ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B > v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp62article62Efecto del cipionato de estradiol y la GnRH sobre la sincronización de ovulaciones y la tasa de preñez a la IATF en vacas de cría sin ternero al pie*
^cYv18n2a01.htm B N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp73article62Uslenghi, G.1; Cabodevila, J.1 & Callejas, S.S.2
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B < ~ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp84article621CONICET - CIVETAN Becario de postgrado.
2Área de Reproducción, FISFARVET. Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil (CIVETAN, CONICET-CICPBA).
Correspondencia e-mail: uslenghi@vet.unicen.edu.ar
^cYv18n2a01.htm 0 N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp106article62Recibido: 07/01/2016
Aceptado: 13/07/2017
Resumen
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 : A C q v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp128article62Se evaluó el efecto del cipionato de estradiol (CPE), de la Hormona Liberadora de Gonadotrofina (GnRH) y la combinación de ambos sobre la sincronización de ovulaciones y la tasa de preñez post inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) en vacas de cría sin ternero al pie. En el Experimento 1, se utilizaron 40 vacas secas, las cuales se dividieron aleatoriamente para recibir cuatro inductores de la ovulación (n=10/grupo): 1 mg de CPE; 1 mg de benzoato de estradiol (BE), 10,5 μg de GnRH, o la combinación de CPE+GnRH. Se realizaron ecografías cada 12 horas para determinar el momento de ovulación. En el Experimento 2, las vacas recibieron los mismos tratamientos: Grupo CPE: n=71; Grupo BE: n=70; Grupo GnRH: n=67; Grupo CPE+GnRH: n=70. El Día 10 las vacas fueron IATF, el diagnóstico de gestación se realizó por ultrasonografía a los 35 días posteriores. Los datos se analizaron mediante el programa SAS. No hubo efecto del tratamiento sobre la dinámica folicular ni sobre la hora promedio de ovulación (P>0,05); sin embargo, las vacas tratadas con GnRH tuvieron mayor dispersión de ovulaciones (P<0,05). La tasa de preñez no difirió entre tratamientos (P>0,05; CPE: 46,3%, BE: 54,3%, GnRH: 47,9% y CPE+GnRH: 60,0%). En conclusión, la administración de GnRH en vacas que recibieron CPE tiende a mejorar la distribución de ovulaciones, pero no incrementa la tasa de preñez a la IATF.
^cYv18n2a01.htm \ N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp139article62Palabras clave: Estrógeno; Buserelina; Inseminación artificial; Ovulación; Preñez.
^cYv18n2a01.htm l N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp1410article62Effect of estradiol cypionate and GnRH on synchronization of ovulation and pregnancy rate at FTAI in non-suckled cows.
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp1511article62Summary
^cYv18n2a01.htm V N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp1612article62Two experiments were conducted to evaluate the effect of estradiol cypionate (ECP), Gonadotropin realizing hormone (GnRH) and the combination of both on synchronization of ovulations and pregnancy rate at fixed-timed artificial insemination (FTAI). In Experiment 1, forty cows were randomly assigned to received different ovulation inducers (n=10/group): 1 mg of ECP; 1 mg of estradiol benzoate (EB); 10.5 μg of buserelin acetate (GnRH); 1 mg of ECP plus 10.5 μg of GnRH. Ovarian ultrasonography examinations were performed every 12 h from intravaginal device removal to ovulation, to detect the dominant follicle and ovulation. In Experiment 2, cows received the same treatments: Group ECP: n=71; Group EB: n=70; Group GnRH: n=67; Group ECP-GnRH: n=70, and FTAI 48-50 h after intravaginal device removal. Pregnancy rate was determined on day 35 by ultrasonography. Variables were analyzed by SAS. There was no effect of treatments on follicular dynamics, and on the mean interval to ovulation (P>0.05); however, GnRH treated cows had scattered distribution of ovulations (P<0.05). Pregnancy rate did not differ (P>0.05) between treatments (P>0.05; ECP: 46.3%, EB: 54.3%, GnRH: 47.9% y ECP+GnRH: 60.0%). In conclusion, GnRH administration in cows that receive ECP at PID removal tended to improve the distribution of ovulations, but did not enhance pregnancy rate at FTAI.
^cYv18n2a01.htm R N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp1713article62Key words: Estradiol; Buserelin acetate; Artificial insemination; Ovulation; Pregnancy rate.
Introducción
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D Q v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp1915article62En un protocolo para inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) a base de dispositivos intravaginales (DIV) con progesterona (P4) más estradiol, la administración de cipionato de estradiol (CPE) al momento de retirar los DIV es extensamente utilizada en la actualidad para reemplazar el benzoato de estradiol (BE) como inductor de la ovulación con el objetivo de reducir el número de encierres de los animales7. Sin embargo, el tratamiento con CPE es menos efectivo para sincronizar el pico de LH12 y la ovulación14 respecto del uso de BE. Por otra parte, la GnRH asministrada en el momento de la IATF ha sido utilizada para sincronizar las ovulaciones en lugar del BE que se administra 24 h post DIV, y Sá Filho et al. (2010) reportaron que el tratamiento con GnRH, previene la aparición de ovulaciones tardías en ganado Bos indicus. En consecuencia, la combinación del CPE con GnRH podría concentrar las ovulaciones que se producen luego de aplicar CPE en el momento de retirar el DIV. Por lo tanto se realizaron dos experimentos para evaluar el efecto de combinar el cipionato de estradiol y la GnRH sobre la sincronización de las ovulaciones y la tasa de preñez a la IATF, basados en la hipótesis que esta combinación concentra las ovulaciones y mejorar los porcentajes de preñez que se pueden obtener luego de realizar una IATF.
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D k v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp2016article62Materiales y Métodos
^cYv18n2a01.htm n N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp2117article62Lugar
Los experimentos se realizaron en la Provincia de Buenos Aires, Argentina (37°S, 60°O). El diseño experimental y el manejo de los animales se realizaron de acuerdo a las regulaciones del Comité de Bienestar Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias, U.N.C.P.B.A., Tandil, Bs. As., Argentina.
Experimento 1
Animales y tratamientos. Se utilizaron 40 vacas Bos taurus secas de raza Angus, multíparas que se encontraron pastoreando ryegrass (Lolium perenne), con una condición corporal (CC) de 3,2 ± 0,3 (escala 1 a 5, 1: emanciada y 5: obesa) y más de 60 días postparto. El día 0, se colocaron los DIV (Cronipres® Tres usos, Biogénesis-Bagó, Garín, Argentina) más 2 mg de BE (Bioestrogen, Biogénesis-Bagó, Garín, Argentina). Al retirar los DIV (día 8), las vacas recibieron 0,15 mg de D-Cloprostenol (Enzaprost D-C, Biogénesis- Bagó, Garín, Argentina) y se dividieron aleatoriamente, teniendo en cuenta el estatus ovárico (EO), para recibir (n=10/grupo): 1 mg de CPE (ECP estradiol, König, Buenos Aires, Argentina) el día 8; 1 mg de BE el día 9; 10,5 μg de GnRH (Gonaxal, Biogenesis Bagó, Garín, Argentina) el día 10; 1 mg de CPE (día 8) + 10,5 μg de GnRH (día 10).
Muestreo sanguíneo y radioimmunoensayo. Para analizar las concentraciones plasmáticas de P4, se realizaron extracciones de sangre por venipunción de la vena yugular desde el día 8 al 12, cada 24 h. Para evaluar la funcionalidad del cuerpo lúteo1 (CL) también se obtuvo una muestra el día 22. Las muestras fueron colectadas en tubos heparinizados, centrifugadas (2000 g durante 15 min) y el plasma fue almacenado a -20 ºC hasta el análisis. La determinación de P4 se realizó por RIA utilizando un kit comercial (COAT A COUNT, Siemens Healthcare Diagnostic Inc., CA, USA). El coeficiente de variación intra-ensayo fue menor a 7% para muestras comprendidas entre 0,1 y 40,0 ng/ ml, el coeficiente de variación inter-ensayo fue menor a 3,5% y la sensibilidad fue 0,01 ng/ml.
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ! e v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp2420article62Ultrasonografía. En el día 0 se determinó el EO, utilizando un ecógrafo con un transductor de 5 MHz (Chison D600VET, 2007, China). El EO fue clasificado de acuerdo a la presencia de: un CL, Folículos (F) ≥ 10 mm o F < 10 mm de diámetro. Luego de retirar los DIV, se realizaron ecografías cada 12 h hasta la ovulación. El momento de la ovulación fue definido como el tiempo medio entre la última observación del folículo dominante (FD) y su desaparición (ovulación), y determina el diámetro del F ovulatorio5. La tasa de crecimiento folicular (mm/día) se calculó como el máximo diámetro alcanzado por el FD, menos el diámetro al retiro del DIV, dividido el intervalo de días14. La ecografía del día 22 fue realizada para confirmar la ovulación2.
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D c v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp2521article62Experimento 2
Animales y tratamientos. Se utilizaron 278 vacas B. taurus secas de iguales características al Experimento 1. Los animales recibieron los tratamientos mencionados en el Experimento 1: Grupo CPE: n=71; Grupo BE: n=70; Grupo GnRH: n=67; Grupo CPE+GnRH: n=70. La IATF se realizó a las 48-50 h de retirados los DIV, utilizando 1 solo toro de probada fertilidad.
Ultrasonografía. Se determinó el EO en el día 0 y la tasa e preñez a los 30 días post IATF. En el día 0, 40% de los animales presentaron un cuerpo lúteo; el 46,4% folículos mayores o iguales a 10 mm y el resto folículos menores.
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D = v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp2723article62Análisis estadístico
Se analizó el diámetro del FD al día 8 y 9, el diámetro del F ovulatorio, la tasa de crecimiento folicular, el intervalo retiro DIV-ovulación, la tasa de ovulación, la concentración plasmática de P4 y área del CL al día 22, mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, análisis de varianza (ANOVA) PROC GLM del SAS 9.29 y test de Bartlett´s. En el modelo de análisis estadístico se tuvo en cuenta el inductor de ovulaciones, el EO y sus interacciones. En el caso de la concentración de progesterona y el área del CL, el modelo se tuvo en cuenta el inductor de la ovulación, el día y su interacción. En el día 22, solo se tuvo en cuenta el inductor de la ovulación. Para estudiar la hora de ovulación se utilizó el test de Tukey. La distribución de ovulaciones fue analizada mediante el PROC FREQ del SAS9. Las concentraciones plasmáticas de P4 del día 8 a 12 se analizaron mediante el PROC MIXED del SAS9; y en el día 22 por ANOVA del SAS9. En el Experimento 2, el porcentaje de preñez a la IATF fue analizado mediante el PROC CATMOD del SAS9, para determinar el efecto del tratamiento, EO y sus interacciones. El nivel de significancia estadística fue P = 0,05 y se consideró tendencia a P<0,10.
Resultados
^cYv18n2a01.htm N 0 5 6 7 9 ; B D i v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp2925article62Experimento 1
Las concentraciones plasmáticas de P4 no fueron diferentes entre tratamientos, pero fueron afectadas por el efecto de tiempo (P<0,05). En el día 8 las concentraciones fueron mayores respecto de los días siguientes (Día 8: 5,04±0,60 ng/ml; Día 9: 0,86±0,13 ng/ml; Día 10: 0,46±0,05 ng/ml; Día 11: 0,32±0,04 ng/ml). El diámetro del FD, F ovulatorio y la tasa de crecimiento folicular no difirieron entre tratamientos (P>0,05; Tabla 1). El 92,5% (37/40) de las vacas ovularon en respuesta al tratamiento hormonal sin diferencias entre los tratamientos en la tasa de ovulación (P>0,05). El tiempo medio de ovulación no difirió entre tratamientos (P>0,05; CPE: 75,6±16,8; BE: 69±8,5; GnRH: 70,8±12,9; CPE+GnRH: 66,0±6,0), pero hubo un efecto sobre la Experimento 2 La tasa de preñez general fue de 52,2% (145/278). No hubo efecto del tratamiento (P<0,05; CPE: 47,9%, BE: 54,3% , GnRH: 46,3%, CPE+GnRH: 60,0%) sobre la tasa de preñez a la IATF, pero hubo un efecto del distribución de las mismas (P<0,05), así difirió en las vacas tratadas con GnRH respecto de los otros tratamientos (P<0,05) y hubo una tendencia (P=0,06) a mayor concentración de ovulaciones en las vacas tratadas con CE+GnRH respecto de las que sólo recibieron CPE (Fig. 1). En los tratamientos CPE y GnRH se observó un 10% de ovulaciones tempranas. No hubo efecto del tratamiento sobre el área del CL (3,41±0,56 cm2; rango: 1,80-5,35 cm2) y la concentración plasmática de P4 (4,97±0,42 ng/ml; rango: 2,53- 8,30 ng/ml) en el día 22 (P>0,05).
Tabla 1. Diámetro del folículo dominante al retiro del dispositivo, ovulatorio, tasa de crecimiento del mismo y porcentaje de ovulación en vacas tratadas con diferentes inductores de la ovulación (CPE: Cipionato de estradiol; BE: Benzoato de estradiol; GnRH: Hormona liberadora de gonadotrofinas y CPE + GnRH: Combinación de CPE con GnRH).
^cYv18n2a01.htm! ! N 0 5 6 7 9 ; B D ` v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp3228article62
Fig 1. Distribución de ovulaciones en vacas secas tratadas con protocolos hormonales para IATF y distintos inductores de ovulación
Experimento 2
La tasa de preñez general fue de 52,2% (145/278). No hubo efecto del tratamiento (P<0,05; CPE: 47,9%, BE: 54,3% , GnRH: 46,3%, CPE+GnRH: 60,0%) sobre la tasa de preñez a la IATF, pero hubo un efecto del EO al inicio del tratamiento; así, las vacas que tenían un F<10 mm se preñaron en menor proporción (34,2%, 13/38; P<0,05) respecto de las vacas que tenían un CL (56,8%, 63/111) o un F>10 mm (53,5%, 69/129). La interacción tratamiento x EO no fue significativa (P>0,05)
Discusión
^cYv18n2a01.htm$ $ N 0 5 6 7 9 ; B D K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp3531article62En el presente estudio no hubo efecto del tratamiento sobre las variables foliculares evaluadas. Resultados similares fueron observados por Meneghetti et al. (2009) en vacas Nelore, quienes informaron que la administración de BE, CPE o GnRH, no afectan las características evaluadas. Esto coincide con lo encontrado en la literatura6 e indica que estos inductores de la ovulación no afectan la dinámica folicular.
Las concentraciones plasmáticas de P4 fueron similares entre los tratamientos pero difirieron entre días. Así, fueron mayores en el día 8 respecto de los días siguientes, indicando que el retiro de los DIV y la administración de PGF efectivamente inducen el descenso de los niveles de P4. Adicionalmente, la concentración de P4 no fue diferente entre tratamientos, indicando que todas las vacas que ovularon, independiente del tratamiento, desarrollaron un CL funcional, alcanzando niveles de P4 por encima de 1 ng/ml1.
Los inductores de la ovulación utilizados no afectaron el tiempo medio de ovulación, lo cual coincide con reportes previos12, 13. Sin embargo, la distribución de las ovulaciones difirió, lo cual es el principal hallazgo del presente estudio. Las vacas tratadas con GnRH ovularon de forma más dispersa. Esto pudo deberse a la falta de estradiol exógeno que provee un soporte hormonal adecuado durante el proestro a fin de obtener un adecuado pico de LH y ovulación11.
El efecto de diferentes inductores de la ovulación sobre la ovulación ha sido reportado previamente en vacas B. indicus con cría12. Según este estudio la distribución de ovulaciones es similar entre sales de estradiol. Sin embargo, en un estudio reciente se indicó que el CE produce una mayor dispersión de las ovulaciones con una menor tasa de preñez en vacas secas respecto del BE14.
En el presente estudio, la combinación de tratamientos CPE+GnRH, mostró una tendencia a producir una mejor distribución de ovulaciones respecto de las vacas que solo recibieron CPE. Luego de administrar BE a las 24 h de retirado el dispositivo con progesterona o CPE en dicho momento se produce un pico de LH entre las 44 y 50 h, respectivamente12; no obstante, al recibir la GnRH pudo haber ocurrido un fortalecimiento de dicho pico que mejoró la distribución de las ovulaciones que ocurrieron en el grupo CPE, por adelantamiento de la mayoría de aquellas que se producirían a la hora 90. No obstante, este efecto no siempre ocurriría ya que hubo un 10% de las ovulaciones que se produjeron a la hora 120.
Con respecto al porcentaje de preñez, Sá Filho et al. (2011) no encontraron diferencias utilizando CPE (48,3%), BE (40,6%) o GnRH (48,7%) en vaquillonas Nelore, o empleando CPE (51,8%), GnRH (50,9%) y CPE+GnRH (54,9%) en vacas Nelore con cría; en concordancia con los resultados observados en el presente trabajo.
Si bien se observaron ovulaciones tempranas (un 10% a la hora 42) en los grupos CPE y GnRH, estas no repercutieron negativamente en el porcentaje de preñez, a pesar que Roelofs et al. (2006), indicaron que la tasa de fertilización decrece drásticamente cuando la IA se realiza después de ocurrida la ovulación. Cabe señalar que este adelantamiento de las ovulaciones ya ha sido observado en trabajos previos3. Por otro lado, se ha estimado que la máxima viabilidad espermática en el tracto reproductivo de la hembra es de 24-30 h4. Por lo tanto es de esperar que una asincronía entre las vacas que ovulan a las 90 o 102 h, y la llegada de espermatozoides viables capaces de fecundar resulten en un descenso de la tasa de preñez en las vacas tratadas con CPE y GnRH en el Experimento 2. Sin embargo, esto no ocurrió. Posiblemente, puede haber ocurrido que el semen utilizado en el presente estudio fue de una calidad suficiente como para compensar las diferencias en la distribución de ovulaciones, permaneciendo viable durante la ventana de ovulación.
Conclusión
^cYv18n2a01.htm & & N 0 5 6 7 9 ; B D 5 y v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp3733article62La administración de GnRH en vacas que reciben CPE al retiro de los DIV tiende a concentrar las ovulaciones, pero no tiene influencia sobre la dinámica folicular, función luteal y la tasa de preñez a la IATF.
