ARTÍCULOS
Análisis de los efectos de cinco genes (IGF2, CTSD, TBC1D1, MC4R y FABP3) sobre la conversión alimenticia, la velocidad de crecimiento y el contenido de grasa subcutánea en cerdos de la raza Landrace
Fassa, V.B.1; Carden, T.R.2; Marini, S.J.3; Lett, A.D.1; Lloveras, M.R.4; Marrube, G.1
1Cátedra de Genética. Facultad de Cs. Veterinarias UBA. CABA, Bs. As., Argentina. Correo electrónico: vfassa@fvet.uba.ar
2Facultad de Cs. Exactas UBA. CABA, Bs. As., Argentina
3INTA EEA Marcos Juárez. Córdoba, Argentina.
4INTA EEA Pergamino. Bs. As., Argentina
Recibido 15 de mayo de 2015
Aceptado 15 de septiembre de 2015
Publicado online 28 de octubre
RESUMEN
La mayoría de los planes de selección en el mejoramiento porcino están basados en la disminución del espesor de grasa dorsal (EGD) como medio para mejorar la eficiencia de conversión (EC) y el contenido de magro en la canal. En el presente trabajo se investiga la asociación entre polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) de los siguientes genes: IGF2 3072G>A; CTSD 70G>A; TBC1D1 219G>A; MC4R 1426A>G; FABP3 1811G>C en la velocidad de crecimiento (VC), espesor de grasa dorsal (EGD) y conversión alimenticia (CA) en una subpoblación de cerdos Landrace pertenecientes a la EEA INTA Pergamino. Debido al efecto de sellado genómico del gen IGF2, los apareamientos fueron diseñados a partir de 2 padrillos heterocigotos para dicho gen (AG) y 30 madres de genotipos AG y GG. Todos los cerdos fueron negativos para el gen RYR1, evitando confundir los efectos de ambos genes en los caracteres fenotípicos a analizar en las progenies. El ensayo respondió a un experimento factorial en un diseño completamente aleatorizado. No se realizó el estudio de asociación para el SNP CTSD 70G>A debido a la falta de polimorfismo. Solo hubo asociación entre los SNPs de los genes IGF2 y TBC1D1 para VC, EGD y CA. Se confirmó el efecto mayor del alelo Apat del gen IGF2 en EGD y CA (1,8 mm y 0,3kg, p<0,05) y hubo diferencias entre genotipos del gen TBC1D1 para VC. Debido a la magnitud del efecto sobre EGD, P2 y CA hallado en los cerdos con respecto a la herencia del alelo Apat del gen IGF2, este SNPs podrá ser una herramienta útil en la selección asistida por marcadores en los planes de cría.
Palabras clave: Porcinos; Polimorfismo de un solo nucleótido; Genes IGF2; CTSD; TBC1D1; MC4R; FABP3; Caracteres productivos.
ABSTRACT
Most selection plans in pig breeding are based on the reduction of back-fat thickness (BF) as mean for improving feed conversion (FC) and carcass lean content. The present work investigates possible associations between Single Nucleotid Polymorphism (SNP) of the following genes: IGF2 3072G>A; CTSD 70 G>A; TBC1D1 219G>A; MC4R 1426A>G; FABP3 1811G>C on growth rate (GR), back fat (BF) and feed convertion (FC) in individuals of a subpopulation of Landrace pigs maintained at EEA INTA Pergamino. Due to the genomic imprinting effect of the IGF2 gene, mating were designed starting with two sires heterocygote (AG) with 30 sows AG, GG. All individuals were negative for the allele RYR1 to avoid confusing effects of both genes on the analyzed phenotypic characters. The trial responded to a factorial experiment in a completely randomized design. Association study for SNP CTSD 70G> A was not carried out due to the lack of polymorphism. There was only association between SNPs of IGF2 and TBC1D1 genes and GR, BF, or FC. A major effect of the Apat allele of IGF2 on BF and FC in reducing BF and FC indexes (1.8 mm and 0.3kg, p<0.05) and differences in GR among genotypes of the TBC1D1 gene were confirmed. Because of the magnitude of the effect on EGD, P2 and CA found in pigs with respect to inheritance Apat allele of IGF2 gene; this SNPs may be a useful tool in marker-assisted selection in breeding plans.
