevado representando, en promedio, 90% del tamaño
muestral de las poblaciones estudiadas, indicando que la
mayoría de los individuos no están genéticamente relacionados
y no están endocriados.
Debido a que el coeficiente de coancestría promedio
mide el grado de relación por descendencia de los
individuos de cada población y que el grado de relación
entre estos individuos determinará el coeficiente de endocría
de la generación siguiente, es posible emplear las
estimaciones del coeficiente de coancestría poblacional
como una predicción del grado de endocría futuro en estas
poblaciones. Siendo que estas poblaciones presentaron
niveles bajos de coancestría se esperan descendencias con
un reducido grado de endocría, en tanto y en cuanto, el
tamaño de estas poblaciones se mantenga constante. Estas
observaciones adquieren relevancia desde el punto de vista
de la conservación e indican que la reducción en el número
de individuos no modificó las frecuencias genotípicas.
Conclusiones
Las poblaciones no presentan efectos de endocría para los caracteres poligénicos analizados ya que no evidenciaron reducción de sus valores fenotípicos medios. En concordancia con ello, las poblaciones presentaron niveles bajos de coancestría y tamaño efectivo elevado lo cual permite afirmar que las mismas mantienen variabilidad genética para ser consideradas como posibles fuentes de germoplasma adaptado.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente financiado mediante el subsidio PIP- IU 2010-2012 N° 114-200901-00110 del Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y mediante el subsidio PICT 2011 N° 1795 del Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) otorgados a M. V. García.
1. Chaves, L.J; Vencovsky, R; Mendonca Silva, R; Pires de Campos Telles, M; Zucchi, M y Coelho A. Estimating inbreeding depression in natural plant population using quantitative and molecular data. Conservation Genetics 12:569- 576. 2011.
2. Ayroles, J.F; Hughes, K.A; Rowe, K.C; Reedy, M.M; Rodriguez-Zas, S.L; Drnevich, J.M; Caceres, C.E y Paige, K.N. A genomewide assessment of inbreeding depression: gene number, function, and mode of action. Conservation Biology 23:920-930. 2009.
3. Keller, F. and Waller, M. Inbreeding effects in wild populations. TRENDS in Ecology & Evolution 17(5):230-241. 2002.
4. Lynch, M. y Walsh, B. Genetics and analysis of quantitative traits. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts, USA p.980. 1998.
5. Tortorelli, L. A. Maderas y bosques argentinos. Orientación Gráfica Editora, p. 515.2009.
6. Young, A.; Boyle, T. y Brown, T. The population genetic consequences of habitat fragmentation for plants. Trends in Ecology & Evolution 11:413-418. 1996.
7. Prado, D.E. y Gibbs, P.E. Patterns of species distributions in the dry seasonal forests of South America. Annals of the Missouri Botanical Garden 80:902-927. 1993.
8. Di Bitetti, M.S; Placci, G. y Dietz L.A. Una visión de biodiversidad para la ecorregión del Bosque Atlántico del Alto Paraná: Diseño de un paisaje para la conservación de la biodiversidad y prioridades para las acciones de conservación. Washington D.C. World Wildlife Fund p. 154. 2003.
9. Barrandeguy, M.E; Prinz, K; Garcia, M.V. y Finkeldey, R. Development of microsatellite markers for Anadenanthera colubrina var. cebil (fabaceae), a native tree from South America. American Journal of Botany e372- e374. 2012.
10. Kleinbaum, D.G; Kupper, L.L; Nizam, A. y Muller, K.E. Applied Regression Analysis and Other Multivariable Methods. Books/ Cole Cengage Leraning p. 906. 2008.
11. Lindgren, D. y Mullin, T.J. Relatedness and status number in seed orchard crops. Canadian Journal of Forest Research 28:276-283. 1998.
12. Loiselle, B.A.; Sork, V.L;Nason, J. y Graham, C. Spatial genetic structure of a tropical understory shrub, Psychotria officinalis (Rubiaceae). American Journal of Botany 82:1420-1425. 1995.
13. Vekemans, X. y Hardy, O.J. New insights from fine-scale spatial genetic structure analysis in plant populations. Molecular Ecology 13: 921-935. 2004.
14. Noiton, A.M.D. y Alspach, A.P. Founding Clones, Inbreeding, Coancestry and Status Number of Modern Apple Cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Science 121(5):773-782. 1996.
15. Sebbenn, A.M; Carvalho, A.C.M; Freitas, M.L.M; Moraes, S.M.B; Gaino, A.P.S.C; da Silva, J.M; Jolivet, C. y Moraes, M.L.T. Low levels of realized seed and pollen gene flow and strong spatial genetic structure in a small isolated and fragmented population of the tropical tree Copaifera langsdorffii Desf. Heredity 106:134-145. 2011.
Recibido: 11/02/2014
Aprobado: 22/05/2014