^cYv18n2a01.htm ' ' N 0 5 6 7 9 ; B D ~ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp3834article62 ^cYv18n2a01.htm( ( T 0 5 6 7 9 ; B xD E 0 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp3935article6211. Bicalho, RC.; Galvao, KN.; Guard, CL.; Santos, JEP. Optimizing the accuracy of detecting a functional corpus luteum in dairy cows. Theriogenology 2008; 70: 199-207. ^cYv18n2a01.htm) ) N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp4036article62
^cYv18n2a01.htm * * T 0 5 6 7 9 ; B xD E ? v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp4137article6222. Carvalho, JBP.; Carvalho, NAT.; Reis, EL.; Nichi, M.; Souza, AH.; Baruselli, PS. Effect of early luteolysis in progesterone-based timed AI protocols in Bos indicus, Bos indicus x Bos taurus, and Bos taurus heifers. Theriogenology 2008; 69: 167-175. ^cYv18n2a01.htm+ + N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp4238article62
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^cYv18n2a01.htm : : T 0 5 6 7 9 ; B xD F X v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp5753article621010. Sá Filho, MF.; Ayres, H.; Ferreira, RM.; et al. Equine chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone enhance fertility in a norgestomet-based, timed artificial insemination protocol in suckled Nelore (Bos indicus) cows. Theriogenology 2010; 73: 651-658. ^cYv18n2a01.htm; ; N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp5854article62
^cYv18n2a01.htm < < T 0 5 6 7 9 ; B xD F O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp5955article621111. Sá Filho, MF.; Santos, JEP.; Ferreira, RM.; Sales, JNS.; Baruselli, PS. Importance of estrus on pregnancy per insemination in suckled Bos indicus cows submitted to estradiol/progesterone-based timed insemination protocols. Theriogenology 2011; 76: 455-463. ^cYv18n2a01.htm = = N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6056article62
^cYv18n2a01.htm > > T 0 5 6 7 9 ; B xD F S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6157article621212. Sales, JNS.; Carvalho, JBP.; Crepaldi, GA.; et al. Effects of two estradiol esters (benzoate and cypionate) on the induction of synchronized ovulations in Bos indicus cows submitted to a timed artificial insemination protocol. Theriogenology 2012; 78: 510-516. ^cYv18n2a01.htm ? ? N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6258article62
^cYv18n2a01.htm @ @ T 0 5 6 7 9 ; B xD F % k v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6359article621313. Souza, AH.; Viechnieski, S.; Lima, FA.; et al. Effects of equine chorionic gonadotropin and type of ovulatory stimulus in a timed-AI protocol on reproductive responses in dairy cows. Theriogenology 2009; 72: 10-21. ^cYv18n2a01.htm A A N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6460article62
^cYv18n2a01.htm B B T 0 5 6 7 9 ; B xD F s v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6561article621414. Uslenghi, G.; González Chaves, S.; Cabodevila, J.; Callejas, S. Effect of estradiol cypionate and amount of progesterone in the intravaginal device on synchronization of estrus, ovulation and on pregnancy rate in beef cows treated with FTAI based protocols. Anim. Reprod. Sci. 2014; 145: 1-7. ^cYv18n2a01.htm C C N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSp6662article62
^cYv18n2a01.htm D D 0 5 6 7 9 : A v C D U e t Q A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc671article141^rND^sBicalho^nRC^rND^sGalvao^nKN^rND^sGuard^nCL^rND^sSantos^nJEPOptimizing the accuracy of detecting a functional corpus luteum in dairy cows^lenTheriogenology220080000200870199-20720161200v18n2a01.htmE E 0 5 6 7 9 : A v C D W j x 0 > A ? @ G K M aT \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc682article142^rND^sCarvalho^nJBP^rND^sCarvalho^nNAT^rND^sReis^nEL^rND^sNichi^nM^rND^sSouza^nAH^rND^sBaruselli^nPSEffect of early luteolysis in progesterone-based timed AI protocols in Bos indicus, Bos indicus x Bos taurus, and Bos taurus heifers^lenTheriogenology220080000200869167-17520161200v18n2a01.htmF F 0 5 6 7 9 : A v C D T f y + A , @ 4 8 : aA I v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc693article143^rND^sColazo^nMG^rND^sKastelic^nJP^rND^sMapletoft^nRJEffects of estradiol cypionate (ECP) on ovarian follicular dynamics, synchrony of ovulation, and fertility in CIDR-based, fixed-time AI programs in beef heifers^lenTheriogenology220030000200360855-86520161200v18n2a01.htm G G 0 5 6 7 9 : A v C D S d *t z : F A G @ O S U a] e v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc704article144^rND^sHiers^nEA^rND^sBarthle^nCR^rND^sDahms^nMKVet al.Synchronization of Bos indicus x Bos taurus cows for timed artificial insemination using gonadotropinreleasing hormone plus prostaglandin F2α in combination with melengestrol acetate^lenJ. Anim. Sci220030000200381830- 83520161200v18n2a01.htm H H $ 0 5 6 7 9 : A v C D R a s L ^ A _ @ g k m at | v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc715article145^rND^sManes^nJ^rND^sAller^nJF^rND^sCallejas^nSS^rND^sHozbor^nF^rND^sAlberio^nRHInfluence of the length of progestagen treatment and the time of oestradiol benzoate application on the ovulatory follicle size and ovulation time in anoestrous and cyclic beef cows^lenReprod. Dom. Anim.220120000201247412-41820161200v18n2a01.htmI I 0 5 6 7 9 : A v C D V i u 0 A 1 @ 9 = ? aD L v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc726article146^rND^sMartinez^nMF^rND^sKastelic^nJP.^rND^sB^nGA^rND^sCaccia^nM^rND^sMapletoft^nRJEffects of oestradiol and some of its esters on gonadotrophin releasing and ovarian follicular dynamics in CIDR-treated beef cattle^lenAnim. Reprod. Sci.22005000020058637-5220161200v18n2a01.htmJ J 0 5 6 7 9 : A v C D W i z - A . @ 6 : < aC K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc737article147^rND^sMeneghetti^nM^rND^sS Filho^nOG^rND^sPeres^nRFG.^rND^sLamb^nGC^rND^sVasconcelos^nJLMFixed-time artificial insemination with estradiol and progesterone for Bos indicus cows I: Basis for development of protocols^lenTheriogenology220090000200972179-18920161200v18n2a01.htm K K 0 5 6 7 9 : A v C D U e v p ( A ) @ 1 5 7 a@ H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc748article148^rND^sRoelofs^nJB^rND^sGraat^nEAM^rND^sMullaart^nE^rND^sSoede^nNM^rND^sVoskamp-Harkema^nV^rND^sKemp^nBEffects of insemination-ovulation interval on fertilization rates and embryo characteristics in dairy cattle^lenTheriogenology2200600002006662173-218120161200v18n2a01.htmL L 0 ~ 0 5 6 7 9 : A v C > D 1 ? u v = w A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc759article149SAS. Institute Inc., SAS/STAT User’s Guide62SAS Institute Inc, Cary19980000199884620161200v18n2a01.htm M M 0 5 6 7 9 ; B v D F X f *x ~ 8 F A G @ O S U a\ d v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7610article1410^rND^sS Filho^nMF^rND^sAyres^nH^rND^sFerreira^nRMet al.Equine chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone enhance fertility in a norgestomet-based, timed artificial insemination protocol in suckled Nelore (Bos indicus) cows^lenTheriogenology220100000201073651-65820161200v18n2a01.htmN N 0 5 6 7 9 ; B v D F X j } : H A I @ Q U W a^ f v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7711article1411^rND^sS Filho^nMF^rND^sSantos,^nJEP^rND^sFerreira^nRM.^rND^sSales^nJNS^rND^sBaruselli^nPSImportance of estrus on pregnancy per insemination in suckled Bos indicus cows submitted to estradiol/progesterone-based timed insemination protocols.^lenTheriogenology220110000201176455-46320161200v18n2a01.htmO O 0 5 6 7 9 ; B v D F V i *{ 4 B A C @ K O Q aX ` v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7812article1412^rND^sSales^nJNS^rND^sCarvalho^nJBP^rND^sCrepaldi^nGAet al.Effects of two estradiol esters (benzoate and cypionate) on the induction of synchronized ovulations in Bos indicus cows submitted to a timed artificial insemination protocol.^lenTheriogenology220120000201278510-51620161200v18n2a01.htmP P 0 5 6 7 9 ; B v D F U i *x ~ A @ $ & a+ 3 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7913article1413^rND^sSouza^nAH^rND^sViechnieski^nS^rND^sLima^nFA.et al.Effects of equine chorionic gonadotropin and type of ovulatory stimulus in a timed-AI protocol on reproductive responses in dairy cows.^lenTheriogenology22009000020097210-2120161200v18n2a01.htm Q Q & 0 5 6 7 9 ; B v D F W o W i A j @ r v y a| v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc8014article1414^rND^sUslenghi^nG^rND^sGonzlez Chaves^nS^rND^sCabodevila^nJ^rND^sCallejas^nSEffect of estradiol cypionate and amount of progesterone in the intravaginal device on synchronization of estrus, ovulation and on pregnancy rate in beef cows treated with FTAI based protocols^lenAnim. Reprod. Sci.22014000020141451-720161200v18n2a01.htm Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSo11article120180306105725v18n2a01.htm80 R R T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSo11article120180306105727v18n2a02.htm S S D3 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M & Q y T 1 V ^ ` e g A h p # z z 1 F Ok F F o p : o B r L q T S ^@U U U U U S GU U U U ! U : u V H [ ] v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSh21article1oaesFVET14.0ILUSTAB02invet060ndInVet18220161200^f307^l3161668-3498Effect of xanthine-xanthine oxidase-catalase system on bovine sperm oxidative metabolism during capacitation induction^len^rND^1A01 A03^sCasas^nE.^rND^1A01 A03^sMarqunez^nA.^rND^1A01 A02 A03^sCrdoba^nM.UBA^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Instituto de Investigacin y Tecnologa en Reproduccin AnimalUBA^iA02^1CONICETUniversidad de Buenos Aires^iA03^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Qumica Biolgica^cBuenos Aires2016092020/09/20162017010701/07/2017^len^aThe aim of this work was to study the effect of heparin or xanthine-xanthine oxidase-catalase system (superoxide anion generating system) on the induction of capacitation, sperm oxygen uptake, the variation in the activity of creatine kinase-B in bovine spermatozoa and tyrosine kinase and protein kinase C regulation with heparin. Genistein and GF 109203X were used as specific inhibitors of tyrosine kinase and protein kinase C, respectively. Creatine kinase-B activity and lipid peroxidation were registered spectrophotometrically. Oxygen uptake was measured polarographically. Capacitation was evaluated by chlortetracycline technique and viability by trypan blue stain. Data were analyzed by ANOVA and Tukey test. Lipid peroxidation was modified by treatments (P<0.05). In sperm capacitated with heparin the addition of genistein or GF 109203X, provoked a decrease in creatine kinase-B activity, oxygen uptake and capacitation rates (P<0.05). In the presence of xanthine-xanthine oxidase/catalase system, capacitation and oxygen uptake presented a significant decrease at 15 and 45 min compared to heparin treatment but creatine kinase-B activity only presented a decrease at 45 min (P<0.05). To conclude, in cryopreserved bovine spermatozoa heparin capacitation is related to a respiratory burst and a decrease in creatine kinase-B activity, both processes dependent of tyrosine kinase and protein kinase C regulation. Superoxide anion induces sperm capacitation and lipid peroxidation, which can provoke mitochondrial membrane alteration, depending on the incubation time. This deleterious effect may modify the respiratory chain function with a concomitant reduction in creatine kinase-B activity, an enzyme of the cytosol- mitochondria shuttle, not allowing the sperm to reach the energetic state necessary to achieve fertilizing capability.^dnd^i1^tm^len^kCapacitation^i1^tm^len^kMetabolism^i1^tm^len^kBovine spermatozoa;^i1^tm^len^kSuperoxide anion^i1Efecto del sistema xanthine-xanthine oxidase-catalasa en el metabolismo oxidante de esperma bovina durante la induccin de la capacitacin^les^les^aEl objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de heparina o el sistema xantina-xantino oxidase catalase (sistema generador de anin superxido) en la induccin de la capacitacin, consumo de oxgeno, la variacin de la actividad de creatina quinasa B, y su regulacin por tirosina quinasa y protena quinasa C en presencia de heparina. Genisteina y GF 109203X fueron usados como inhibidores especficos de la tirosina quinasa y protena quinasa C respectivamente. La actividad de creatina quinasa-B y la lipoperoxidacin fueron registradas espectrofotomtricamente. El consumo de oxgeno fue polarogrficamente. Se evalu viabilidad e integridad acrosomal por la coloracin de azul tripn y microscopia ptica de Contraste Diferencial Interferencial y la capacitacin por la coloracin epifluorescente de Clorotetraciclina (CTC). Los datos fueron analizados por ANOVA y test de Tukey (P<0,05). La lipoperoxidacin se modific debido a los tratamientos (P<0.05). En la capacitacin espermtica con heparina la adicin de genisteina o GF 109203X provoc una disminucin de la actividad creatina quinasa B, toma de oxgeno y el porcentaje de capacitacin (P<0.05). En la presencia del sistema xantina-xantino oxidase catalase, la capacitacin y el consumo de oxgeno presentaron una disminucin significativa a los 15 y 45 minutos, comparados con el valor del tratamiento con heparina, pero la actividad de la creatina quinasa B slo disminuy a los 45 minutos (P<0.05). En conclusin, la capacitacin con heparina est vinculada con burst respiratorio y con la disminucin de la creatina quinasa B, ambos procesos dependientes de la protena quinasa C. El anin superxido induce la capacitacin espermtica y la lipoperoxidacin lo cual provoca una alteracin dependiente del tiempo de incubacin. Este efecto deletreo puede modificar el funcionamiento de la cadena respiratoria con la concomitante reduccin de la actividad de la creatina quinasa B, enzima de la lanzadera citoslica-mitocondrial, impidiendo que el espermatozoide tenga la carga energtica necesaria para adquirir su capacidad fertilizante.^dnd^i2^tm^les^kCapacitacin^i2^tm^les^kMetabolismo^i2^tm^les^kEspermatozoide bovino^i2^tm^les^kAnin superxido^i2other43v18n2a02.htm T T D3 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M & Q y T 1 V ^ ` e g A h p # z 8 F Vk F F o p A o I r S q [ S eIU U U U U S SU U U , U C! U d u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUSTAB02invet060ndInVet18220161200^f307^l3161668-3498Effect of xanthine-xanthine oxidase-catalase system on bovine sperm oxidative metabolism during capacitation induction^len^rND^1A01 A03^sCasas^nE.^rND^1A01 A03^sMarqunez^nA.^rND^1A01 A02 A03^sCrdoba^nM.UBA^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Instituto de Investigacin y Tecnologa en Reproduccin AnimalUBA^iA02^1CONICETUniversidad de Buenos Aires^iA03^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Qumica Biolgica^cBuenos Aires2016092020/09/20162017010701/07/2017^len^aThe aim of this work was to study the effect of heparin or xanthine-xanthine oxidase-catalase system (superoxide anion generating system) on the induction of capacitation, sperm oxygen uptake, the variation in the activity of creatine kinase-B in bovine spermatozoa and tyrosine kinase and protein kinase C regulation with heparin. Genistein and GF 109203X were used as specific inhibitors of tyrosine kinase and protein kinase C, respectively. Creatine kinase-B activity and lipid peroxidation were registered spectrophotometrically. Oxygen uptake was measured polarographically. Capacitation was evaluated by chlortetracycline technique and viability by trypan blue stain. Data were analyzed by ANOVA and Tukey test. Lipid peroxidation was modified by treatments (P<0.05). In sperm capacitated with heparin the addition of genistein or GF 109203X, provoked a decrease in creatine kinase-B activity, oxygen uptake and capacitation rates (P<0.05). In the presence of xanthine-xanthine oxidase/catalase system, capacitation and oxygen uptake presented a significant decrease at 15 and 45 min compared to heparin treatment but creatine kinase-B activity only presented a decrease at 45 min (P<0.05). To conclude, in cryopreserved bovine spermatozoa heparin capacitation is related to a respiratory burst and a decrease in creatine kinase-B activity, both processes dependent of tyrosine kinase and protein kinase C regulation. Superoxide anion induces sperm capacitation and lipid peroxidation, which can provoke mitochondrial membrane alteration, depending on the incubation time. This deleterious effect may modify the respiratory chain function with a concomitant reduction in creatine kinase-B activity, an enzyme of the cytosol- mitochondria shuttle, not allowing the sperm to reach the energetic state necessary to achieve fertilizing capability.^dnd^i1^tm^len^kCapacitation^i1^tm^len^kMetabolism^i1^tm^len^kBovine spermatozoa;^i1^tm^len^kSuperoxide anion^i1Efecto del sistema xanthine-xanthine oxidase-catalasa en el metabolismo oxidante de esperma bovina durante la induccin de la capacitacin^les^les^aEl objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de heparina o el sistema xantina-xantino oxidase catalase (sistema generador de anin superxido) en la induccin de la capacitacin, consumo de oxgeno, la variacin de la actividad de creatina quinasa B, y su regulacin por tirosina quinasa y protena quinasa C en presencia de heparina. Genisteina y GF 109203X fueron usados como inhibidores especficos de la tirosina quinasa y protena quinasa C respectivamente. La actividad de creatina quinasa-B y la lipoperoxidacin fueron registradas espectrofotomtricamente. El consumo de oxgeno fue polarogrficamente. Se evalu viabilidad e integridad acrosomal por la coloracin de azul tripn y microscopia ptica de Contraste Diferencial Interferencial y la capacitacin por la coloracin epifluorescente de Clorotetraciclina (CTC). Los datos fueron analizados por ANOVA y test de Tukey (P<0,05). La lipoperoxidacin se modific debido a los tratamientos (P<0.05). En la capacitacin espermtica con heparina la adicin de genisteina o GF 109203X provoc una disminucin de la actividad creatina quinasa B, toma de oxgeno y el porcentaje de capacitacin (P<0.05). En la presencia del sistema xantina-xantino oxidase catalase, la capacitacin y el consumo de oxgeno presentaron una disminucin significativa a los 15 y 45 minutos, comparados con el valor del tratamiento con heparina, pero la actividad de la creatina quinasa B slo disminuy a los 45 minutos (P<0.05). En conclusin, la capacitacin con heparina est vinculada con burst respiratorio y con la disminucin de la creatina quinasa B, ambos procesos dependientes de la protena quinasa C. El anin superxido induce la capacitacin espermtica y la lipoperoxidacin lo cual provoca una alteracin dependiente del tiempo de incubacin. Este efecto deletreo puede modificar el funcionamiento de la cadena respiratoria con la concomitante reduccin de la actividad de la creatina quinasa B, enzima de la lanzadera citoslica-mitocondrial, impidiendo que el espermatozoide tenga la carga energtica necesaria para adquirir su capacidad fertilizante.^dnd^i2^tm^les^kCapacitacin^i2^tm^les^kMetabolismo^i2^tm^les^kEspermatozoide bovino^i2^tm^les^kAnin superxido^i2other43v18n2a02.htm U U $ P5 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y & ] y ` 1 b j l q s A t | # z ; F Xm F F q p I o Q r [ q c S m@U U U U U S GU U U U (! U I u e H j l x\ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilustab02invet060ndInVet18220161200^f307^l3161668-3498Effect of xanthine-xanthine oxidase-catalase system on bovine sperm oxidative metabolism during capacitation induction^len^rND^1A01 A03^sCasas^nE^rND^1A01 A03^sMarqunez^nA^rND^1A01 A02 A03^sCrdoba^nM^iA01^1UBA^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Instituto de Investigacin y Tecnologa en Reproduccin Animal^iA02^1UBA^2CONICET^iA03^1Universidad de Buenos Aires^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Ctedra de Qumica Biolgica^cBuenos Aires2016092020/09/20162017010701/07/2017^len^aThe aim of this work was to study the effect of heparin or xanthine-xanthine oxidase-catalase system (superoxide anion generating system) on the induction of capacitation, sperm oxygen uptake, the variation in the activity of creatine kinase-B in bovine spermatozoa and tyrosine kinase and protein kinase C regulation with heparin. Genistein and GF 109203X were used as specific inhibitors of tyrosine kinase and protein kinase C, respectively. Creatine kinase-B activity and lipid peroxidation were registered spectrophotometrically. Oxygen uptake was measured polarographically. Capacitation was evaluated by chlortetracycline technique and viability by trypan blue stain. Data were analyzed by ANOVA and Tukey test. Lipid peroxidation was modified by treatments (P<0.05). In sperm capacitated with heparin the addition of genistein or GF 109203X, provoked a decrease in creatine kinase-B activity, oxygen uptake and capacitation rates (P<0.05). In the presence of xanthine-xanthine oxidase/catalase system, capacitation and oxygen uptake presented a significant decrease at 15 and 45 min compared to heparin treatment but creatine kinase-B activity only presented a decrease at 45 min (P<0.05). To conclude, in cryopreserved bovine spermatozoa heparin capacitation is related to a respiratory burst and a decrease in creatine kinase-B activity, both processes dependent of tyrosine kinase and protein kinase C regulation. Superoxide anion induces sperm capacitation and lipid peroxidation, which can provoke mitochondrial membrane alteration, depending on the incubation time. This deleterious effect may modify the respiratory chain function with a concomitant reduction in creatine kinase-B activity, an enzyme of the cytosol- mitochondria shuttle, not allowing the sperm to reach the energetic state necessary to achieve fertilizing capability.^dnd^i1^tm^len^kCapacitation^i1^tm^len^kMetabolism^i1^tm^len^kBovine spermatozoa;^i1^tm^len^kSuperoxide anion^i1Efecto del sistema xanthine-xanthine oxidase-catalasa en el metabolismo oxidante de esperma bovina durante la induccin de la capacitacin^les^les^aEl objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de heparina o el sistema xantina-xantino oxidase catalase (sistema generador de anin superxido) en la induccin de la capacitacin, consumo de oxgeno, la variacin de la actividad de creatina quinasa B, y su regulacin por tirosina quinasa y protena quinasa C en presencia de heparina. Genisteina y GF 109203X fueron usados como inhibidores especficos de la tirosina quinasa y protena quinasa C respectivamente. La actividad de creatina quinasa-B y la lipoperoxidacin fueron registradas espectrofotomtricamente. El consumo de oxgeno fue polarogrficamente. Se evalu viabilidad e integridad acrosomal por la coloracin de azul tripn y microscopia ptica de Contraste Diferencial Interferencial y la capacitacin por la coloracin epifluorescente de Clorotetraciclina (CTC). Los datos fueron analizados por ANOVA y test de Tukey (P<0,05). La lipoperoxidacin se modific debido a los tratamientos (P<0.05). En la capacitacin espermtica con heparina la adicin de genisteina o GF 109203X provoc una disminucin de la actividad creatina quinasa B, toma de oxgeno y el porcentaje de capacitacin (P<0.05). En la presencia del sistema xantina-xantino oxidase catalase, la capacitacin y el consumo de oxgeno presentaron una disminucin significativa a los 15 y 45 minutos, comparados con el valor del tratamiento con heparina, pero la actividad de la creatina quinasa B slo disminuy a los 45 minutos (P<0.05). En conclusin, la capacitacin con heparina est vinculada con burst respiratorio y con la disminucin de la creatina quinasa B, ambos procesos dependientes de la protena quinasa C. El anin superxido induce la capacitacin espermtica y la lipoperoxidacin lo cual provoca una alteracin dependiente del tiempo de incubacin. Este efecto deletreo puede modificar el funcionamiento de la cadena respiratoria con la concomitante reduccin de la actividad de la creatina quinasa B, enzima de la lanzadera citoslica-mitocondrial, impidiendo que el espermatozoide tenga la carga energtica necesaria para adquirir su capacidad fertilizante.^dnd^i2^tm^les^kCapacitacin^i2^tm^les^kMetabolismo^i2^tm^les^kEspermatozoide bovino^i2^tm^les^kAnin superxido^i2other43v18n2a02.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200002V V " N 0 5 6 7 8 9 @ C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp51article138ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a02.htmW W d N 0 5 6 7 8 9 @ C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp62article138Effect of xanthine-xanthine oxidase-catalase system on bovine sperm oxidative metabolism during capacitation induction
^cYv18n2a02.htm X X L N 0 5 6 7 8 9 @ C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp73article138Casas, E.1,3; Marquínez, A.1,3; Córdoba, M.1,2,3
^cYv18n2a02.htmY Y : N 0 5 6 7 8 9 @ C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp84article1381Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (FVET-UBA)
2Unidad ejecutora de Investigaciones en Producción Animal UBA-CONICET.
3Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Veterinarias, Cátedra de Química Biológica.
Correspondencia e-mail: Mariana Córdoba mcordoba@fvet.uba.ar
^cYv18n2a02.htm [ [ 0 N 0 5 6 7 9 : A D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp106article138Recibido: 20/09/2016
Aceptado: 01/07/2017
Summary
^cYv18n2a02.htm ] ] * N 0 5 6 7 9 : A D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp128article138The aim of this work was to study the effect of heparin or xanthine-xanthine oxidase-catalase system (superoxide anion generating system) on the induction of capacitation, sperm oxygen uptake, the variation in the activity of creatine kinase-B in bovine spermatozoa and tyrosine kinase and protein kinase C regulation with heparin. Genistein and GF 109203X were used as specific inhibitors of tyrosine kinase and protein kinase C, respectively. Creatine kinase-B activity and lipid peroxidation were registered spectrophotometrically. Oxygen uptake was measured polarographically. Capacitation was evaluated by chlortetracycline technique and viability by trypan blue stain. Data were analyzed by ANOVA and Tukey test. Lipid peroxidation was modified by treatments (P<0.05). In sperm capacitated with heparin the addition of genistein or GF 109203X, provoked a decrease in creatine kinase-B activity, oxygen uptake and capacitation rates (P<0.05). In the presence of xanthine-xanthine oxidase/catalase system, capacitation and oxygen uptake presented a significant decrease at 15 and 45 min compared to heparin treatment but creatine kinase-B activity only presented a decrease at 45 min (P<0.05). To conclude, in cryopreserved bovine spermatozoa heparin capacitation is related to a respiratory burst and a decrease in creatine kinase-B activity, both processes dependent of tyrosine kinase and protein kinase C regulation. Superoxide anion induces sperm capacitation and lipid peroxidation, which can provoke mitochondrial membrane alteration, depending on the incubation time. This deleterious effect may modify the respiratory chain function with a concomitant reduction in creatine kinase-B activity, an enzyme of the cytosol- mitochondria shuttle, not allowing the sperm to reach the energetic state necessary to achieve fertilizing capability.
^cYv18n2a02.htm^ ^ 8 N 0 5 6 7 9 : A D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp139article138Key words: Capacitation; Metabolism; Bovine spermatozoa; Superoxide anion
^cYv18n2a02.htm _ _ N 0 5 6 7 9 ; B E 4 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp1410article138Efecto del sistema xanthine-xanthine oxidase-catalasa en el metabolismo oxidante de esperma bovina durante la inducción de la capacitación
^cYv18n2a02.htm` ` N 0 5 6 7 9 ; B E W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp1511article138Resumen
^cYv18n2a02.htma a N 0 5 6 7 9 ; B E @ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp1612article138El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de heparina o el sistema xantina-xantino oxidase catalase (sistema generador de anión superóxido) en la inducción de la capacitación, consumo de oxígeno, la variación de la actividad de creatina quinasa B, y su regulación por tirosina quinasa y proteína quinasa C en presencia de heparina. Genisteina y GF 109203X fueron usados como inhibidores específicos de la tirosina quinasa y proteína quinasa C respectivamente. La actividad de creatina quinasa-B y la lipoperoxidación fueron registradas espectrofotométricamente. El consumo de oxígeno fue polarográficamente. Se evaluó viabilidad e integridad acrosomal por la coloración de azul tripán y microscopia óptica de Contraste Diferencial Interferencial y la capacitación por la coloración epifluorescente de Clorotetraciclina (CTC). Los datos fueron analizados por ANOVA y test de Tukey (P<0,05). La lipoperoxidación se modificó debido a los tratamientos (P<0.05). En la capacitación espermática con heparina la adición de genisteina o GF 109203X provocó una disminución de la actividad creatina quinasa B, toma de oxígeno y el porcentaje de capacitación (P<0.05). En la presencia del sistema xantina-xantino oxidase catalase, la capacitación y el consumo de oxígeno presentaron una disminución significativa a los 15 y 45 minutos, comparados con el valor del tratamiento con heparina, pero la actividad de la creatina quinasa B sólo disminuyó a los 45 minutos (P<0.05).
En conclusión, la capacitación con heparina está vinculada con burst respiratorio y con la disminución de la creatina quinasa B, ambos procesos dependientes de la proteína quinasa C. El anión superóxido induce la capacitación espermática y la lipoperoxidación lo cual provoca una alteración dependiente del tiempo de incubación. Este efecto deletéreo puede modificar el funcionamiento de la cadena respiratoria con la concomitante reducción de la actividad de la creatina quinasa B, enzima de la lanzadera citosólica-mitocondrial, impidiendo que el espermatozoide tenga la carga energética necesaria para adquirir su capacidad fertilizante.
Palabras clave: Capacitación; Metabolismo; Espermatozoide bovino; Anión superóxido.
Introduction
^cYv18n2a02.htmd d N 0 5 6 7 9 ; B E % j v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp1915article138Capacitation is a process that prepares spermatozoa for acquiring fertilizing capability. Extensive research has been developed in order to elucidate the protein phosphorylation event during sperm capacitation and acrosome reaction wherein three pathways are mainly involved: cAMP/Protein kinase A (PKA), receptor tyrosine kinases, and non-receptor protein tyrosine kinases 1,2,3,4. It is known that the phosphorylation of sperm proteins is an important aspect of capacitation and has been associated with sperm hypermotility, ZP binding and acrosome reaction 5,6. In mammalian spermatozoa, capacitation is dependent on tyrosine kinase and protein kinase C activities and the variation of intracellular calcium concentration 7,8,9. During the course of capacitation and fertilization, the main tyrosine- phosphorylated proteins are located in the flagellum, while they are less abundant in the sperm head10.
Protein kinase C (PKC) roles in spermatozoa have been widely investigated in many species.
This enzyme participates in many sperm functions, i.e. capacitation, acrosome reaction, and sperm motility11. It has been demonstrated that PKA activation leads to PKC inhibition11 and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activation, allowing actin polymerization12. Moreover, a role for PI3K in sperm capacitation and acrosome reaction has been described13.
Many of the intracelullar signals that occur during capacitation and acrosome reaction are regulated by the redox state of the sperm14. Futhermore, it was demonstrated that the induction of capacitation, acrosome reaction and hyperactivation are associated with superoxide anion and hydrogen peroxide 15,16,17. Xanthinexanthine oxidase / catalase system may be used to generate both types of ROS in bovine cryopreserved spermatozoa in vitro18.
The excessive production of superoxide and hydrogen peroxide in the spermatozoa can initiate peroxidation. As a consequence, spermatozoa that have suffered oxidative stress would be characterized by the accumulation of lipid hydroperoxides in their plasma membranes, which would be relatively stable until induced to decompose and liberate malondialdehyde upon addition of the ferrous ion promoter used in the TBA assay. The build-up of lipid hydroperoxides in the sperm plasma membrane clearly had a profound negative impact on sperm function 19.
There is evidence that capacitation is part of an oxidative process. In bovine spermatozoa, heparin induces capacitation and this process involves NADPH oxidase activity, intracellular calcium increase and a respiratory burst 17, 20. It was also suggested that a certain ROS level and high respiratory activity in heparin-treated spermatozoa may be the factors associated with the alteration of the phosphocreatine/creatine shuttle function8.
It has been demonstrated that in cryopreserved bovine spermatozoa, mitochondria preserve respiratory coupling for ATP synthesis for sperm function. Creatine kinase isoenzymes have been involved in the metabolism of bovine spermatozoa21 and have been found to be specifically located at sites which have a high demand and production of energy22.
In order to contribute to increase the knowledge of the different mechanisms involved in capacitation, the aim of the present work was to determine the influence of xanthine-xanthine oxidase -catalase system in this process, studying tyrosine kinase and PKC regulation, sperm oxygen uptake and creatine kinase-B activity variation, as an enzyme of the phosphocreatine/ creatine shuttle, in cryopreserved bovine spermatozoa.
Materials and methods
Semen collection and freezing
Semen was collected by an artificial vagina from four Holstein bulls (4 to 5 years old) of proven fertility. These bulls were routinely used to provide semen for artificial insemination and they were maintained under uniform nutritional and management conditions throughout the study. The ejaculates were pooled and diluted in a buffer containing 0.20 M Tris, 0.06 M citrate, 0.13 M glycine, 0.06 M fructose, 20% egg yolk and 7% glycerol at a 2:1 ratio. A slow cooling curve at 5ºC (1ºC/min) was performed, and semen was then equilibrated at 5ºC for a further 90 min and then preserved at -196ºC in liquid nitrogen21.
Sperm suspension
Pooled frozen semen samples collected from the four bulls were thawed for 10 minutes at 37ºC in TALP medium (99 mM NaCl, 3.1 mM KCl, 0.35 mM NaH2PO4.H2O, 1.1 mM MgCl2. H2O, 25 mM NaHCO3, 1 mM sodium pyruvate, 21.6 mM sodium lactate, and 10 mM HEPES) without bovine serum albumin (BSA) or calcium. The vigor score and the percentage of cells with progressive motility were evaluated at 38ºC using light microscopy. Samples with 60% average progressive motility and a 3 to 4 (scale 0 to 5) vigor score of were considered suitable for the experiments. Sperm concentration was determined by hematocytometry in a Neubauer chamber. Subsequent to the evaluation of motility, the samples were centrifuged (600 x g for 5 minutes) and resuspended in TALP with 2.1 mM calcium chloride and 6 mg/mL BSA. In order to induce capacitation, this sample suspension was incubated at 38ºC in the presence of no additional compounds (control), 60 μg/mL heparin 15 min 20,23 or 0.5 mM xanthine ; 0,05 mUI/mL, xanthine oxidase 100 mg/mL, catalase24 at 15 and 45 min incubation.
Sperm viability and acrosome integrity
An aliquot of the sperm suspension taken from each different treatment was incubated with an equal volume of 0.25 % (w/v) Trypan blue in TALP for 15 minutes at 38ºC, centrifuged at 600 g for 10 minutes to remove excess stain and then fixed with 5% formaldehyde in PBS. Acrosomes obtained from the different sperm samples stained with Trypan blue were evaluated by differential interference contrast (DIC) microscopy (200 spermatozoa per sample) in order to assess acrosome integrity in live and dead spermatozoa. To account for spontaneous damage, the value obtained at time zero was subtracted from the values obtained after each treatment17.
Determination of sperm capacitation using chlortetracycline technique
The percentages of capacitation for the different treatments were determined by the epifluorescence chlortetracycline technique. To account for the percentage of spermatozoa with the capacitated pattern induced by freezing and thawing, the percentage of capacitated spermatozoa obtained at zero time was subtracted from results after incubation (for each treatment group) 25.
Preparation of extracts for the measurement of enzymatic activity
Suspensions of capacitated and control spermatozoa were centrifuged at 2000 rpm for 5 min. The pellets were resuspended in distilled water and an aliquot (20 µL) was used to determine sperm concentration. The final sperm concentration was adjusted to 1.0 x 108 spermatozoa/mL. The samples were frozen for 2 h at -20ºC, thawed at room temperature, refrozen (45 min) and thawed again at room temperature. Samples were then centrifuged (17000 rpm for 20 min at 4ºC). Supernatants were used to determine the enzymatic activity of creatine kinase-B. All replicates were processed by the same standard operating procedure to obtain enzymatic extracts; therefore, protein recovery was equivalent in all cases8.
Determination of creatine kinase-B activity
Suspensions of capacitated spermatozoa and controls were centrifuged at 2000 rpm for 5 min. The pellets were resuspended in distilled water, and then treated as described in the section above. Supernatants were used to determine the enzymatic activities of creatine kinase-B at a final sperm concentration of 1.0 x 108 spermatozoa/ mL in a measuring cuvette. Enzymatic activity was measured using 30 mM creatine phosphate as substrate, 2 mM ADP, 20 mM glucose, 2 mM NADP, 2500 U/L hexoquinase, 2000 U/L Glucose-6-phosphate-dehydrogenase, 10 mM Magnesium acetate, 5 mM AMP, 10 mM di-(adenosine 5')-phentaphophate and 20 mmol/L N-acetilcysteine, 200 U/L 6-phosphoglucolactonase, 400 U/L 6-phosphogluconate-dehydrogenase and 100 mM imidazol buffer and concentrations of monoclonal antibody capable of inhibiting 1000 U/L CKM or 2000U/L CKM. The activity was determined spectrophotometrically at 340 nm for 5 min by measuring the reduction of NADP. Enzyme activity was expressed in U/108 spermatozoa. One enzymatic unit of creatine kinase-B was defined as the enzyme quantity which catalyses the transfer of 1.0 mmol of phosphate from phosphocreatine to ADP per minute at pH 7.4 and 37ºC26,27.
Oxygen consumption
Respiration of the sperm suspension was measured polarographically at 38°C with an oxygenelectrode modified Clark type and an Instech Laboratories (Philadelphia, PA, USA) oxygraph. The reaction cell had a 0.6 mL capacity and measured rapid changes in the oxygen consumption rate by the cell. The measurement cuvette was kept at 38°C so that the diffusion of atmospheric oxygen toward the solution could be negligible compared with the rate of oxygen uptake recorded with constant stirring. For evaluation of sperm respiration during capacitation, the final concentration in the cuvette was 1.0 x 108 spermatozoa/mL. Carbanylcyanide- m-chloro phenylhydrazone (CCCP; 0.42 mM) was used as a specific uncoupler of the respiratory chain and oxygen uptake was expressed as mLO2/h/108 spermatozoa17.
Protein kinase C inhibition
The GF 109203X, a specific inhibitor of protein kinase C was used at a 100 nM concentration28. The inhibitor and heparin or xanthine/xanthine-oxidase/catalase system were simultaneously added to the sperm suspension.
Tyrosine kinase inhibition Genistein (150 mM) was used as specific tyrosine kinase inhibitor29. It was added along with heparin or xanthine/xanthine-oxidase/ catalase system to the sperm suspensions and then they were incubated at 38ºC during 15 min.
^cYv18n2a02.htm n n N 0 5 6 7 9 ; B E v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp2925article138Determination of Lipid peroxidation
Samples were incubated to enhanced lipid peroxidation at 37°C in the presence of 0.5 mM sodium ascorbate and 0.11 mM ferrorus sulfate for 2 h. Lipid peroxidation was evaluated as the mean of 2-thiobarbituric acid (TBARS) assay16.
Statistical analysis
Differences of percentages of capacitated spermatozoa, sperm viability, CPK-B activities, oxygen consumption and lipid peroxidation levels between treatments were determined by ANOVA; a Tukey test was used as a post-ANOVA analysis to compare means (STATISTIX 7. 2000, Analytical Software for Windows, Version 7.0; Analytical Software, Tallahassee, Florida, United States). For all analyses P<0.05 was regarded as significant.
Results
^cYv18n2a02.htmq q H N 0 5 6 7 9 ; B E v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp3228article138In the present study, the influence of tyrosine kinase (genistein) or protein kinase C (GF 109203X) inhibitors on heparin capacitation induction as well as their respective oxygen uptake rate were evaluated on bovine spermatozoa. The results indicate that in spermatozoa treated with heparin, the presence of genistein or GF 109203X provoked a significant decrease in the capacitation percentage and sperm oxygen uptake compared to the values obtained with heparin treated samples (P < 0.05) Table 1. No differences were observed in the sperm viability with all treatments (P>0.05)
^cYv18n2a02.htm r r N 0 5 6 7 9 ; B E S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp3329article138Table 1. Capacitation and oxygen uptake in bovine spermatozoa
Bovine spermatozoa were capacitated with heparin 60 μg/mL heparin or 0,5 mM xanthine -0,05 mUI/mL- xanthine oxidase (X-XO/Catalase)- 100 mg/mL catalase. GF 109203X (100 nM) (GF) or Genistein (150 mM) inhibitors of protein kinase C and tyrosine kinase respectively, were added simultaneosly with heparin. Data are expressed as means ± SD, n=7. Different superscripts and symbols indicate significant differences between treatments (P < 0.05).
In sperm suspensions treated with xanthine -xanthine oxidase- catalase system, in both incubation times, spermatozoa were capacitated showing a lower respiration rate respect to heparin treated samples. Furthermore, in these conditions the capacitation decreased (P < 0.05) Table 1.