Keywords: Porcine; Single nucleotide polymorphism; Genes; IGF2; CTSD; TBC1D1; MC4R; FABP3; Productive traits.
INTRODUCCIÓN
Los criterios a tenerse en cuenta en la selección de los
caracteres productivos en porcinos están asociados con el
tiempo y el costo de alimentación en relación con la cantidad
y calidad del tejido magro producido. Este grupo de
caracteres tiene una enorme importancia sobre los costos
de producción, principalmente porque la disminución de la
grasa subcutánea dorsal mejora la eficiencia de conversión
y determina mayor contenido de tejido magro en las canales
porcinas, principal objetivo de los programas de mejoramiento
genético en la actualidad.
Un gran número de estudios han permitido asociar marcadores
de ADN con caracteres fenotípicos de importancia
económica como deposición de grasa corporal, velocidad
de crecimiento y consumo de alimento. El análisis de estos
genes candidatos y sus correspondientes polimorfismos en
líneas de cerdos comerciales y en los núcleos genéticos,
junto con la evidencia proveniente de las experiencias de
mapeo de QTL (Quantitative Trait Loci), (http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index) en familias de
referencia han permitido identificar los SNPs (Single Nuleotide
Polymorphism) asociados a estos caracteres para
ser utilizados en los esquemas de selección asistida por
genotipos. Entre los genes candidatos para ser validados
en las poblaciones porcinas locales en relación con los caracteres
productivos se hallan:
Factor de tipo insulínico 2 (IGF2): Van Laere et al. (2003)
descubrieron un polimorfismo en el gen IGF2 que se localiza
en la región regulatoria de este. La sustitución 3072G>A
en el tercer intrón de dicho gen altera un sitio de unión de
un represor nuclear triplicando la expresión del ARNm de
este en el músculo esquelético durante el crecimiento posnatal
cuando el alelo A es heredado del progenitor masculino
(sellado genómico). Este evento conduce a un aumento
de la masa muscular y a una disminución del espesor de
grasa dorsal sin que por ello se vea afectada la calidad
de la carne (Carrodeguas et al., 2005; Estellé et al., 2005;
Van den Maagdenberg et al., 2008; Oczkowicz et al., 2009;
Fontanesi et al., 2010 y 2012; Burgos et al., 2012). Estos
autores han establecido también la asociación de este polimorfismo
con otros caracteres de importancia económica
como peso corporal, velocidad de crecimiento y eficiencia
de conversión. Uno de los principales objetivos de la selección
en cerdos durante las últimas décadas ha sido la
obtención de animales de rápido crecimiento y magros. Se
asume que la rápida evolución en esta dirección ha sido
acompañada con la selección del alelo beneficioso Apat del
gen IGF2 en las diferentes razas porcinas. Oczkowicz et al.
(2012) estudiaron las frecuencias génicas y genotípicas en
las diferentes razas en Polonia, siendo del 100% y del 91%
para el genotipo AA en las razas Duroc Jersey y Pietrain
respectivamente, hasta frecuencias del 27% en la raza local
Pulawska.
Catepsina D (CTSD): las catepsinas (Catepsina B, D, L,
F, H, y Z) son un grupo de enzimas lisosomales con actividad
proteasa que ejercen numerosas funciones en diferentes
tejidos corporales. Russo et al. (2008) localizaron el
gen CTSD en el cromosoma 2 del porcino en una región en
la que previamente se han identificado numerosos QTL con
y sin efecto paterno para los caracteres eficiencia alimentaria,
velocidad de crecimiento y calidad de la canal. Estos
autores encontraron para el caso particular de CTSD una
sustitución en la región 3`UTR 70G>A con un efecto importante
en diferentes caracteres productivos y de la canal. Específicamente
el alelo A se encuentra asociado a una mayor
velocidad de crecimiento, mayor cantidad de cortes magros,
mayor peso del jamón, mayor conversión y un menor espesor
de grasa dorsal. Debido a la cercanía del locus de CTSD
con relación a IGF2, Fontanesi et al. (2010) sugirieron un rol
independiente de CTSD con respecto a IGF2 en deposición
de grasa y músculo. El gen CTSD no presenta el efecto de
sellado genómico que sí presenta IGF2, lo cual lo convierte
en un gen con mayor facilidad para ser incorporado a los
planes de selección asistida por genotipos.