^cYv18n2a02.htm t t N 0 5 6 7 9 ; B E - r v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp3531article138A decrease in creatine kinase-B activity level was observed in the presence of heparin or xanthine -xanthine oxidase - catalase system in both incubation times respect to sperm control (P < 0.05) Figure 1.
^cYv18n2a02.htmu u N 0 5 6 7 9 ; B E Z v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp3632article138^cYv18n2a02.htmv v N 0 5 6 7 9 ; B E C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp3733article138
Figure 1. Creatine kinase-B activity variation
Data are expressed as means ± SD, n=7. Different superscripts and symbols indicate significant differences between treatments (P<0.05). GF 109203X (100 nM) (GF) or Genistein (150 mM) inhibitors of protein kinase C and tyrosine kinase respectively, were added simultaneosly with heparin. Xanthine-xanthine oxidase-catalase system (X-XO/Catalase) or heparin was used as capacitation inductors. The activity was determined spectrophotometrically at 340 nm over 5 min by measuring the reduction of NADP. Enzyme activity was expressed in International units per 108 spermatozoa (IU x 10-2/108 sp).
^cYv18n2a02.htm x x x N 0 5 6 7 9 ; B E v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp3935article138The addition of genistein or GF 109203X, in order to demonstrate tyrosine kinase and protein kinase C modulation respectively on creatine kinase-B activity during heparin treatment, caused a significant inhibition and an undetectable level of creatine kinase-B activity respectively (P < 0.05) Figure 1.
A significant increase in lipid peroxidation was detected by the addition of xanthine xanthine oxidase/catalase at 45 min respect to controls, heparin treatments and xanthine-xanthine oxidase/catalase addition at 15 min (P < 0.05) Figure 2.
Figure 2. Lipid peroxidation variations in the presence of heparin or xanthine-xanthine oxidase-catalase system
Sperm samples were incubated to enhance lipid peroxidation at 37°C. Lipid peroxidation level was determined as means of 2-thiobarbituric acid (TBARS) assay. Data are expressed as means ± SD, n=7. Different superscripts and symbols indicate significant differences between treatments (P<0.05). Xanthine-xanthine oxidase-catalase system (X-XO/C).
^cYv18n2a02.htm{ { N 0 5 6 7 9 ; B E c v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4238article138 ^cYv18n2a02.htm | | N 0 5 6 7 9 ; B E Z v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4339article138Discussion
^cYv18n2a02.htm } } l N 0 5 6 7 9 ; B E v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4440article138Extensive research has started to elucidate the protein phosphorylation event during sperm capacitation and acrosome reaction, wherein three pathways are mainly involved: cAMP/ PKA, receptor tyrosine kinases and non-receptor protein tyrosine kinases 1,2 which finally produce an increase in the phosphorylation of Tyr residues 3,4.
^cYv18n2a02.htm ~ ~ N
0 5 6 7 9 ; B E f v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4541article138In cryopreserved bovine spermatozoa, pyruvate and lactate are sources of oxidative energy. Oxidative respiration provides the most efficient ATP generation pathway, while the major site of ATP consumption in the spermatozoa is the dynein ATPase, which is associated with the energy consumption in the flagellum 30.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4642article138It is known that the phosphorylation of sperm proteins is an important aspect of capacitation and has been associated with sperm hypermotility, ZP binding and acrosome reaction5,6. In several mammalian species, all the regulatory mechanisms of this event have not been fully elucidated yet.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E Z v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4743article138Therefore, it is important to investigate how tyrosine kinase and protein kinase C (PKC) would be involved in heparin capacitation induction through sperm oxygen uptake and enzymatic activity to know the energy sources related to intracellular signals activation.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E Q v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4844article138In this study, GF 109203X or genistein (PKC and tyrosine kinase inhibitors respectively) provoked a decrease in capacitation induction and in sperm oxygen uptake in heparin treated spermatozoa, so we infer that both kinases may modulate gamete oxidative metabolism related to mitochondrial function, which may be involved in heparin sperm capacitation signals. Identified Tyr-phosphorylated proteins in human sperm include ion channels, metabolic enzymes and structural proteins 31,32. In cryopreserved bovine spermatozoa was studied that tyrosine kinases including SRC-isoform modulate capacitation, where the intracellular calcium variation may be a crucial point related to tyrosine phosphorylation 33.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E 8 } v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp4945article138Genistein inhibition of intracellular heparin mechanisms provoke metabolic changes that result in an energetic charge which is not enough to supply the conditions for glycosaminoglycan induction, inferred by a low oxygen consumption which indicates a decrease in oxidative phosphorylation as a potential source of ATP. This finding agrees with our previous research, which proposes that the heparin induced respiratory burst was produced mainly by mitochondrial activity, the main energy source for the sperm 17. Another energy source for the sperm, the phosphocreatine/creatine shuttle, has been vinculated with oxidative phosphorylation and its regulation through cellular redox state variation has been proposed 34,8. Creatine kinase (CPK) isoenzymes, specifically located at sites of energy demand and production, are linked by a phosphocreatine/creatine circuit 22. Our data suggest that the heparin metabolic pathways including CPK shuttle are modulated by PKC and tyrosine kinase because of the significant CPK-B activity decrease, an enzyme involved in supporting cytosolic ATP, when both regulatory kinases were blocked. So CPK-B activity is required to supply energy for heparin induced capacitation in bovine spermatozoa.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E 5 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp5046article138Furthermore, CPK-B activity in heparin induced capacitation depends mainly on PKC modulation confirmed by the complete inhibition by GF 109203X, but CPK-B activity is also modulated (50%) by the activation of tyrosine kinase.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E ` v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp5147article138As explained above, the major energy requirement in the sperm is related to hypermotility. Preliminary studies on sperm PKC subspecies distribution revealed that they are involved in sperm flagellar motility in human 35 and in bovine spermatozoa 36. It is also noteworthy that during the course of capacitation and fertilization, the main tyrosine-phosphorylated proteins are located in the flagellum 10 and it has been related to mammalian hyperactivated sperm motility 37.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E I v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp5248article138CPK-B activity and oxygen uptake variations in heparin capacitated spermatozoa, due to the localization and compartmentalization of tyrosine kinase and PKC isoforms, may be related to the phosphorylation of substrates in different sperm regions to regulate physiological functions connected with energy sources. So these results suggest that PKC and tyrosine kinase would be related with signaling pathways that maintain both CPK activity level and an active mitochondrial oxidative phosphorylation as energy sources for heparin induced capacitation in the bovine sperm.
^cYv18n2a02.htm H N
0 5 6 7 9 ; B E v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp5349article138The xanthine-xanthine oxidase-catalase system generates superoxide anion that can capacitate bovine sperm 18 and it has been demonstrated that it may improve sperm metabolism and oocyte fertilization in the mouse 38. Data suggest that a lower sperm oxygen consumption induced by xanthine-xanthine oxidase-catalase system compared to respiratory burst produced by heparin, allowing a lower capacitation rate due to the energetic state generated by superoxide anion. As regards creatine kinase-B in the presence of xanthinexanthine oxidase-catalase system, the increase in the incubation time had a negative effect in this enzyme activity, although the capacitation was similar with both incubation times. These results may be due to the deleterious effect of reactive oxygen species (ROS). It is known that despite their potential deleterious effect, ROS at low and controlled levels participate in cell signaling events in sperm physiology, allowing them to acquire fertilizing capability. In fact, in human and bovine sperm, hyperactivation and capacitation are triggered by ROS 18,8,39.
^cYv18n2a02.htm j N
0 5 6 7 9 ; B E v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp5450article138According to Koufen the decrease in mitochondrial CPK activity is caused by an increase in ROS 34, which was detected in the midpiece of sea urchin40 and human spermatozoa 41. The increase in ROS levels produces capacitation decrease in bovine sperm 8. In relation with these observations, our data suggest that more incubation time (45 min) with xanthine-xanthine oxidase-catalase system produces a toxic effect on sperm, confirmed by the increase in lipid peroxidation that caused an alteration in oxygen consumption and CPK-B activity respect to heparin induction. Lipid peroxidation can provoke alterations in the plasma and mitochondrial membranes that may modify the respiratory chain function, with the concomitant reduction in CPK activity, not allowing the bovine sperm to capacitate because of a low energy charge for the process. In accordance with these changes in sperm metabolism, it has been demonstrated that heparin treatment is better than xanthinexanthine oxidase-catalase system to induce highest rates early cleavage in bovine oocytes 42,43.
^cYv18n2a02.htm N
0 5 6 7 9 ; B E d v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSp5551article138In conclusion, in cryopreserved bovine spermatozoa heparin capacitation is related to a respiratory burst and a decrease in CPK-B activity, both processes dependent of tyrosine kinase and protein kinase C regulation. In the conditions of this study, sperm capacitation and lipid peroxidation depending on the incubation time can provoke mitochondrial membrane alteration. This deleterious effect may modify the respiratory chain function, with the concomitant reduction in creatine kinase shuttle, not allowing the sperm to reach the energetic state required to achieve fertilizing capability.
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v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15513article4313^rND^sJungnickel^nMK^rND^sSutton^nKA^rND^sWang^nY^rND^sFlorman^nHMPhosphoinositide - dependent pathways in mouse sperm are regulated by egg ZP3 and drive the acrosome reaction^lenDevelopmental Biology2200700002007304116-2620161200v18n2a02.htm ~ 0 5 6 7 : < C v E G V f t 5 A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15614article4314^rND^sHancok^nJ^rND^sDesikan^nR^rND^sNeill^nSRole of oxygen species in cell signaling pathways^lenBiochem Society Transaction220010000200129345-5020161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G \ k p A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15715article4315^rND^sde Lamirande^nE^rND^sGagnon^nCA positive role for the superoxide anion in triggering hyperactivation and capacitation of human spermatozoa^lenInt J Androl21993000019931621-2520161200v18n2a02.htm 6 0 5 6 7 : < C v E G W g v V e A f @ n r t az v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15816article4316^rND^sAitken^nRJ^rND^sFisher^nHM^rND^sFulton^nN^rND^sGomez^nE^rND^sKnox^nW^rND^sLewis^nB^rND^sIrvin^nSReactive oxygen species generation by human spermatozoa is induced by exogenous NADPH and inhibited by the flavoprotein inhibitor dyphenylene iodonium and quinacrine^lenMol Reprod Dev.219970000199747468-8220161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W d u s A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15917article4317^rND^sCrdoba^nM^rND^sMora^nN^rND^sBeconi^nMT.Respiratory burst and NAD(P)H oxidase activity are involved in capacitation of cryopreserved bovine spermatozoa^lenTheriogenology220060000200665882-9220161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G [ n ~ \ A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16018article4318^rND^sO'Flaherty^nCM^rND^sBeorlegui^nNB^rND^sBeconi^nMTReactive oxygen species requirements for bovine sperm capacitation and acrosome reaction^lenTheriogenology219990000199952289-30120161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W g z ] A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16119article4319^rND^sAitken^nRJ^rND^sHarkiss^nD^rND^sBuckingham^nDRelationship between iron-catalysed lipid peroxidation potential and human sperm function^lenJ Reproduction and Fertility.219930000199398257-6520161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W m G 0 A @ a $ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16220article4320^rND^sCrdoba^nM^rND^sSanta-Coloma^nTA^rND^sBeorlegui^nNB^rND^sBeconi^nMTIntracellular calcium variation in heparin-capacitated bovine sperm^lenBiochemistry and Molecular Biology International219970000199741725-3320161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W f v A @ # ' ) a+ 3 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16321article4321^rND^sCrdoba^nM^rND^sPintos^nL^rND^sBeconi^nMTHeparin and quercetin generate differential metabolic pathways that involve transferases and LDH dehydrogenase in cryopreserved bovine spermatozoa^lenTheriogenology2200700002007676420161200v18n2a02.htm F 0 5 6 7 : < C v E G Y h z f p A q @ y } ~ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16422article4322^rND^sWallimann^nT^rND^sDolder^nM^rND^sSchattner^nU^rND^sEder^nM^rND^sHornemann^nT^rND^sOGorman^nE^rND^sRuck^nA^rND^sBrdiczka^nDSome new aspects of creatine kinase (CK): compartmentation, structure, function and regulation for cellular and mitochondrial bioenergetics and physiology^lenBiofactors21998000019988229-3420161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G U f x A @ $ & a, 4 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16523article4323^rND^sFukui^nY^rND^sSonoyama^nT^rND^sMochizuki^nH^rND^sOno^nHEffects of heparin dosage and sperm capacitation time on in vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes matured in vitro.^lenTheriogenology.219900000199034579-9120161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G Z i { A @ a " v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16624article4324^rND^sO'Flaherty^nC^rND^sBeconi^nM^rND^sBeorlegui^nNEffect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa^lenAndrologia219970000199729269-7520161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G Y h { V A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16725article4325^rND^sBeorlegui^nN^rND^sCetica^nP^rND^sTrinchero^nG,^rND^sCrdoba^nM^rND^sBeconi^nM.Comparative study of functional and biochemical parameters in frozen bovine sperm.^lenAndrologia21997000019972937-4220161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W h x z A @ a" * v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16826article4326^rND^sCourage^nC^rND^sBudworth^nJ^rND^sGescher^nAComparison of ability of protein kinase C inhibitors to arrest cell growth and to alter protein kinase C localisation.^lenBritish Journal of Cancer.219950000199571697-70420161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G S c $ - A . @ 6 : < aC K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16927article4327^rND^sWu^nAH^rND^sBowers^nGNEvaluation and comparison of inmunoinhibition and inmunoprecipitation methods for differentiating MB and BB from macro forms of creatine kinase isoenzymes in patiens and healthy individuals^lenClin Chem2198200001982282017-2120161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G U f u A @ a ( v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17028article4328^rND^sUrdal^nP^rND^sLandmark^nK^rND^sBasmo^nGMMononuclear cell magnesium and retention of magnesium after intravenous loading in patients with acute myocardial infarction^lenScand J Clin Lab Invest219920000199252763-620161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W l { l A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17129article4329^rND^sLeclerc^nP^rND^sde Lamirande^nE^rND^sGagnon^nCRegulation of phosphotyrosine phosphorylation and human sperm capacitation by reactive oxygen derivates.^lenFree Radical Biol and Med2199700001997224643-5620161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W g z A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17230article4330^rND^sStorey^nBT^rND^sKayne^nFJ.Properties of pyruvate kinase and agellar ATPase in rabbit spermatozoa: relation of metabolic strategy of sperm cell^lenJ Exp Zool.2198000001980211361-6720161200v18n2a02.htm \ 0 5 6 7 : < C v E G W i | a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17331article4331^rND^sFicarro^nS^rND^sChertihin^nO^rND^sWestbrook^nVA^rND^sWhite^nF^rND^sJayes^nF^rND^sKalab^nP^rND^sMarto^nJA^rND^sShabanowitz^nJ^rND^sHerr^nJC^rND^sHunt^nDF^rND^sVisconti^nPEPhosphoproteome analysis of capacitated human sperm: Evidence of tyrosine phosphorylation of a kinase-anchoring protein 3 and valosin-containing protein/p97 during capacitation^len20161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W j } b A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17432article4332^rND^sArcelay^nE^rND^sSalicioni^nAM^rND^sWertheimer^nE^rND^sVisconti^nPEIdentification of proteins undergoing tyrosine phosphorylation during mouse sperm capacitation^lenInt J Dev Biol.220080000200852463-7220161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G W h t A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17533article4333^rND^sSatorre^nM^rND^sCrdoba^nM.Involvement of intracellular calcium and src tyrosine-kinase in capacitation of cryopreserved bovine spermatozoa^lenInVet.220100000201012175-8320161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G V c t , 6 A 7 @ ? C F aK S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17634article4334^rND^sKoufen^nP^rND^sRck^nA^rND^sBrdiczka^nD^rND^sWendt^nS^rND^sWallimann^nT^rND^sStark^nGFree radical-induced inactivation of creatine kinase: inuence on octameric and dimeric states of the mitochondrial enzyme (Mi b-CK).^lenBiochem J.2199900001999344413-720161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G U b t Y A @ " % a, 4 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17735article4335^rND^sRotem^nR^rND^sPaz^nGF^rND^sHomonnai^nZT^rND^sKalina^nM^rND^sLax^nY^rND^sBreitbart^nH,^rND^sNaor^nZCalcium-independent induction of acrosome reaction by protein kinase C in human sperm^lenEndocrinology21992000019921312235-4320161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G S f w A @ a! ) v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17836article4336^rND^sLax^nY^rND^sRubinstein^nS^rND^sBreibart^nHSubcellular distribution of protein kinase C alpha and beta I in bovine spermatozoa, and their regulation by calcium and phorbol esters^lenBiol Reprod219970000199756454-920161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G V e v ' ? A @ @ H L N aT \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17937article4337^rND^sNassar^nA^rND^sMahony^nM^rND^sMorshedi^nM^rND^sLin^nMH^rND^sSrisombut^nC^rND^sOehninger^nSModulation of sperm tail protein tyrosine phosphorylation by pentoxifylline and its correlation with hyperactivated motility^lenFertility and sterility.219990000199971919-2320161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G T b q k - # A $ @ , 0 2 3 a8 @ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18038article4338^rND^sLin^nSC^rND^sChen^nMC^rND^sHuang^nAJ^rND^sSalem^nB^rND^sLi^nKCGlucose and its role in generating reactive oxygen species required for mouse sperm fertilizing ability^lenAsian-Australasian Journal of Animal Sciences2200000002000136748-620161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G U d q } A @ a% - v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18139article4339^rND^sChen^nSJ^rND^sAllam^nJP^rND^sDuan^nY^rND^sHaidl^nGInuence of reactive oxygen species on human sperm functions and fertilizing capacity including therapeutical approaches^lenArch Gynecol Obstet.2201300002013288191-920161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G V d q i ( 3 A 4 @ < @ C aJ R v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18240article4340^rND^sKaldis^nP^rND^sStolz^nM^rND^sWyss^nM^rND^sZanolla^nE^rND^sRothen-Rutishauser^nB^rND^sVorherr^nT^rND^sWallimann^nT.Identification of two distinctly localizated mitochondrial creatine kinase isoenzymes in spermatozoa.^lenJ Cell Sci.21996000019961092079-8820161200v18n2a02.htm Z 0 5 6 7 : < C v E G V K A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18341article4341^rND^sMiyaji^nKCreatine kinase isoforms in the seminal plasma and purified human sperm^lenArch Androl.220010000200146127-3420161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G X g j A @ a" * v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18442article4342^rND^sMendes^nJOB^rND^sBurns^nPD^rND^sDe La Torre-Sanchez^nJF^rND^sSeidel^nGE.Effect of heparin on cleavage rates and embryo production with four bovine sperm preparation protocols^lenTheriogenology220030000200360331-4020161200v18n2a02.htm 0 5 6 7 : < C v E G Z j { e A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18543article4343^rND^sBreininger^nE^rND^sCetica^nPD^rND^sBeconi^nMT.Capacitation inducers act through diverse intracellular mechanisms in cryopreserved bovine sperm.^lenTheriogenology2201000002010741036-4920161200v18n2a02.htmR Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSo11article120180306105727v18n2a02.htm185 T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSo11article120180306105728v18n2a03.htm P5 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y Q 1 S [ ] b d A e m # w d 1 F F" F h F p o r q S FU U U U ( U B U _ og S U U U U U $ U @ u Q H V X v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSh21article1oaesFVET14.0ILUS03invet060ndInVet18220161200^f317^l3211668-3498Presencia de cromogranina a en el duodeno fetal y adulto de Myocastor coypus bonariensis (coipo)^les^rND^1A01^sEyheramendy^nV^rND^1A02 A03^sOrtega^nH^rND^1A02 A03^sBaravalle^nC.^rND^1A01^sFelipe^nA.UNCPBA^iA01^1Fac. Cs. VeterinariasUNL^iA02^1Fac. Cs. VeterinariasCONICET^iA032016011010/01/20162016121414/12/2016^les^aEl objetivo de este trabajo fue identificar la presencia y localizacin de clulas secretoras de hormonas en el duodeno del coipo (Myocastor coypus bonariensis) tanto en estadios fetales como en el adulto mediante la utilizacin de un anticuerpo policlonal anticromogranina A. Se trabaj con duodenos de fetos de 60, 75, 90, 105, 120 y 135 das poscoito (dpc) y de adultos. Las muestras se fijaron en formol bufferado al 10%, se procesaron con tcnicas histolgicas de rutina y se efectuaron cortes seriados de 5 mm. Para la determinacin de clulas secretoras de hormonas se utiliz el mtodo avidina-biotina-peroxidasa. En adultos, la cromogranina A fue identificada en clulas subyacentes a los enterocitos del epitelio de revestimiento de las vellosidades y formando parte del epitelio de revestimiento de las criptas de Lieberkhn. En los cortes de duodeno de fetos de 90 dpc se identificaron clulas inmunopositivas localizadas entre las clulas epiteliales. En los fetos de 120 y 135 dpc, las clulas inmunopositivas mostraron una distribucin heterognea y diversidad morfolgica.^dnd^i1^tm^les^kDuodeno^i1^tm^les^kCoipo^i1^tm^les^kCromogranina A^i1^tm^les^kMyocastor coypus;^i1^tm^les^kFeto^i1Presence of chromogranin A in the duodenum of fetal and adult Myocastor coypus bonariensis (coypus)^len^len^aThe aim of the present study was to identify the presence of hormonal secretory cells and localize them in the fetal and adult duodena of the coypu (Myocastor coypus bonariensis), using a polyclonal antibody developed for detection of chromogranin A. Duodena from fetus aging 60, 75, 90, 105, 120 and 135 days post-coitum (dpc), and from adults were used. Samples were fixed and then embedded in paraffin until analysis. Serial cuts of 5 mm were obtained and were processed with routine histological techniques. An immunohistochemical technique (avidin-biotin-peroxidase) was used to detect the hormonal secretory cells. In adults, chromogranin A was identified in cells next to the enterocytes of the surface epithelium of the intestinal villi and in the luminal epithelium of Lieberkhn crypts. In fetal duodenum of 90 dpc, positive cells were detected between the epithelial cells, while in the duodenum of fetus of 120 and 135 dpc, the positive cells were distributed heterogeneously and showing morphological diversity.^dnd^i2^tm^len^kDuodenum;^i2^tm^len^kCoypu^i2^tm^len^kChromogranin A;^i2^tm^len^kMyocastor coypus^i2^tm^len^kFetus^i2other17v18n2a03.htm P5 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y Q 1 S [ ] b d A e m # w k 8 F M" F o F p o r q S FU U U U / U I$ U m }u S U U U U % U @ U \ u m H r t v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUS03invet060ndInVet18220161200^f317^l3211668-3498Presencia de cromogranina a en el duodeno fetal y adulto de Myocastor coypus bonariensis (coipo)^les^rND^1A01^sEyheramendy^nV^rND^1A02 A03^sOrtega^nH^rND^1A02 A03^sBaravalle^nC.^rND^1A01^sFelipe^nA.UNCPBA^iA01^1Fac. Cs. VeterinariasUNL^iA02^1Fac. Cs. VeterinariasCONICET^iA032016011010/01/20162016121414/12/2016^les^aEl objetivo de este trabajo fue identificar la presencia y localizacin de clulas secretoras de hormonas en el duodeno del coipo (Myocastor coypus bonariensis) tanto en estadios fetales como en el adulto mediante la utilizacin de un anticuerpo policlonal anticromogranina A. Se trabaj con duodenos de fetos de 60, 75, 90, 105, 120 y 135 das poscoito (dpc) y de adultos. Las muestras se fijaron en formol bufferado al 10%, se procesaron con tcnicas histolgicas de rutina y se efectuaron cortes seriados de 5 mm. Para la determinacin de clulas secretoras de hormonas se utiliz el mtodo avidina-biotina-peroxidasa. En adultos, la cromogranina A fue identificada en clulas subyacentes a los enterocitos del epitelio de revestimiento de las vellosidades y formando parte del epitelio de revestimiento de las criptas de Lieberkhn. En los cortes de duodeno de fetos de 90 dpc se identificaron clulas inmunopositivas localizadas entre las clulas epiteliales. En los fetos de 120 y 135 dpc, las clulas inmunopositivas mostraron una distribucin heterognea y diversidad morfolgica.^dnd^i1^tm^les^kDuodeno^i1^tm^les^kCoipo^i1^tm^les^kCromogranina A^i1^tm^les^kMyocastor coypus;^i1^tm^les^kFeto^i1Presence of chromogranin A in the duodenum of fetal and adult Myocastor coypus bonariensis (coypus)^len^len^aThe aim of the present study was to identify the presence of hormonal secretory cells and localize them in the fetal and adult duodena of the coypu (Myocastor coypus bonariensis), using a polyclonal antibody developed for detection of chromogranin A. Duodena from fetus aging 60, 75, 90, 105, 120 and 135 days post-coitum (dpc), and from adults were used. Samples were fixed and then embedded in paraffin until analysis. Serial cuts of 5 mm were obtained and were processed with routine histological techniques. An immunohistochemical technique (avidin-biotin-peroxidase) was used to detect the hormonal secretory cells. In adults, chromogranin A was identified in cells next to the enterocytes of the surface epithelium of the intestinal villi and in the luminal epithelium of Lieberkhn crypts. In fetal duodenum of 90 dpc, positive cells were detected between the epithelial cells, while in the duodenum of fetus of 120 and 135 dpc, the positive cells were distributed heterogeneously and showing morphological diversity.^dnd^i2^tm^len^kDuodenum;^i2^tm^len^kCoypu^i2^tm^len^kChromogranin A;^i2^tm^len^kMyocastor coypus^i2^tm^len^kFetus^i2other17v18n2a03.htm 6 \7 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y y ] 1 _ g i n p A q y # d ! < F P$ F t! F p o r q S PU U U 1 U B U \ U y g S U U U U # U > U Z u k H p r ~ \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilus03invet060ndInVet18220161200^f317^l3211668-3498Presencia de cromogranina a en el duodeno fetal y adulto de Myocastor coypus bonariensis (coipo)^les^rND^1A01^sEyheramendy^nV^rND^1A02 A03^sOrtega^nH^rND^1A02 A03^sBaravalle^nC^rND^1A01^sFelipe^nA^iA01^1UNCPBA^2Fac. Cs. Veterinarias^iA02^1UNL^2Fac. Cs. Veterinarias^iA03^1CONICET2016011010/01/20162016121414/12/2016^les^aEl objetivo de este trabajo fue identificar la presencia y localizacin de clulas secretoras de hormonas en el duodeno del coipo (Myocastor coypus bonariensis) tanto en estadios fetales como en el adulto mediante la utilizacin de un anticuerpo policlonal anticromogranina A. Se trabaj con duodenos de fetos de 60, 75, 90, 105, 120 y 135 das poscoito (dpc) y de adultos. Las muestras se fijaron en formol bufferado al 10 por ciento, se procesaron con tcnicas histolgicas de rutina y se efectuaron cortes seriados de 5 mm. Para la determinacin de clulas secretoras de hormonas se utiliz el mtodo avidina-biotina-peroxidasa. En adultos, la cromogranina A fue identificada en clulas subyacentes a los enterocitos del epitelio de revestimiento de las vellosidades y formando parte del epitelio de revestimiento de las criptas de Lieberkhn. En los cortes de duodeno de fetos de 90 dpc se identificaron clulas inmunopositivas localizadas entre las clulas epiteliales. En los fetos de 120 y 135 dpc, las clulas inmunopositivas mostraron una distribucin heterognea y diversidad morfolgica.^dnd^i1^tm^les^kDuodeno^i1^tm^les^kCoipo^i1^tm^les^kCromogranina A^i1^tm^les^kMyocastor coypus;^i1^tm^les^kFeto^i1Presence of chromogranin A in the duodenum of fetal and adult Myocastor coypus bonariensis (coypus)^len^len^aThe aim of the present study was to identify the presence of hormonal secretory cells and localize them in the fetal and adult duodena of the coypu (Myocastor coypus bonariensis), using a polyclonal antibody developed for detection of chromogranin A. Duodena from fetus aging 60, 75, 90, 105, 120 and 135 days post-coitum (dpc), and from adults were used. Samples were fixed and then embedded in paraffin until analysis. Serial cuts of 5 mm were obtained and were processed with routine histological techniques. An immunohistochemical technique (avidin-biotin-peroxidase) was used to detect the hormonal secretory cells. In adults, chromogranin A was identified in cells next to the enterocytes of the surface epithelium of the intestinal villi and in the luminal epithelium of Lieberkhn crypts. In fetal duodenum of 90 dpc, positive cells were detected between the epithelial cells, while in the duodenum of fetus of 120 and 135 dpc, the positive cells were distributed heterogeneously and showing morphological diversity.^dnd^i2^tm^len^kDuodenum;^i2^tm^len^kCoypu^i2^tm^len^kChromogranin A;^i2^tm^len^kMyocastor coypus^i2^tm^len^kFetus^i2other17v18n2a03.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200003 " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp51article62
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a03.htm L N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp62article62Presencia de cromogranina a en el duodeno fetal y adulto de Myocastor coypus bonariensis (coipo)
^cYv18n2a03.htm V N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp73article62Eyheramendy, V1; Ortega, H.2,3; Baravalle, C.2,3; Felipe, A.1
^cYv18n2a03.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp84article621UNCPBA, Fac. Cs. Veterinarias, Área de Cs. Morfológicas, Grupo de Investigaciones Biológicas.
2UNL, Facultad de Cs. Veterinarias, Departamento de Ciencias Morfológicas.
3CONICET.
Correspondencia e-mail: Verónica Eyheramendy veyheramendy@yahoo.com.ar
^cYv18n2a03.htm 0 N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp106article62Recibido: 10/01/2016
Aceptado: 14/12/2016
Resumen
^cYv18n2a03.htm N 0 5 6 7 9 : A C K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp128article62El objetivo de este trabajo fue identificar la presencia y localización de células secretoras de hormonas en el duodeno del coipo (Myocastor coypus bonariensis) tanto en estadios fetales como en el adulto mediante la utilización de un anticuerpo policlonal anticromogranina A. Se trabajó con duodenos de fetos de 60, 75, 90, 105, 120 y 135 días poscoito (dpc) y de adultos. Las muestras se fijaron en formol bufferado al 10%, se procesaron con técnicas histológicas de rutina y se efectuaron cortes seriados de 5 mm. Para la determinación de células secretoras de hormonas se utilizó el método avidina-biotina-peroxidasa. En adultos, la cromogranina A fue identificada en células subyacentes a los enterocitos del epitelio de revestimiento de las vellosidades y formando parte del epitelio de revestimiento de las criptas de Lieberkhün. En los cortes de duodeno de fetos de 90 dpc se identificaron células inmunopositivas localizadas entre las células epiteliales. En los fetos de 120 y 135 dpc, las células inmunopositivas mostraron una distribución heterogénea y diversidad morfológica.
^cYv18n2a03.htm < N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp139article62Palabras clave: Duodeno; Coipo; Cromogranina A; Myocastor coypus; Feto.
^cYv18n2a03.htm X N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp1410article62Presence of chromogranin A in the duodenum of fetal and adult Myocastor coypus bonariensis (coypus)
^cYv18n2a03.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp1511article62Summary
^cYv18n2a03.htm N 0 5 6 7 9 ; B D J v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp1612article62The aim of the present study was to identify the presence of hormonal secretory cells and localize them in the fetal and adult duodena of the coypu (Myocastor coypus bonariensis), using a polyclonal antibody developed for detection of chromogranin A. Duodena from fetus aging 60, 75, 90, 105, 120 and 135 days post-coitum (dpc), and from adults were used. Samples were fixed and then embedded in paraffin until analysis. Serial cuts of 5 mm were obtained and were processed with routine histological techniques. An immunohistochemical technique (avidin-biotin-peroxidase) was used to detect the hormonal secretory cells. In adults, chromogranin A was identified in cells next to the enterocytes of the surface epithelium of the intestinal villi and in the luminal epithelium of Lieberkhün crypts. In fetal duodenum of 90 dpc, positive cells were detected between the epithelial cells, while in the duodenum of fetus of 120 and 135 dpc, the positive cells were distributed heterogeneously and showing morphological diversity.
^cYv18n2a03.htm : N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp1713article62Key words: Duodenum; Coypu; Chromogranin A; Myocastor coypus; Fetus.
Introducción
^cYv18n2a03.htm , N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp1915article62El desarrollo prenatal del tracto gastrointestinal está caracterizado por cambios estructurales y funcionales en el epitelio intestinal que muestra marcadas diferencias en los estadios de maduración entre especies de mamíferos al momento del nacimiento15. La diferenciación citológica del intestino implica modificaciones en sus componentes tisulares y la aparición de tipos celulares específicos como las células endócrinas. De acuerdo con estudios realizados en humanos es posible identificar durante el desarrollo distintas líneas celulares en el epitelio gastrointestinal, entre las que se incluyen células enteroendócrinas13. Para su identificación puede utilizarse la técnica de inmunohistoquímica en secciones de tejido fijado en formol que permite la identificación de cromogranina A3, 13. Las cromograninas son una familia de glicoproteínas sulfatadas presentes en gránulos secretorios de muchas células endocrinas y neuroendocrinas juntamente con aminas y péptidos regulatorios6. Las cromograninas participan en actividades como la inhibición enzimática, son precursoras de péptidos funcionales y junto a otras proteínas sinápticas tienen un papel importante en la biogénesis de gránulos secretorios, incluso en ausencia de hormonas4, 5. Las cromograninas han sido utilizadas en otras especies como un marcador común a todas las células endocrinas. Al presente no existen datos sobre la presencia ni la ontogenia de células endocrinas en el epitelio gastrointestinal del coipo (Myocastor coypus). Este roedor integra el Suborden Hystricognathi que incluye varias especies sudamericanas que son utilizadas como animales de laboratorio (Cavia porcellus, Octodon degu, Cavia aperea, Galea musteloides y Chinchilla laniger). El objetivo de este trabajo fue identificar en el duodeno del coipo en estadios fetales y en el adulto la presencia y localización de células secretoras de hormonas a través de la utilización de un anticuerpo policlonal anticromogranina A.
^cYv18n2a03.htm N 0 5 6 7 9 ; B D : v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2016article62Materiales y métodos
Se trabajó con muestras museológicas de duodenos fetales de 60, 75, 90, 105, 120 y 135 días poscoito (dpc) y de adultos (edad media de 6 ± 1.03 meses) pertenecientes a M. coypus de la subespecie bonariensis. Las muestras, preservadas en formol tamponado, se procesaron con técnicas histológicas de rutina hasta su inclusión en parafina. Se efectuaron cortes seriados de 5 mm que se montaron en portas silanizados. Para la determinación de células secretoras de hormonas se realizó una técnica inmunohistoquímica indirecta2, 10. A los cortes desparafinados se les realizó recuperación antigénica, bloqueos de peroxidasa endógena y de uniones inespecíficas. El tratamiento de recuperación antigénica se realizó en microondas (potencia máxima 1000 W). Como solución se usó buffer citrato 0,01 M pH 6,0, el cual se calentó 3 minutos a 100% de potencia y 12 minutos a 40%, dejando luego enfriar los cortes por 20 minutos en la misma solución. Se utilizó un anticuerpo primario policlonal anticromogranina A (Rabbit Anti-Chromogranin A Polyclonal Antibody-Zymed CAT. Nº 18-0094), un anticuerpo secundario biotinilado, luego estreptavidina-peroxidasa y finalmente la reacción fue revelada utilizando 3,3' diaminobencidina como cromógeno. Se realizó la contracoloración nuclear con hematoxilina activada. Para cada tiempo de desarrollo se determinaron la morfología y el patrón de distribución de células endócrinas. Las microfotografías fueron realizadas con el programa fotográfico LASEZ (Leica Application Suite EZ®). Para la obtención de datos morfométricos se utilizó un analizador con frame graber y software Q-win plus de Leica®. El programa fue calibrado de acuerdo al aumento de las microfotografías.
Resultados
^cYv18n2a03.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ] v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2218article62Etapa adulta:
^cYv18n2a03.htm ! ! N 0 5 6 7 9 ; B D 7 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2319article62La cromogranina A como indicador de la presencia de células secretoras de hormonas fue identificada en células subyacentes a los enterocitos del epitelio de revestimiento de las vellosidades (Fig. 1 A), tanto en lateral de las mismas como en sus bases (Fig. 1 B), y formando parte del epitelio de revestimiento de las criptas de Lieberkhün (Fig. 1 B).
^cYv18n2a03.htm " " t N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2420article62
Figura 1. Microfotografías del duodeno en la etapa adulta mostrando células inmunopositivas (flechas) subyacentes al epitelio de revestimiento en lateral las vellosidades (A) e integrando el epitelio de las criptas (B). 100 x. Barra: 25 μm.
Etapas fetales:
^cYv18n2a03.htm $ $ N 0 5 6 7 9 ; B D M v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2622article62No se observaron células inmunopositivas a cromogranina A en duodenos fetales de 60 y 75 dpc. En los cortes de duodeno a los 90 dpc se identificaron células inmunopositivas a cromogranina A que se localizaron entre las células epiteliales. Mostraron un núcleo redondeado y un tamaño promedio de 20.12 ± 0.6 μm. En los fetos de 120 y 135 dpc las células inmunopositivas para cromogranina A se observaron intercaladas en el epitelio de revestimiento de las caras laterales (Fig. 2 A) y de las bases de las vellosidades (Fig. 2 B), como células basales en el epitelio y en disposición subepitelial A nivel de las criptas, integraron la capa epitelial y se presentaron también como subepiteliales. Con respecto a su morfología, las células localizadas entre los enterocitos fueron de tipo columnar, con una altura media de 22.09 ± 1.23 μm. Las dispuestas en la línea basal del epitelio presentaron forma piramidal y un diámetro medio de 16.22 ± 0.7 μm. Las células subepiteliales mostraron un aspecto ovoidal o estrellado con diámetro medio de 19.55 ± 0.5 μm.
^cYv18n2a03.htm % % N 0 5 6 7 9 ; B D $ h v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2723article62^cYv18n2a03.htm& & N 0 5 6 7 9 ; B D ( l v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp2824article62
Figura 2. Microfotografías de la distribución de células inmunopositivas para cromogranina A en fetos de 135 dpc. Se observan en disposición subepitelial en las caras laterales de las vellosidades (A) y en las criptas (B). 100x. Barra: 25 μm.
Discusión y conclusiones
^cYv18n2a03.htm ) ) d N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSp3127article62Durante el desarrollo el endodermo se diferencia en distintos tipos de células gastrointestinales que originan los diferentes linajes epiteliales, incluyendo las células enteroendócrinas12, 14. El linaje enteroendócrino consiste al menos en 15 tipos celulares que se categorizan sobre la base de su morfología, localización, expresión de hormona peptídica y abundancia de marcadores moleculares específicos8, 11.