Tre-2/USP6. BUB2, cdc16 miembro 1 (TBC1D1): este
gen se expresa en músculo esquelético, codifica para una
Rab-GTPasa implicada en el transporte de glucosa a través
de GLUT4 en respuesta a la insulina y al estímulo activador
de AMPK en el músculo esquelético. Fontanesi et
al. (2011 y 2012) hallaron varios polimorfismos, de todos
ellos, la sustitución 219G>A se encontró asociada a espesor
de grasa dorsal, peso del jamón y cortes magros en la
raza Large White y con contenido de grasa intramuscular
en Duroc Jersey.
Receptor de melanocortina 4 (MC4R): codifica para una
proteína G, receptor transmembrana que tiene un rol importante
en el control de la homeostasis energética. En mamíferos
este receptor se expresa fundamentalmente en el
sistema nervioso central en regiones que controlan el consumo,
peso corporal y la homeostasis energética. En los
cerdos, Kim et al. (2000) hallaron una mutación de sentido
erróneo 1426A>G en la secuencia que codifica para la séptima
región transmembrana del receptor de melanocortina
que sustituye a Asp298Asn. El alelo G se halló asociado a
menor espesor de grasa dorsal, velocidad de crecimiento
más lenta y menor consumo. Estos resultados fueron confirmados
por numerosos grupos de estudio (Burgos et al.,
2005; Bruun et al., 2006; Meidtner et al., 2006; Van den
Maagdenberg et al. 2007; Fan et al., 2009; Piorkowska et
al., 2010; Davoli et al., 2012; Fontanesi et al., 2013).
Proteína de unión a ácidos grasos -3 (FABP3): este gen
corresponde a uno de los 9 miembros de una familia de
proteínas intracelulares de unión a lípidos. Estas pequeñas
proteínas intracelulares están involucradas en el transporte
de ácidos grasos desde la membrana plasmática a los
sitios de β oxidación y/o síntesis de triacilglicerol o fosfolípidos.
Al comparar los genotipos homocigotas (DD–dd) para
el SNP 1811G>C del gen FABP3, Gerbens et al. (1999)
hallaron diferencias significativas para espesor de grasa
dorsal y peso corporal. Este SNP y otros localizados en
dicho gen se asociaron también con el contenido de lípidos
intramusculares (Gerbens et al., 2001; Pang et al., 2006;
Lee et al., 2010; Zhao et al., 2010).
Receptor de Rianodina -1 (RYR-1): el efecto de la sustitución
C>T en la posición 1843 del cADN del gen RYR1 es
responsable del síndrome de estrés porcino y de las carnes
blandas pálidas y exudativas. Este gen también esta asociado
a mayor contenido de magro y desarrollo muscular
en diferentes razas porcinas incluyendo a Pietrain (Fuji et
al., 1991; Stinckens et al., 2007; 2009, Van den Maagdenberg
et al., 2008; Marini et al., 2012).
El presente trabajo tiene por objetivo la determinación del
efecto de los SNPs descriptos en los genes IGF2, CTSD,
TBC1D1, MC4R y FABP3 en una muestra de cerdos de raza
Landrace, perteneciente a la EEA INTA Pergamino, con relación
a los caracteres velocidad de crecimiento (VC), espesor
de grasa dorsal (EGD) y conversión alimenticia (CA).
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Se tomaron muestras de sangre de padrillos de diferentes
empresas: razas Duroc Jersey y Landrace del Núcleo Genético
Ceres, terminales de PIC Agroceres, Landrace de Degesa
y Landrace de Porcomagro S.R.L. para la determinación de
los genotipos del gen IGF2. Simultáneamente se obtuvieron
muestras de pelo para la determinación del gen RYR1 por sus
ya conocidos efectos sobre este grupo de caracteres.
En función de los resultados del relevamiento de los machos
para ambos genes se determinó el genotipo de las
hembras puras Landrace (tabla 1) y se decidió trabajar con
la subpoblación de Landrace.
Tabla 1. Número de cerdos por genotipo, línea y género para los genes IGF2 y RYR 1
Animales experimentales
El experimento fue realizado en la EEA INTA Pergamino.
Los padres y madres de la línea Landrace utilizados para la
generación de los animales experimentales fueron provistos
por el Núcleo Genético Ceres. Los apareamientos fueron diseñados
a partir de 2 padrillos heterocigotas (AG) para el
IGF2 y 30 madres de genotipos AG y GG. Todos los cerdos
fueron negativos (NN) para gen RYR1 de manera de evitar
confundir los efectos de ambos genes en los caracteres fenotípicos
a analizar en las progenies (tabla 2).
Como puede observarse en la tabla 2, los cerdos estudiados
fueron del genotipo Apat contra Gpat. Ambos padrillos
estuvieron igualmente representados en el número de
hijos estudiados.
Todas las cerdas parieron en la misma tanda y fueron
destetados en promedio a los 30 días de edad. Los lechones
fueron transferidos a dos salas de recría en grupos
de 30 animales por box con pisos parcialmente ranurados,
bebederos tipo chupete y comederos tolva de acero inoxidable.
La alimentación fue en fases de acuerdo al protocolo
correspondiente hasta un peso promedio de 28 kg. En esta
etapa se determinaron los genotipos para el gen IGF2.
Tabla 2. Generación de cerdos experimentales
Diseño experimental
El ensayo respondió a un experimento factorial. Finalizada
la recría, 84 animales (hembras y machos castrados)
fueron asignados al grupo Apat o Gpat. Durante toda la
prueba fueron alojados en forma individual con comederos
tolva y bebederos tipo chupete. Las raciones fueron elaboradas
a partir de maíz-soja y concentrado para cubrir los
requerimientos de las etapas de crecimiento (30-60 kg) y
terminación (60-90 kg), en ambos períodos la alimentación
fue ad libitum. La velocidad de crecimiento y la conversión
alimenticia fueron evaluadas entre los 30 y 90 kg. El espesor
de grasa dorsal fue medido con equipo de ultrasonido
(LEAN MEATER RENCO®) a los 90 kg de dos formas: a
la altura de la primera vértebra lumbar a 5 cm de la línea
media (P2) y el promedio de tres mediciones, a la alturas
del codo, de la última costilla y del glúteo medio, todas desplazadas
5 cm de la línea media (EG3).
Determinación de genotipos
La extracción de ADN para el gen RYR1: el ADN se aisló
de 10 bulbos de pelo resuspendidos en 100 μl de buffer
de lisis junto con 0,4 mg/ml de proteinasa K incubándose
a 45 ºC durante toda la noche (Marini et al., 2012). En el
caso de los genes IGF2, CTSD, TBC1D1, MC4R y FABP3,
el ADN se extrajo a partir de sangre entera con EDTA como
anticoagulante, utilizando el kit comercial illustraTM blood
genomicprep Mini spin Kit (GE Healthcare).
La reacción de PCR para los genes IGF2, CTSD, TBC1D1
se desarrolló en un volumen final de 25 μl para cada
muestra y los amplicones se visualizaron en geles de agarosa
al 2%, fotografiados bajo luz UV y teñidos con GelRed
Nucleic Acid Stain (Biotium).
- IGF2: la sustitución G>A del intrón 3-3072 fue analizada
de acuerdo con Fontanesi et al., (2010), mediante PCRRFLP.
Se utilizó la endonucleasa de restricción AdeI que
reconoce al alelo A dando fragmentos de 65+20 pares de
bases (pb), en tanto que el alelo G es de 85 pb.
- CTSD: la sustitución 70G>A genera un sitio de corte para
la enzima de restricción MscI en el alelo A: 117pb+67 pb
y no reconoce secuencia de corte en el alelo G dando un
producto de 184 pb (Fontanesi et al., 2010).