Las células endócrinas del intestino constituyen una parte relevante del sistema endócrino difuso. Las mismas presentan dos patrones reguladores de la secreción caracterizados por la presencia de vesículas grandes de núcleo oscuro (large dense core vesicles - LDCV) o microvesículas semejantes a las sinápticas (synaptic-like microvesicles - SLMV). La cromogranina A empleada en este trabajo para identificar la presencia y localización de las células endócrinas duodenales es uno de los marcadores específicos de las LDCV15. En el caso del coipo se identificaron células inmunopositivas a cromogranina A durante el desarrollo fetal. Las mismas estaban dispersas entre las células epiteliales de las vellosidades y entre las células epiteliales de las criptas de Lieberkühn. Durante el desarrollo del intestino en diferentes mamíferos Höcker & Wiedenmann8 observaron, como en el coipo, una distribución topográfica heterogénea de las subpoblaciones de células enteroendocrinas.
La localización y distribución de las células enteroendocrinas han sido objeto de investigación, al igual que su origen. Con respecto a este último aspecto, algunos investigadores sugieren un origen endodérmico en tanto otros les atribuyen ser derivadas de células de las crestas neurales. Los experimentos de seguimiento de linaje demostraron que todos los tipos celulares del epitelio intestinal, incluyendo las células enteroendocrinas, se diferencian de células madre de las criptas y derivan del endodermo1, 11. Gunawardene et al.7, en una extensa revisión bibliográfica, señalan que los trabajos sobre el desarrollo embrionario se las células enteroendocrinas se han efectuado en ratones de laboratorio. En ellos se han identificado al menos tres factores de transcripción que intervienen en la diferenciación de las células enteroendocrinas (Math1, Neurogenin 3 y NeuroD)11. Math1 se activa inicialmente en las criptas y vellosidades intestinales y determina los linajes de todas las células secretoras. La expresion de Neurogenin 3 y NeuroD es necesaria para la diferenciación específica de células enteroendocrinas16. El proceso de diferenciación comienza con la proliferación de células pluripotentes en la base de las criptas y progresa, con la migración de las células hijas, en dirección apical. A nivel del tercio medio de las criptas se ubicaría un área de transición. Las células que continúan avanzando están destinadas a convertirse en enterocitos y células caliciformes, en tanto las que se detienen serían, en general, las enteroendocrinas7. Este patrón de diferenciación y localización de las células enteroendocrinas en un eje basal-apical de las criptas se asocia con un eje proximaldistal en el tracto gastrointestinal que ha sido observado en ratones y en ratas Wistar8.
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^cYv18n2a03.htm M M 0 5 6 7 9 : A v C D T d Z A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc671article171^rND^sBarker,^nN^rND^sClevers^nHTracking down the stem cells of the intestine: strategies to identify adult stem cells^lenGastroenterol.22007000020071331755-6020161200v18n2a03.htm N N 0 5 6 7 9 : A v C D S a *t y v A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc682article172^rND^sCanaff^nL^rND^sBevan^nS^rND^sWheeler^nD.G.et alAnalysis of molecular mechanisms controlling neuroendocrine cell specific transcription of the chromogranin A gene^lenEndocrinol219980000199813931184-9620161200v18n2a03.htm O O 0 5 6 7 9 : A v C D R ` A @ $ ' ( a. 6 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc693article173^rND^sCetil^nG^rND^sGrube^nDInmunoreactivies for chromogranin A and B, and secretogranin II in the guinea pig enteroendocrine system: cellular distributions and intercellular heterogeneities.^lenCell Tissue Res.21991000019912642231-4120161200v18n2a03.htmP P 0 5 6 7 9 : A v C D U d s W A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc704article174^rND^sEl-Salhy^nM^rND^sVaali^nK.^rND^sDizdar^nV^rND^sHausken^nTAbnormal small intestinal endocrine cells in patients with irritable bowel syndrome^lenDig Dis Sci2201000002010553508-1320161200v18n2a03.htm Q Q 0 5 6 7 9 : A v C D U f y f A @ % ) + , a0 8 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc715article175^rND^sEl-Salhy^nM^rND^sGilja^nO.H.^rND^sGundersen^nD.^rND^sHatlebakk^nJ.G.^rND^sHausken^nT.Duodenal Chromogranin A Cell Density as a Biomarker for the Diagnosis of Irritable Bowel Syndrome.^lenGastroenterol Res Pract220140000201418123-620161200v18n2a03.htmR R 0 5 6 7 9 : A v C D R d v c A @ ' + - a4 < v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc726article176^rND^sFacer^nP^rND^sBishop^nA.E.^rND^sLloyd,^nR.V.^rND^sWilson^nB.S.^rND^sHennessy,^nR.J.^rND^sPolak,^nJ.MChromogranin: a newly recognised marker for endocrine cells of the human gastrointestinal tract^lenGastroenterol2198500001985891366-7320161200v18n2a03.htmS S 0 5 6 7 9 : A v C D Z k } ^ A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc737article177^rND^sGunawardene^nA.R^rND^sCorfe^nB.M.^rND^sStaton^nC.A.Classification and functions of enteroendocrine cells of the lower gastrointestinal tract.^lenInt. 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Sci.21991000019911626-3020161200v18n2a03.htmW W 0 5 6 7 9 ; B v D F U i M ) A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc7711article1711^rND^sLee^nC.S.^rND^sKaestner^nK.H.Clinical endocrinology and metabolism: Development of gut endocrine cells^lenBest Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab.2200400002004184453-6220161200v18n2a03.htm X X Z 0 5 6 7 9 ; B v D F U i " A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc7812article1712^rND^sMay^nC.L.^rND^sKaestner^nK.H.Gut Endocrine Cell Development^lenMol Cell Endocrinol.2201000002010323170- 7520161200v18n2a03.htmY Y x 0 5 6 7 9 ; B v D F V g z . A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc7913article1713^rND^sNoah^nT.K.^rND^sDonahue^nB.^rND^sShroyer^nN.F.Intestinal development and differentiation^lenExp Cell Res.2201100002011317192702-1020161200v18n2a03.htmZ Z P 0 5 6 7 9 ; B v D F T ; A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc8014article1714^rND^sPcha^nJDevelopment of intestinal transport function in mammals^lenPhysiol Rev.22000000020008041633-6720161200v18n2a03.htm[ [ 0 5 6 7 9 ; B v D F V k ] A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc8115article1715^rND^sPuzyrev^nA^rND^sIvanova,^nF.V.F^rND^sKostiukevich^nV.S.V.Regularities of cytogenesis in the endocrine gastroenteropancreatic system in vertebrates^lenMorfologa2200300002003124411-920161200v18n2a03.htm \ \ 0 5 6 7 9 ; B v D F T f w O A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc8216article1716^rND^sRindi^nG^rND^sLeiter^nA.B.^rND^sKopin^nA.S.^rND^sBordi^nC^rND^sSolcia^nE.The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences^lenAnn N Y Acad Sci.220040000200410141-1220161200v18n2a03.htm] ] 0 5 6 7 9 ; B v D F Y m } h ( A ) @ 1 5 8 a? G v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc8317article1717^rND^sShroyer^nN.F.^rND^sHelmrath^nM.A.^rND^sWang^nV.Y.^rND^sAntalffy^nB^rND^sHenning^nS.J.^rND^sZoghbi^nH.Y.Intestine-specific ablation of mouse atonal homolog 1 (Math1) reveals a role in cellular homeostasis^lenGastroenterol22007000020071322478-8820161200v18n2a03.htm Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSo11article120180306105728v18n2a03.htm83 ^ ^ T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSo11article120180306105729v18n2a04.htm _ _ 20 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y Q 1 S [ ] b d A e m # w 2 P i F o p o r q S :U U U \ U p U S .U M U T U h U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSh21article1oaesFVET14.0ILUS04invet060ndInVet18220161200^f323^l3311668-3498Determinacin de biomarcadores moleculares en leche y su posible aplicacin en el diagnstico y tratamiento de la mastitis bovina^les^rND^1A01^sCaggiano^nN^rND^1A01^sBottini^nJ.M^rND^1A01^sLorenzo Smirnoff^nA^rND^1A01^sDe Simone^nE.A^rND^1A01^sChiappe Barbar^nM.AUniversidad de Buenos Aires^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Fisiologa Animal^cBuenos Aires2016093030/09/20162017050905/09/2017^les^aLa mastitis es la patologa con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando seriamente a la produccin lctea y la calidad de la leche. Es por eso que en este trabajo se evalu la actividad de las Metaloproteasas 2 y 9, involucradas en la degradacin de la matriz extracelular, en leche de vacas y vaquillonas con mastitis clnica y subclnica y en animales sanos. Se evaluaron tambin distintas fracciones proteicas y la actividad caseinoltica total. Las fracciones proteicas se evaluaron mediante SDS-PAGE y a actividad de las Metaloproteasas 2 y 9 fue evaluada mediante zimografa al igual que la actividad caseinoltica total. Los resultados arrojaron en la actividad caseinoltica total diferencias significativas entre el grupo Streptococcus spp. y los grupos subclnicas y sanas (p<0.05), y tambin se observaron diferencias significativas en cuanto a la casena total entre los mismos grupos (p<0.01). Si bien las Metaloproteasas 2 y 9 en las mastitis clnicas se encontraron aumentadas las mismas no presentaron diferencias significativas.^dnd^i1^tm^les^kMastitis^i1^tm^les^kMetaloproteasas^i1^tm^les^kCasena^i1Molecular biomarkers in determination of milk and its potential application in the diagnosis and treatment of bovine mastitis^len^len^aMastitis is a disease with increased morbidity and mortality within dairy herds, seriously affecting milk production and milk quality. That's why in this work the activity of Metalloproteinase 2 and 9, from milk of cows and heifers with subclinical and clinical mastitis and in healthy animals was evaluated. Total protein fractions and different caseinolytic activity were also evaluated. The activity of Metalloproteinase 2 and 9 was assessed by zymography as caseinolytic activity and total protein fractions by SDS-PAGE. The results showed a large increase in the activity of Metalloproteinase 2 and 9 in clinical mastitis compared with subclinical and healthy animals, these results were not significant due to the large standard deviation due to the large variability among pathogens within the groups. Significant differences were found between the group Streptococcus spp. and sub-clinical and healthy groups in terms of total caseinolytic activity (p <0.05), and significant differences were observed in terms of total casein in the same groups (p <0.01).^dnd^i2^tm^len^kMastitis^i2^tm^len^kMetalloproteinases^i2^tm^len^kCaseine^i2other24v18n2a04.htm` ` 20 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y Q 1 S [ ] b d A e m # w " 9 W p F o p o r q S "@U b U i U } U S :4U n U u U U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUS04invet060ndInVet18220161200^f323^l3311668-3498Determinacin de biomarcadores moleculares en leche y su posible aplicacin en el diagnstico y tratamiento de la mastitis bovina^les^rND^1A01^sCaggiano^nN^rND^1A01^sBottini^nJ.M^rND^1A01^sLorenzo Smirnoff^nA^rND^1A01^sDe Simone^nE.A^rND^1A01^sChiappe Barbar^nM.AUniversidad de Buenos Aires^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Fisiologa Animal^cBuenos Aires2016093030/09/20162017050905/09/2017^les^aLa mastitis es la patologa con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando seriamente a la produccin lctea y la calidad de la leche. Es por eso que en este trabajo se evalu la actividad de las Metaloproteasas 2 y 9, involucradas en la degradacin de la matriz extracelular, en leche de vacas y vaquillonas con mastitis clnica y subclnica y en animales sanos. Se evaluaron tambin distintas fracciones proteicas y la actividad caseinoltica total. Las fracciones proteicas se evaluaron mediante SDS-PAGE y a actividad de las Metaloproteasas 2 y 9 fue evaluada mediante zimografa al igual que la actividad caseinoltica total. Los resultados arrojaron en la actividad caseinoltica total diferencias significativas entre el grupo Streptococcus spp. y los grupos subclnicas y sanas (p<0.05), y tambin se observaron diferencias significativas en cuanto a la casena total entre los mismos grupos (p<0.01). Si bien las Metaloproteasas 2 y 9 en las mastitis clnicas se encontraron aumentadas las mismas no presentaron diferencias significativas.^dnd^i1^tm^les^kMastitis^i1^tm^les^kMetaloproteasas^i1^tm^les^kCasena^i1Molecular biomarkers in determination of milk and its potential application in the diagnosis and treatment of bovine mastitis^len^len^aMastitis is a disease with increased morbidity and mortality within dairy herds, seriously affecting milk production and milk quality. That's why in this work the activity of Metalloproteinase 2 and 9, from milk of cows and heifers with subclinical and clinical mastitis and in healthy animals was evaluated. Total protein fractions and different caseinolytic activity were also evaluated. The activity of Metalloproteinase 2 and 9 was assessed by zymography as caseinolytic activity and total protein fractions by SDS-PAGE. The results showed a large increase in the activity of Metalloproteinase 2 and 9 in clinical mastitis compared with subclinical and healthy animals, these results were not significant due to the large standard deviation due to the large variability among pathogens within the groups. Significant differences were found between the group Streptococcus spp. and sub-clinical and healthy groups in terms of total caseinolytic activity (p <0.05), and significant differences were observed in terms of total casein in the same groups (p <0.01).^dnd^i2^tm^len^kMastitis^i2^tm^len^kMetalloproteinases^i2^tm^len^kCaseine^i2other24v18n2a04.htm a a X >2 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y y ] 1 _ g i n p A q y # ' ? ] w F q p o r q " S ,:U f U m U U S 0.U ^ U e U y U u H \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilus04invet060ndInVet18220161200^f323^l3311668-3498Determinacin de biomarcadores moleculares en leche y su posible aplicacin en el diagnstico y tratamiento de la mastitis bovina^les^rND^1A01^sCaggiano^nN^rND^1A01^sBottini^nJ. M^rND^1A01^sLorenzo Smirnoff^nA^rND^1A01^sDe Simone^nE. A^rND^1A01^sChiappe Barbar^nM. A^iA01^1Universidad de Buenos Aires^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Ctedra de Fisiologa Animal^cBuenos Aires2016093030/09/20162017050905/09/2017^les^aLa mastitis es la patologa con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando seriamente a la produccin lctea y la calidad de la leche. Es por eso que en este trabajo se evalu la actividad de las Metaloproteasas 2 y 9, involucradas en la degradacin de la matriz extracelular, en leche de vacas y vaquillonas con mastitis clnica y subclnica y en animales sanos. Se evaluaron tambin distintas fracciones proteicas y la actividad caseinoltica total. Las fracciones proteicas se evaluaron mediante SDS-PAGE y a actividad de las Metaloproteasas 2 y 9 fue evaluada mediante zimografa al igual que la actividad caseinoltica total. Los resultados arrojaron en la actividad caseinoltica total diferencias significativas entre el grupo Streptococcus spp. y los grupos subclnicas y sanas (p<0.05), y tambin se observaron diferencias significativas en cuanto a la casena total entre los mismos grupos (p<0.01). Si bien las Metaloproteasas 2 y 9 en las mastitis clnicas se encontraron aumentadas las mismas no presentaron diferencias significativas.^dnd^i1^tm^les^kMastitis^i1^tm^les^kMetaloproteasas^i1^tm^les^kCasena^i1Molecular biomarkers in determination of milk and its potential application in the diagnosis and treatment of bovine mastitis^len^len^aMastitis is a disease with increased morbidity and mortality within dairy herds, seriously affecting milk production and milk quality. That's why in this work the activity of Metalloproteinase 2 and 9, from milk of cows and heifers with subclinical and clinical mastitis and in healthy animals was evaluated. Total protein fractions and different caseinolytic activity were also evaluated. The activity of Metalloproteinase 2 and 9 was assessed by zymography as caseinolytic activity and total protein fractions by SDS-PAGE. The results showed a large increase in the activity of Metalloproteinase 2 and 9 in clinical mastitis compared with subclinical and healthy animals, these results were not significant due to the large standard deviation due to the large variability among pathogens within the groups. Significant differences were found between the group Streptococcus spp. and sub-clinical and healthy groups in terms of total caseinolytic activity (p <0.05), and significant differences were observed in terms of total casein in the same groups (p <0.01).^dnd^i2^tm^len^kMastitis^i2^tm^len^kMetalloproteinases^i2^tm^len^kCaseine^i2other24v18n2a04.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200004 b b " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp51article85ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a04.htm c c N 0 5 6 7 8 9 @ B * v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp62article85Determinación de biomarcadores moleculares en leche y su posible aplicación en el diagnóstico y tratamiento de la mastitis bovina *
^cYv18n2a04.htmd d N 0 5 6 7 8 9 @ B ) v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp73article85Caggiano N1.; Bottini J.M1.; Lorenzo Smirnoff A1.; De Simone E.A1.; Chiappe Barbará M.A1.
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^cYv18n2a04.htm f f 0 N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp95article85Correspondencia e-mail: Nicolás Caggiano ncaggiano@fvet.uba.ar
*Premio Estímulo a la Investigación Científica 2015 (Resolución CD Nº 3055/17). Categoría: Graduados de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires.
Recibido: 30/09/2016
Aceptado: 05/09/2017
Resumen
^cYv18n2a04.htmi i N 0 5 6 7 9 : A C 6 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp128article85La mastitis es la patología con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando seriamente a la producción láctea y la calidad de la leche. Es por eso que en este trabajo se evaluó la actividad de las Metaloproteasas 2 y 9, involucradas en la degradación de la matriz extracelular, en leche de vacas y vaquillonas con mastitis clínica y subclínica y en animales sanos. Se evaluaron también distintas fracciones proteicas y la actividad caseinolítica total. Las fracciones proteicas se evaluaron mediante SDS-PAGE y a actividad de las Metaloproteasas 2 y 9 fue evaluada mediante zimografía al igual que la actividad caseinolítica total. Los resultados arrojaron en la actividad caseinolítica total diferencias significativas entre el grupo Streptococcus spp. y los grupos subclínicas y sanas (p<0.05), y también se observaron diferencias significativas en cuanto a la caseína total entre los mismos grupos (p<0.01). Si bien las Metaloproteasas 2 y 9 en las mastitis clínicas se encontraron aumentadas las mismas no presentaron diferencias significativas.
^cYv18n2a04.htmj j ( N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp139article85Palabras clave: Mastitis; Metaloproteasas; Caseína.
^cYv18n2a04.htm k k r N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp1410article85Molecular biomarkers in determination of milk and its potential application in the diagnosis and treatment of bovine mastitis
^cYv18n2a04.htm l l N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp1511article85Summary
^cYv18n2a04.htm m m N 0 5 6 7 9 ; B D w v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp1612article85Mastitis is a disease with increased morbidity and mortality within dairy herds, seriously affecting milk production and milk quality. That's why in this work the activity of Metalloproteinase 2 and 9, from milk of cows and heifers with subclinical and clinical mastitis and in healthy animals was evaluated. Total protein fractions and different caseinolytic activity were also evaluated. The activity of Metalloproteinase 2 and 9 was assessed by zymography as caseinolytic activity and total protein fractions by SDS-PAGE. The results showed a large increase in the activity of Metalloproteinase 2 and 9 in clinical mastitis compared with subclinical and healthy animals, these results were not significant due to the large standard deviation due to the large variability among pathogens within the groups. Significant differences were found between the group Streptococcus spp. and sub-clinical and healthy groups in terms of total caseinolytic activity (p <0.05), and significant differences were observed in terms of total casein in the same groups (p <0.01).
^cYv18n2a04.htm n n & N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp1713article85Key words: Mastitis; Metalloproteinases; Caseine.