- TBC1D1: la sustitución para analizar es reconocida por la
endonucleasa HphI, siendo los fragmentos para el alelo G:
129pb y para el alelo A: 97pb+32pb (Fontanesi et al., 2011).
Los productos de digestión para los genes IGF2, CTSD y
TBC1D1 fueron visualizados en geles no desnaturalizantes
de poliacrilamida (acrilamida/bisacrilamida 29/1) al 12% en
TBE 0,5X teñidos con GelRed y fotografiados bajo luz UV.
- MC4R: la sustitución 1426 A>G se determinó de acuerdo
al protocolo de Kim et al. (2000). Los productos de PCR
de 226 pb fueron digeridos con TaqI que permitió diferenciar
los alelos A: 226 pb y G: 156+70 pb.
- FABP3: la sustitución es reconocida por la enzima HaeIII,
resolviendo fragmentos de: alelo G: 405+278+117+16
pb, y alelo C: 683+117+16 pb (Pang et.al., 2006).
- RYR 1: la sustitución C>T se detectó por HRM (High Resolution
Melting) con un ciclador Thermal Cycler Rotor
Gene Real Time Q (Qiagen) (Marini et al., 2012).
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados siguiendo el modelo lineal
general con el procedimiento GLM del paquete estadístico
SAS (SAS Institute Inc. 2004. SAS/STAT 9.1 User’s Guide.
Cary, NC) SAS Institute Guide. El modelo fue
Yijk=μ+αi+ßj+(αß)ijk+eijk.
donde:
μ: es la media general.
αi: es el efecto del iésimo SNP´s.
ßj: es el efecto del jotaésimo sexo.
(αß)ijk: es el efecto de la interacción del iésimo SNP´s y
del jotaésimo sexo.
eijk: es el error experimental.
En el caso de los genes TBC1D1 y FABP3 se realizó la
comparación de medias mediante test de Tukey (α=0,05).
RESULTADOS
Para los genes IGF2, TBC1D1, MC4R y FABP3 las frecuencias génicas fueron: A: 0,26 y G: 0,74; A: 0,44 y G: 0,56; A: 0,12 y G: 0,88; d: 0,21 y D: 0,79, respectivamente. Cada uno de los genes en el mismo orden exhibieron la siguientes frecuencias genotípicas: AA: 0,07, AG: 0,38, GG: 0,55; AA: 0,21, AG: 0,45, GG: 0,34; GA: 0,23, GG: 0,77 y finalmente dd: 0,05, Dd: 0,32 y DD: 0,63. Como resultado de los análisis estadísticos no se observó efecto de peso inicial, peso final ni de padre. No se encontraron interacciones genotipo-sexo. Para el SNP G>A del intrón3-3072 del gen IGF2 no hubo diferencias en la velocidad de crecimiento entre genotipos. Para el carácter EGD, los cerdos Apat tuvieron 1,8 mm menos de grasa y mejor conversión alimenticia (consumieron 0,3 kg menos de alimento por kg de cerdo producido). Como era de esperar los machos castrados, crecieron más, fueron más gordos y tuvieron peor conversión alimenticia que las hembras: 55 g/d, 1,4 mm, y 0,3 kg respectivamente (tabla 3). En relación con los caracteres de grasa y conversión alimenticia los cerdos Apat se comportaron de manera similar a las hembras. El polimorfismo 219 G>A en el segundo intrón del gen TBC1D1 mostró diferencias para el carácter velocidad de crecimiento entre los animales del ensayo (tabla 4). No se hallaron diferencias significativas entre genotipos para los caracteres analizados y los SNPs de los genes MC4R y FAPB3. No se realizó el análisis estadístico para el gen CTSD debido a que todos los animales fueron de genotipo AA.
Tabla 3. Caracteres de crecimiento para los genotipos IGF 2 (grupos A y G).
Medias y errores estándar (es). En cada fila, medias con distintas letras son significativamente diferentes (p<0,05). VC (velocidad de
crecimiento), P2 (espesor de grasa dorsal a la altura de la primera vértebra lumbar a 5 cm de la línea media), EGD (espesor de grasa
dorsal) y CA (conversión alimenticia).