Introducción
^cYv18n2a04.htmp p N 0 5 6 7 9 ; B D H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp1915article85La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria, generalmente derivada una infección microbiana primaria. Es la patología con mayor morbilidad y mortalidad dentro de los rodeos lecheros, afectando seriamente a la producción láctea7. En Estados Unidos, país con altos estándares productivos, la morbilidad por mastitis es del 14,86%, la mortalidad es 16,3% y los rechazos generales a causa de mastitis y patologías mamarias son del 24,56%24. En Francia, en un reporte bianual realizado en 205 rodeos lecheros la incidencia de mastitis clínica y subclinica resultó, respectivamente, del 44.1% y el 26.6%6. Y por otra parte la Swedish Dairy Association en 2011 informó una incidencia de mastitis clínica del 17.3 % y que 2/3 de los animales en lactancia presentaron mastitis subclínicas22. Aparentemente estos porcentajes se mantienen constantes a través de los años 14 . Es así que las pérdidas económicas a consecuencia de la mastitis en los rodeos lecheros son muy importantes en todo el mundo y las consecuencias en el manejo del rodeo lechero afectado presenta características recidivantes y con presentaciones diversas de la enfermedad que muchas veces enmascaran el cuadro clínico. La mastitis no solo disminuye la producción láctea de los animales afectados, sino que también aumenta la cantidad de leche que se descarta por mala calidad, incrementa los costos veterinarios y genera el rechazo prematuro de animales del tambo1, 5, 15.
^cYv18n2a04.htmq q N
0 5 6 7 9 ; B D 8 | v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp2016article85Las mastitis pueden ser caracterizadas de diversas maneras y su clasificación facilita el diagnóstico y el tratamiento. Según el punto de vista clínico las mismas pueden clasificarse en clínicas y subclínicas. Las mastitis clínicas pueden ser diagnosticadas mediante la observación directa de la glándula mamaria y por las modificaciones macroscópicas de la secreción láctea. Las mastitis subclínicas en cambio no presentan signos clínicos pero mediante el Conteo de Células Somáticas (CCS) se define su diagnóstico. En la Argentina, los agentes etiológicos más frecuentemente aislados en las mastitis clínicas como en las subclínicas son Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. y Escherichia coli3. Respecto a la incidencia de las mastitis subclínicas debe destacarse que son ellas las de mayor presentación en los rodeos lecheros y aproximadamente un 20 a 50% de las vacas en ordeñe están afectadas en las explotaciones intensivas18. Esta situación conlleva a grandes pérdidas económicas ya que el costo de tener un animal con mastitis subclínica se eleva en un 70%, no solo debido a su menor producción láctea y pérdida de componentes lácteos, sino también por el daño asociado del tejido glandular, que en algunos casos es irreversible aún después del tratamiento y lleva al descarte temprano del animal16. Anualmente a nivel mundial se pierden más de 500.000 millones de dólares a causa de las mastitis subclínicas4, 17.
^cYv18n2a04.htmr r N
0 5 6 7 9 ; B D : v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp2117article85El proceso inflamatorio generado durante las mastitis produce la liberación de proteasas, como por ejemplo metaloproteasas (MMPs). Las MMPs son una familia de endopeptidasas dependientes de zinc encargadas del normal remodelado de la matriz extracelular de los distintos tejidos del organismo20. Esta familia de proteasas a su vez se dividen en cinco subfamilias según la sustancia que degraden: colagenasa, gelatinasa, estromalisina, metaloproteasa de membrana y la quinta subfamilia es un grupo diverso de enzimas que no han podido ser incluidas en los grupos anteriores2. Las MMP más estudiadas son las gelatinasas como la MMP-2 y la MMP-9, que en su rol fisiológico, principalmente, favorecen la migración de los polimorfonucleares hacia el sitio del foco infeccioso. Normalmente, el daño en la matriz extracelular provocado por el agente etiológico primario suele ser reparado post tratamiento, reconstituyéndose las funciones previas del tejido así como su estructura. Pero en el caso que el daño sea de gran magnitud o que la inflamación se presente de manera reiterativa y continua las MMPs juegan un rol preponderante en la fisiopatología de los procesos mastíticos, especialmente en su presentación recidivante, siendo la inhibición de las MMPs una propuesta terapéutica interesante para frenar el inflamatorio reiterado de la mastitis12.
^cYv18n2a04.htms s N
0 5 6 7 9 ; B D A v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp2218article85Más allá del daño tisular que puede provocar el desbalance en la actividad fisiológica de estas enzimas encargadas del remodelado de la matriz, hay que considerar que la afección de la glándula mamaria, redundará en una menor secreción láctea con alteración de la calidad proteica de dicha secreción. Esto conlleva a que se vea perjudicada la industria lechera ya que no solo disminuyen los litros de leche sino también su calidad es menor con el impacto que esto genera en el producto final de la cadena láctea. Es por eso que resulta interesante la determinación de la actividad proteolítica total de la leche para evaluar los procesos enzimáticos que se producen dentro de la glándula mamaria de un animal infectado tanto clínica como subclínicamente y las consecuencias que esto trae aparejado en la calidad de componentes proteicos de la secreción láctea.
^cYv18n2a04.htm t t t N
0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp2319article85Actualmente no se cuenta con amplia información sobre el rol de las distintas proteasas en la fisiopatología de los procesos mastíticos clínicos, subclínicos y recidivantes y tampoco sobre el impacto que el aumento de las MMPs tiene tanto sobre la salud de la glándula mamaria como de la calidad de la composición de la leche. Este trabajo plantea el estudio del rol de las MMPs en la fisiopatología de las mastitis y sus posibles variaciones según el cuadro y agente etiológico presente así como establecer su valor predictivo en el estudio de la alteración de las distintas fracciones proteicas de la leche de interés para la industria. Y se plantea a futuro el uso de inhibidores de MMPs en el tratamiento de las mastitis recidivantes y negativas a microorganismos patógenos, a fin de evitar en los protocolos el uso indiscriminado de antibióticos. Como objetivos nos propusimos evaluar la actividad de las MMPs 2 y 9 así como la actividad caseinolítica total de leches provenientes de animales con mastitis clínicas y subclínicas. Identificar diferencias en la actividad de proteasas entre los principales agentes etiológicos de las mastitis clínicas. Evaluar la correlación entre los niveles de proteasas y las distintas fracciones de caseína y la concentración de proteínas de alto peso molecular..
^cYv18n2a04.htmu u N
0 5 6 7 9 ; B D X v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp2420article85.
Materiales y métodos
Se tomaron 120 muestras de leche de vacas y vaquillonas provenientes de distintos tambos de la Provincia de Buenos Aires, los animales fueron divididos en 5 grupos: sanas (1), mastitis clínicas infectadas por Escherichia coli (2), Staphylococcus aureus (3), Streptococcus spp. (4) y mastitis subclínicas (5). Se realizó en las muestras de leche, el correspondiente cultivo bacteriológico, recuento de células somáticas mediante la tinción de Newman-Lampert y su posterior recuento en cámara de Neubauer. La determinación de las MMP-2 y 9 se efectuó mediante el método zimográfico descripto por Gruber et al., utilizando un SDS-PAGE con 10% de acrilamida y 0,2% de gelatina porcina8. Luego de la electroforesis, los geles se lavaron con 50mM Tris-HCL pH7.5 con Triton X-100 por 45 minutos y luego con una solución de 5mM CaCl2, 1uM ZnCl2, 50mM Tris-HCL pH7.5 con 2,5% de Triton X-100 por otros 45 minutos. Posteriormente los geles se incubaron en una solución 50mM Tris-HCL, 10 mM CaCl2 y 200mM NaCl pH7.5 a 37°C por 24hs. Luego los geles se colorearon con azul brillante de Coomassie R-250 0,2% por 2 hs y se decoloraron con solución decolorante (25% isopropanolol con 10% ácido acético). Los controles de inhibición se realizaron con 5mmol/l de EDTA. El estudio de las bandas generadas por la actividad gelatinolítica se realizó por densitometría utilizando el software Image J (National Institutes of Health, Maryland, USA).
En la determinación de la actividad caseinolítica total también se realizó un SDSPAGE con 10% de acrilamida y 0,2% de caseína bovina, luego de la electroforesis se realizaron los geles y se lavaron con las mismas soluciones que para la determinación de las MMP-2 y 9, la única diferencia fue que el período de incubación de la última solución fue de 48 horas21. Luego se les realizó el mismo estudio densitométrico utilizado en la determinación de la actividad de la MMP-2 y 9. Para la evaluación de las proteínas en leche se realizó un SDS-PAGE en un gel con 12% de acrilamida, las muestras se combinaron con buffer y se le agregó 2- Mercaptoetanol. Luego de la electroforesis los geles se colorearo y se decoloraron de la misma manera que en la zimografía23. Para calcular la concentración de cada fracción proteica primero se determinó la concentración de proteínas totales de la leche mediante la utilización del kit Proti 2 (Wiener lab., Argentina).
Para el estudio estadístico se calculo los valores medios y desvío standard (DS) de las variables en estudio. Se usó ANOVA para comparar las variables en estudio de los distintos grupos en los casos en los que la distribución no fue gaussiana se utilizo análisis Kruskal-Wallis Test (ANOVA no paramétrico). Se consideró significativo un efecto si el nivel de significación resulto p≤0.05. A aquellos parámetros que presentaron diferencias significativas entre los grupos mediante el ANOVA se estableció la diferencia intergrupos con el test de Tukey de comparaciones múltiples..
Resultados
^cYv18n2a04.htmx x N 0 5 6 7 9 ; B D 4 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp2723article85En relación a la actividad de MMP-2, ésta aumentó levemente en la leche de animales con mastitis por S. aureus y manifiestamente en los animales infectados por E. coli y Streptococcus spp respecto a los valores observados en las vacas sanas (41.09 ± 16.59) (expresado en % del control estándar interno); sin embargo, la diferencia en los valores medios de estos grupos resultó no significativa (P>0,05) a consecuencia del gran desvío estándar en los grupos con E. coli (489.43 ± 1747.29) , Streptococcus (2112.77± 4651.35) y S. aureus (169.31± 380.29). Cabe destacar que en el grupo subclínicos los valores hallados fueron similares a los del grupo de sanas (29.64± 14.30) y en el grupo de cultivos negativos con síntomas clínicos su valor medio y desvío estándar fue similar al del grupo S. aureus (290.66± 612.53).
Respecto a la actividad de la MMP-9 en la leche de los animales sin antecedentes de mastitis, grupo sanas, esta proteasa no presentó actividad observándose valores cercanos a cero. En los casos de mastitis por S. aureus la MMP- 9 se elevó mínimamente (4.24± 5.93) (% del control estándar de actividad), y en cambio en aquellos casos por E. coli (1292.85 ± 2839.33) y Streptococcus spp (5251.59 ± 6091.32), al igual que para MMP-2, el aumento fue manifiesto. En el grupo cultivo negativo con síntomas clínicos la MMP-9 se encontró muy elevada (4812.47±8411.1) en cambio en el grupo subclínicas en el 50 % de las muestras no pudo detectarse y en el resto los valores individuales fueron bajos (FOTO 1).
Foto 1. Zimografía de gelatina donde se aprecia la actividad gelatinolítica de las MMP-2 (70 kDa) y 9 (92 kDa). Control (C), E. coli (Ec), Subclínica (Sub), Streptococcus spp (Str), S. aureus (Sa) y vacas sanas (VS).
En cuanto a la actividad caseinolítica total (expresada en % respecto del control estándar) de las muestras analizadas se observó gran actividad en las muestras correspondientes a animales infectados por Streptococcus spp, (155.89± 190.14) y en el grupo negativo con signos clínicos (177.93 ±182.70) que presentaron diferencia significativa (p<0.05) respecto del grupo subclínico (66.72 ± 100.94) y al grupo de sanas (58.82 ± 107) (Fig. 1A).
^cYv18n2a04.htm { { * N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3026article85 ^cYv18n2a04.htm| | N 0 5 6 7 9 ; B D Y v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3127article85^cYv18n2a04.htm } } N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3228article85
Respecto a la caseína total y sus distintas fracciones se observó una disminución en la concentración de caseína total entre el grupo de animales infectados por Streptococcus spp respecto del grupo sanas y subclínicas (p<0,01) (Fig. 1B). En los niveles de alfa y beta caseína se observó el mismo patrón de disminución observado para la caseína total en las mastitis clínicas, sin diferencias significativas (Fig. 2A y 2B). Pero respecto a la kappa caseína, de gran interés en la industria quesera, vemos que está presente en todos los animales sanos, pero cuando observamos los grupos de mastitis clínicas entre el 40 y el 60% de los animales afectados no contienen esta fracción de la caseína, según el agente etiológico que la genere (Fig. 3A). En lo que respecta a proteínas de alto peso molecular (mayores a 150 kDa) se vio que también los animales infectados por Streptococcus spp tenían elevados los niveles de estas proteínas en comparación con el resto de los grupos (P<0,05) (Fig. 3B).
^cYv18n2a04.htm ~ ~ l N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3329article85 ^cYv18n2a04.htm * N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3430article85 ^cYv18n2a04.htm * N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3531article85 ^cYv18n2a04.htm * N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3632article85 ^cYv18n2a04.htm * N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3733article85 ^cYv18n2a04.htm N 0 5 6 7 9 ; B D b v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3834article85 ^cYv18n2a04.htm N 0 5 6 7 9 ; B D o v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp3935article85Discusión y conclusiones
^cYv18n2a04.htm R N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSp4036article85En este trabajo planteamos la importancia de la determinación de las MMP-2 y 9 en la leche en el estudio de la fisiopatología de las mastitis clínicas, hemos determinado un marcado aumento de ambas principalmente en los animales infectados E. coli y Streptococcus spp19. Nuestros resultados de la actividad de MMP 2 y 9 en las mastitis bovinas presentan concordancia con los documentados en la escasa bibliografía internacional. Sin embargo, corresponde resaltar que en nuestra experiencia se trabajó con animales insertos en esquemas productivos a campo y en cambio la mayoría de los trabajos a nivel mundial los resultados provienen de animales destinados únicamente a la experimentación. Por otro lado el incremento de la actividad caseinolítica es coincidente con la presencia de estos mismos agentes etiológicos, E. coli y Streptococcus spp. Principalmente se observó diferencia significativa en los animales infectados por Streptococcus spp respecto al grupo sanas (p<0,05)9, 10. En concordancia con lo dicho previamente los niveles de caseína total son menores en el grupo de animales infectados con Streptococcus spp. observándose diferencias significativas con los grupos de animales sanos y subclínicos (p<0,01). Es decir que hay una asociación entre una elevada actividad caseinolítica y una menor concentración de caseína en las muestras provenientes de los animales afectados por Streptococcus spp., en trabajos futuros habría que determinar qué rol tendrían las MMPs en la degradación de esta proteína tan importante para la industria quesera ya que la mayoría de los trabajos publicados hablan de la plasmina como la principal encargada de esta acción catabólica11. En cuanto a las proteínas de alto peso molecular solamente se observó diferencia significativa en los animales infectados por Streptococcus spp. (p<0.05) lo cual plantea una interesante alternativa para el diagnóstico de este agente etiológico13.
Para concluir podemos decir que los niveles de MMP-2 y 9 en la leche de vacas con mastitis permitirían valorar el daño de la matriz extracelular de la glándula mamaria, ya que los animales de los grupos de mastitis clínica infectados con Streptococcus spp.y E. coli presentan valores muy elevados de actividad aunque los resultados no son significativos debido al gran desvío estándar de estos grupos. Por otro lado determinación de las MMP-2 y 9 en asociación con la evaluación de la actividad caseinolítica total y de las distintas fracciones de la caseína puede ser útil en la valoración de la salud a futuro de la glándula mamaria y de la calidad de la secreción láctea así como en la toma de decisión para el descarte o no de un animal afectado. Por lo tanto la inhibición de las proteasas en los procesos mastíticos se presenta como una terapia coadyuvante a la antibioticoterapia que podría disminuir el daño tisular y mejorar la calidad de la leche. .