Tabla 4. Caracteres de crecimiento para los genotipos TBC1D1.
Medias y errores estándar (es). En cada fila, medias con distintas letras son significativamente diferentes (p<0,05). VC (velocidad de
crecimiento), P2 (espesor de grasa dorsal a la altura de la primera vértebra lumbar a 5 cm de la línea media), EGD (espesor de grasa
dorsal) y CA (conversión alimenticia).
DISCUSIÓN
Debido al efecto del gen RYR-1 en los caracteres productivos
analizados en el presente trabajo, los animales
fueron todos genotipados para solo ser incluidos en el ensayo
los porcinos de genotipo NN de manera de evitar confundir
los efectos en los caracteres fenotípicos analizados
entre los genes RYR1 e IGF2. De acuerdo con Stinckens
et al. (2007) estos loci explican conjuntamente el 50% de
la diferencia en la varianza fenotípica entre cerdos de raza
Pietrain y Large White. El gen RYR1 afecta la expresión
del IGF2 de forma tal que es mayor en los animales Apat/
NN con respecto a los animales Apat/nn (Stinckens et al.,
2007, 2009). Van den Maagdenberg et al. (2008) demostraron
una interacción entre los efectos de los genes IGF2 y
RYR1 asociados a peso al nacimiento y el peso de la canal.
En nuestro trabajo la velocidad de crecimiento no mostró
diferencias para los genotipos del gen IGF2 y sí fueron
significativas para el contenido de grasa subcutánea medidas
tanto en P2 como EGD, con valores menores para los
animales que portan el alelo Apat y mayores en capones
con respecto a las cachorras. De la misma manera los animales Apat convirtieron mejor el alimento en músculo, ya
que consumieron menos alimento para alcanzar los 90 kg
de peso vivo y a su vez fueron más magros. Van den Maagdenberg et al. (2008) presentaron resultados semejantes
para el carácter promedio de ganancia diaria de peso.
Estelle et al. (2005) encontraron en una población de
cerdos Large White diferencias para EGD en los animales
portadores del alelo Apat. Oczkowicz et al. (2009) establecieron
que la frecuencia del alelo A es mayor en las
razas o líneas sujetas a una mayor presión de selección
por magritud, más aún en Landrace el alelo Apat aumenta
el promedio de ganancia diaria y disminuye el consumo.
Fontanesi et al. (2010 y 2012) analizando una población
de animales Large White Italiano y utilizando como registro
valores de cría para EGD encontraron que los animales en
el extremo de la curva con el valor de cría esperado más
alto para EGD tenían una frecuencia menor del alelo Gpat
(0,38); en tanto que los animales con el valor de cría esperado
más bajo para EGD presentaban mayor frecuencia
del alelo Gpat (0,72). Estos autores encontraron también
diferencias en los caracteres promedio de ganancia diaria
y consumo en los animales con el alelo Apat. Burgos et al.
(2012) encontraron diferencias significativas entre ambos
alelos del gen IGF2 para EGD, pero no para los caracteres
productivos como peso vivo y promedio de ganancia diaria.
Los resultados del estudio de asociación para la sustitución
219 G>A en el segundo intrón del gen TBC1D1 con el
carácter VC muestra en nuestro ensayo una similitud con
los resultados publicados por Fontanesi et al. (2011 y 2012)
hallándose diferencias entre genotipos (p<0,05) para los
caracteres VC, P2 y EGD (tabla 4).
CONCLUSIÓN
Se determinó la asociación del polimorfismo del gen TBC1D1 219G>A con el carácter VC. Debido a la magnitud del efecto sobre EGD, P2 y CA hallado en los cerdos con respecto a la herencia del alelo Apat del gen IGF2, este SNPs podrá ser una herramienta útil en la selección asistida por marcadores en los planes de cría.
FINANCIAMIENTO
PNCAR 013321 2009-2012, PNPA 1126033 2013-2019, UBACyT Código 20020110100018 Programación Científica 2012-2015.
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