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A aG O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc978article248^rND^sGruber^nBL.^rND^sSorbi^nD^rND^sFrench^nDL^rND^sMarchese^nMJ^rND^sNuovo^nGJ.^rND^sKew^nRRMarkedly elevated serum MMP-9 (gelatinase B) levels in rheumatoid arthritis: a potentially useful laboratory marker^lenClin Immunol Immunopathol219960000199678161-7120161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 9 : A v C D T f t = A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc989article249^rND^sHaddadi^nK^rND^sMoussaoui^nF^rND^sHebia^nI^rND^sLaurent^nF.^rND^sLe Roux^nYE. coli proteolytic activity in milk and casein breakdown^lenReprod. Nutr. Dev.245200500002005485-49620161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 9 ; B v D F V k *} $ A % @ - 1 3 a: B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc9910article2410^rND^sHaddadi^nK^rND^sPrin-Mathieu^nC^rND^sMoussaoui^nFet alPolymorphonuclear neutrophils and Escherichia coli proteases involved in proteolysis of casein during experimental E. coli mastitis^lenInternational Dairy Journal220060000200616639-64720161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G V g O A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10011article2411^rND^sIsmail^nB^rND^sNielsen^nSSPlasmin protease in milk: Current knowledge and relevance to dairy industry^lenJournal of Dairy Science220100000201093114999-500920161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G W j y _ A ! @ ) - a/ 7 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10112article2412^rND^sMehrzad^nJ^rND^sDesrosiers^nC^rND^sLauzon^nK^rND^sRobitaille^nG^rND^sZhao^nX^rND^sLacasse^nPProteases Involved in Mammary Tissue Damage During Endotoxin-Induced Mastitis in Dairy Cows^lenJournal of Dairy Science22005000020058820161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G X f *w | ( A ) @ 1 5 7 a; C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10213article2413^rND^sMudaliar^nM^rND^sTassi^nR^rND^sThomas^nFC.et alMastitomics, the integrated omics of bovine milk in an experimental model of Streptococcus uberis mastitis: 2. Label-free relative quantitative proteomics.^lenMol. BioSyst.220161200201612274820161200v18n2a04.htm \ 0 5 6 7 : < C v E G W j + A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10314article2414^rND^sNielsen^nC^rND^sEmanuelson^nUMastitis control in Swedish dairy herds^lenJournal of Dairy Science2201300002013961120161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G ` q ? A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10415article2415^rND^sOlde Riekerink^nRGM^rND^sBarkema^nHW^rND^sKelton^nDF^rND^sScholl^nDTIncidence Rate of Clinical Mastitis on Canadian Dairy Farms^lenJournal of Dairy Science220080000200891420161200v18n2a04.htm v 0 5 6 7 : < C v E G W i O A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10516article2416^rND^sOliver^nSP^rND^sCalvinho^nLFInfluence of inflammation on mammary gland metabolism and milk composition.^lenJ. Anim.Sci.21995000019957318-3320161200v18n2a04.htm ~ l 0 5 6 7 : < C v E G S q = 0 a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10617article2417^rND^sOtt^nSCosts of herd - level production losses associated with subclinical mastitis in US Dairy Cows: In Proceedings^len38th Annual meeting of National Mastitis Council152 - 15620161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G Y h x g A @ " a+ 3 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10718article2418^rND^sPitkala,^nAM^rND^sHaveri^nS^rND^sPyorala^nV^rND^sHonkanen- Buzalski,^nTBovine mastitis in Finland 2001- Prevalence, distribution of bacteria, and antimicrobial resistance^lenJournal of Dairy Science2200400002004872433-244120161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G V d *z ) ? A @ @ H L N aU ] v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10819article2419^rND^sRaulo^nSM^rND^sSorsa^nT^rND^sTervahartiala^nTet al.Increase in milk metalloproteinase activity and vascularpermeability in bovine endotoxin-induced and naturally occurring Escherichia coli mastitis^lenVeterinary Immunology and Immunopathology220020000200285137-14520161200v18n2a04.htm | 0 5 6 7 : < C v E G Y h A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10920article2420^rND^sReynolds^nJJCollagenases and tissue inhibitors of metalloproteinases: a functional balance in tissue degradation^lenOral Dis.21996000019962170-620161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G c y ] A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc11021article2421^rND^sSnoek-van Beurden^nPAM^rND^sVon den Hoff^nJWZymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors^lenBioTechniques22005000020053873-8320161200v18n2a04.htm r 0 5 6 7 : < C v E > G B ` A q @ y C } a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc11122article2422Swedish Dairy AssociationHusdjursstatistik201100002011Sweden20161200v18n2a04.htm 0 5 6 7 : < C v E G U c w H A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc11223article2423^rND^sUrech^nE^rND^sPuhan^nZ^rND^sSchallibaum^nMChanges in Milk Protein Fraction as Affected by Subclinical Mastitis^lenJorunal of Dairy Science2199900001999822402-241120161200v18n2a04.htm l 0 5 6 7 : < C v E > G A R @ Z > ^ 6 a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc11324article2424USDA. Dairy200700002007Changes in the U.S. dairy cattle industry, 1991 - 200720161200v18n2a04.htm^ Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSo11article120180306105729v18n2a04.htm113 T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSo11article120180306105730v18n2a05.htm 81 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y P 1 R Z \ a c A d l # v j 9 L F h( F V p o r q S (U 2 U 9 U M U ^+ O S U y U U U - u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSh21article1oaesFVET14.0TAB05invet060ndInVet18220161200^f333^l3391668-3498Evaluacin de la transferencia pasiva de la inmunidad en equinos mediante el uso de diferentes pruebas^les^rND^1A01^sCarabetta^nD^rND^1A01 A02^sFernndez^nD.^rND^1A01 A02^sEtcheverra^nA^rND^1A01^sValle^nM^rND^1A01 A02^sPadola^nN. L.UNCPBA^iA01^1Facultad de Cs VeterinariasUNCPBA^iA02^1Facultad de Cs Veterinarias^2Laboratorio de Inmunoqumica y Biotecnologa2015072121/07/20152017061515/06/2017^les^aEl objetivo de este trabajo fue utilizar diferentes mtodos de evaluacin de la inmunidad tanto en calostro de yeguas como en suero de sus cras, analizar beneficios y desventajas de cada uno y determinar cul de stos es el ms adecuado para el uso en temporada de partos. Se tomaron 13 muestras de calostro y suero y se realizaron las siguientes pruebas: evaluacin subjetiva del calostro por su aspecto, evaluacin de la densidad especfica mediante calostrmetro, concentracin de azcares y protenas totales por refractometra y determinacin de la concentracin de IgG con glutaraldehdo (Inmuno-G Test). Se observ que dos potrillos tuvieron bajas concentraciones de IgG, debido probablemente a que ninguno calostr bien a causa de prdida de calostro por la madre antes del parto. Determinamos que la prueba de precipitacin con glutaraldehdo es la ms conveniente a incluir, por ser precisa, rpida y fcil de realizar, sobre todo en establecimientos con muchos animales, evitando gastos en laboratorio para la determinacin de gammaglobulinas. Esto los hace ms econmicos. Las pruebas restantes no seran obsoletas pero no se aconseja realizarlas como pruebas individuales para determinar calidad de calostro o una buena transferencia de inmunidad. S se pueden realizar como pruebas complementarias.^dnd^i1^tm^les^kCalostro^i1^tm^les^kSuero^i1^tm^les^kAglutinacin con glutaraldehdo^i1Evaluation of the immunity passive transfer in horses using different tests^len^len^aThe aim of this study was to evaluate different methods of detecting IgG both mares colostrum and serum of their pups, to analyse benefits and drawbacks of each against each other and determine which of them is best suited for use in season delivery. Thirteen colostrum and serum samples were taken to realize the following tests: Subjective evaluation of colostrum in appearance, evaluation of the specific density by colostrometer, sugar concentration and total protein by refractometry and determination of the concentration of IgG with glutaraldehyde. The data obtained was observed that two foals had low concentrations of IgG, probably because none colostrum either because of loss of colostrum by the mother before delivery. We determined that the precipitation test with glutaraldehyde is the most convenient to include, to be precise, quick and easy to perform, especially in places with many animals, avoiding expenses laboratory gamma globulins. This makes them cheaper. The remaining tests would not be advisable obsolete but not perform them as individual testing to determine quality of colostrum or a good transfer of immunity, you can make as complementary tests.^dnd^i2^tm^len^kColostrum^i2^tm^len^kSerum^i2^tm^len^kAgglutination with glutaraldehyde^i2other15v18n2a05.htm > 81 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y P 1 R Z \ a c A d l # v q # @ S F o( F V p o r q S 3U D U K U _ U p+ ] S U U U U - u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSf31article1oaesFVET14.0TAB05invet060ndInVet18220161200^f333^l3391668-3498Evaluacin de la transferencia pasiva de la inmunidad en equinos mediante el uso de diferentes pruebas^les^rND^1A01^sCarabetta^nD^rND^1A01 A02^sFernndez^nD.^rND^1A01 A02^sEtcheverra^nA^rND^1A01^sValle^nM^rND^1A01 A02^sPadola^nN. L.UNCPBA^iA01^1Facultad de Cs VeterinariasUNCPBA^iA02^1Facultad de Cs Veterinarias^2Laboratorio de Inmunoqumica y Biotecnologa2015072121/07/20152017061515/06/2017^les^aEl objetivo de este trabajo fue utilizar diferentes mtodos de evaluacin de la inmunidad tanto en calostro de yeguas como en suero de sus cras, analizar beneficios y desventajas de cada uno y determinar cul de stos es el ms adecuado para el uso en temporada de partos. Se tomaron 13 muestras de calostro y suero y se realizaron las siguientes pruebas: evaluacin subjetiva del calostro por su aspecto, evaluacin de la densidad especfica mediante calostrmetro, concentracin de azcares y protenas totales por refractometra y determinacin de la concentracin de IgG con glutaraldehdo (Inmuno-G Test). Se observ que dos potrillos tuvieron bajas concentraciones de IgG, debido probablemente a que ninguno calostr bien a causa de prdida de calostro por la madre antes del parto. Determinamos que la prueba de precipitacin con glutaraldehdo es la ms conveniente a incluir, por ser precisa, rpida y fcil de realizar, sobre todo en establecimientos con muchos animales, evitando gastos en laboratorio para la determinacin de gammaglobulinas. Esto los hace ms econmicos. Las pruebas restantes no seran obsoletas pero no se aconseja realizarlas como pruebas individuales para determinar calidad de calostro o una buena transferencia de inmunidad. S se pueden realizar como pruebas complementarias.^dnd^i1^tm^les^kCalostro^i1^tm^les^kSuero^i1^tm^les^kAglutinacin con glutaraldehdo^i1Evaluation of the immunity passive transfer in horses using different tests^len^len^aThe aim of this study was to evaluate different methods of detecting IgG both mares colostrum and serum of their pups, to analyse benefits and drawbacks of each against each other and determine which of them is best suited for use in season delivery. Thirteen colostrum and serum samples were taken to realize the following tests: Subjective evaluation of colostrum in appearance, evaluation of the specific density by colostrometer, sugar concentration and total protein by refractometry and determination of the concentration of IgG with glutaraldehyde. The data obtained was observed that two foals had low concentrations of IgG, probably because none colostrum either because of loss of colostrum by the mother before delivery. We determined that the precipitation test with glutaraldehyde is the most convenient to include, to be precise, quick and easy to perform, especially in places with many animals, avoiding expenses laboratory gamma globulins. This makes them cheaper. The remaining tests would not be advisable obsolete but not perform them as individual testing to determine quality of colostrum or a good transfer of immunity, you can make as complementary tests.^dnd^i2^tm^len^kColostrum^i2^tm^len^kSerum^i2^tm^len^kAgglutination with glutaraldehyde^i2other15v18n2a05.htm D3 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y y \ 1 ^ f h m o A p x # j ' D W F r* F X p o r q S (U @ U G U [ U l+ O S U U U U - u H \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0tab05invet060ndInVet18220161200^f333^l3391668-3498Evaluacin de la transferencia pasiva de la inmunidad en equinos mediante el uso de diferentes pruebas^les^rND^1A01^sCarabetta^nD^rND^1A01 A02^sFernndez^nD^rND^1A01 A02^sEtcheverra^nA^rND^1A01^sValle^nM^rND^1A01 A02^sPadola^nN. L^iA01^1UNCPBA^2Facultad de Cs Veterinarias^iA02^1UNCPBA^2Facultad de Cs Veterinarias^3Laboratorio de Inmunoqumica y Biotecnologa2015072121/07/20152017061515/06/2017^les^aEl objetivo de este trabajo fue utilizar diferentes mtodos de evaluacin de la inmunidad tanto en calostro de yeguas como en suero de sus cras, analizar beneficios y desventajas de cada uno y determinar cul de stos es el ms adecuado para el uso en temporada de partos. Se tomaron 13 muestras de calostro y suero y se realizaron las siguientes pruebas: evaluacin subjetiva del calostro por su aspecto, evaluacin de la densidad especfica mediante calostrmetro, concentracin de azcares y protenas totales por refractometra y determinacin de la concentracin de IgG con glutaraldehdo (Inmuno-G Test). Se observ que dos potrillos tuvieron bajas concentraciones de IgG, debido probablemente a que ninguno calostr bien a causa de prdida de calostro por la madre antes del parto. Determinamos que la prueba de precipitacin con glutaraldehdo es la ms conveniente a incluir, por ser precisa, rpida y fcil de realizar, sobre todo en establecimientos con muchos animales, evitando gastos en laboratorio para la determinacin de gammaglobulinas. Esto los hace ms econmicos. Las pruebas restantes no seran obsoletas pero no se aconseja realizarlas como pruebas individuales para determinar calidad de calostro o una buena transferencia de inmunidad. S se pueden realizar como pruebas complementarias.^dnd^i1^tm^les^kCalostro^i1^tm^les^kSuero^i1^tm^les^kAglutinacin con glutaraldehdo^i1Evaluation of the immunity passive transfer in horses using different tests^len^len^aThe aim of this study was to evaluate different methods of detecting IgG both mares colostrum and serum of their pups, to analyse benefits and drawbacks of each against each other and determine which of them is best suited for use in season delivery. Thirteen colostrum and serum samples were taken to realize the following tests: Subjective evaluation of colostrum in appearance, evaluation of the specific density by colostrometer, sugar concentration and total protein by refractometry and determination of the concentration of IgG with glutaraldehyde. The data obtained was observed that two foals had low concentrations of IgG, probably because none colostrum either because of loss of colostrum by the mother before delivery. We determined that the precipitation test with glutaraldehyde is the most convenient to include, to be precise, quick and easy to perform, especially in places with many animals, avoiding expenses laboratory gamma globulins. This makes them cheaper. The remaining tests would not be advisable obsolete but not perform them as individual testing to determine quality of colostrum or a good transfer of immunity, you can make as complementary tests.^dnd^i2^tm^len^kColostrum^i2^tm^len^kSerum^i2^tm^len^kAgglutination with glutaraldehyde^i2other15v18n2a05.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200005 " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp51article56
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a05.htm Z N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp62article56Evaluación de la transferencia pasiva de la inmunidad en equinos mediante el uso de diferentes pruebas
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B - v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp73article56Carabetta, D1; Fernández, D.1, 2; Etcheverría, A. 1, 2; Valle, M.1; Padola, N. L. 1, 2
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B 2 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp84article561UNCPBA, Facultad de Cs Veterinarias.
2UNCPBA, Facultad de Cs. Veterinarias, Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología.
Correspondencia e-mail: Daniel Fernández dfer_inm@vet.unicen.edu.ar
^cYv18n2a05.htm 0 N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp106article56Recibido: 21/07/2015
Aceptado: 15/06/2017
Resumen
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 9 : A C L v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp128article56El objetivo de este trabajo fue utilizar diferentes métodos de evaluación de la inmunidad tanto en calostro de yeguas como en suero de sus crías, analizar beneficios y desventajas de cada uno y determinar cuál de éstos es el más adecuado para el uso en temporada de partos. Se tomaron 13 muestras de calostro y suero y se realizaron las siguientes pruebas: evaluación subjetiva del calostro por su aspecto, evaluación de la densidad específica mediante calostrómetro, concentración de azúcares y proteínas totales por refractometría y determinación de la concentración de IgG con glutaraldehído (Inmuno-G Test®). Se observó que dos potrillos tuvieron bajas concentraciones de IgG, debido probablemente a que ninguno calostró bien a causa de pérdida de calostro por la madre antes del parto. Determinamos que la prueba de precipitación con glutaraldehído es la más conveniente a incluir, por ser precisa, rápida y fácil de realizar, sobre todo en establecimientos con muchos animales, evitando gastos en laboratorio para la determinación de gammaglobulinas. Esto los hace más económicos. Las pruebas restantes no serían obsoletas pero no se aconseja realizarlas como pruebas individuales para determinar calidad de calostro o una buena transferencia de inmunidad. Sí se pueden realizar como pruebas complementarias.
^cYv18n2a05.htm < N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp139article56Palabras clave: Calostro; Suero; Aglutinación con glutaraldehído.
^cYv18n2a05.htm @ N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp1410article56Evaluation of the immunity passive transfer in horses using different tests
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp1511article56Summary
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ( v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp1612article56The aim of this study was to evaluate different methods of detecting IgG both mares colostrum and serum of their pups, to analyse benefits and drawbacks of each against each other and determine which of them is best suited for use in season delivery. Thirteen colostrum and serum samples were taken to realize the following tests: Subjective evaluation of colostrum in appearance, evaluation of the specific density by colostrometer, sugar concentration and total protein by refractometry and determination of the concentration of IgG with glutaraldehyde. The data obtained was observed that two foals had low concentrations of IgG, probably because none colostrum either because of loss of colostrum by the mother before delivery. We determined that the precipitation test with glutaraldehyde is the most convenient to include, to be precise, quick and easy to perform, especially in places with many animals, avoiding expenses laboratory gamma globulins. This makes them cheaper. The remaining tests would not be advisable obsolete but not perform them as individual testing to determine quality of colostrum or a good transfer of immunity, you can make as complementary tests.
^cYv18n2a05.htm 4 N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp1713article56Key words: Colostrum; Serum; Agglutination with glutaraldehyde.
Introducción
^cYv18n2a05.htm t N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp1915article56La placenta de la yegua es histológicamente de tipo epiteliocorial, lo cual le impide la transferencia de inmunoglobulinas (Igs) al feto durante la gestación, además de servir como barrera para patógenos ambientales8,15.
Los potrillos neonatos desarrollan una respuesta de tipo primario, producen concentraciones bajas de anticuerpos específicos de antígeno y tienen un período de latencia largo para las formas de inmunidad adaptativa14. El potrillo si bien es inmunocompetente desde la mitad de la gestación, la inmunidad celular se considera inmadura desde el nacimiento hasta el mes de vida extrauterina8. Por lo tanto, estos neonatos dependen de la inmunidad transferida de forma pasiva para la protección de las enfermedades infecciosas14.
El calostro es rico en IgG e IgA, pero también contiene IgM e IgE y en las yeguas la inmunoglobulina más importante en el calostro es la IgG, pero su concentración cae con prontitud conforme avanza la lactancia y el principal isotipo en la leche pasa a ser la IgA15.
La protección conferida por el calostro depende de: volumen ingerido, concentración e isotipos de Igs y diversidad de especificidades de las mismas12.
La transferencia de Igs del calostro al organismo se produce por un mecanismo transitorio y no selectivo a través de las células epiteliales del intestino delgado. Estas células son remplazadas con rapidez por un epitelio maduro 36 horas después del parto5. Los potrillos normales comienzan a amamantarse entre las 1 a 3 h del nacimiento y la capacidad absortiva del tracto gastrointestinal del potrillo para las Igs es mayor durante las primeras 6 horas después del nacimiento y luego disminuye, siendo nula la absorción luego de las 24 h de vida14. Se ha demostrado que se absorben alrededor del 50 % de las inmunoglobulinas si se ingieren 3,2 a 3,6 litros de calostro en las primeras 12 h postparto8.
La calidad del calostro se puede evaluar subjetivamente por su aspecto. Una secreción espesa, amarillenta y pegajosa suele ser de buena calidad, mientras que si está diluida, blanca o translúcida es probablemente inadecuada. Las evaluaciones más objetivas son la densidad específica (>1065), la refractometría de azúcares (>20%) y la concentración de IgG (>70 g/L)11. Leblanc y cols. (1986) demostraron que un calostro con densidad específica de 1060 o mayor contiene en promedio una concentración de IgG de 3.000 mg/dl y proporciona al potrillo aproximadamente 879 mg/dl de IgG sérica, lo cual se considera un nivel adecuado de protección8.
Existen tres razones principales para la falta de transferencia adecuada de calostro: 1. Falla en la producción; 2. Falla en la ingestión; 3. Falla en la absorción15.
La concentración sérica de IgG en el potrillo por debajo de lo normal, 24 h después del nacimiento es la base para el diagnóstico del fracaso de la transferencia pasiva. Una concentración sérica de IgG inferior a 200 mg/dl indica un fracaso de la transferencia pasiva, mientras que una concentración de 200 a 800 mg/dl debe considerarse un fracaso parcial. Muchos potrillos bajo un buen manejo pueden estar sanos cuando la concentración sérica de IgG es inferior a 400 mg/dl y, en consecuencia, este punto de inflexión es evaluado mediante pruebas diagnósticas rápidas14.
Hay disponibles varias técnicas para determinar la concentración de inmunoglobulinas séricas15:
• Prueba de turbidez con sulfato de zinc
• Coagulación con glutaraldehído
• Inmunodifusión radial simple (IDR)
• Aglutinación con látex
• ELISA
• Electroforesis de proteínas séricas
• Refractometría .
El fracaso de la transferencia pasiva puede ocurrir por diversos factores tales como, lactancia prematura, debilidad neonatal, muerte de la madre o calostro con baja densidad específica.
Algunos autores sostienen que una razón por la cual se produce una falla en la transferencia pasiva podría ser la incapacidad de la madre para concentrar suficiente cantidad de inmunoglobulinas en el calostro. No todas las yeguas tienen la misma concentración de IgG en el calostro; sin embargo, los valores son comúnmente más altos que los séricos, hasta que el potrillo mama el calostro8. Por esta razón, es importante detectar los bajos niveles de inmunoglobulinas inmediatamente después del parto; pues permitirá al veterinario identificar los potrillos con alto riesgo de falla en la inmunidad pasiva y así poder suplementarlos8.
En cualquiera de los casos al potrillo se le puede administrar un calostro alternativo por vía oral. Lo óptimo es dar un mínimo de 2 litros de calostro equino, administrando 500 ml cada hora durante las primeras 8 horas de nacido14, mediante biberón o sonda nasogástrica15. El calostro bovino puede ser un sustituto seguro cuando no se dispone de calostro equino. Sin embargo, los potrillos que reciben calostro bovino también pueden necesitar una transfusión de plasma debido a que las inmunoglobulinas bovinas tienen una vida media corta en los potrillos y no están dirigidas específicamente contra los patógenos del caballo14.
Si un potrillo tiene más de 12 h de nacido cuando se sospecha o diagnostica el fracaso de la transferencia pasiva, está indicada la transfusión de plasma administrado por vía intravenosa. El volumen de plasma necesario para llevar la IgG sérica a un nivel aceptable no puede predecirse con seguridad porque tal parámetro depende de la gravedad del fracaso de la transferencia pasiva, el contenido de Ig del plasma y la enfermedad simultánea, la cual puede acelerar el catabolismo de la Ig. En general, 1 litro de plasma aumenta la concentración sérica de IgG en 200 a 300 mg/dl en un potrillo de 50 kg. De esta manera, se pueden necesitar de 2 a 4 litros para alcanzar la concentración sérica de IgG superior a 800 mg/dl. Se debe administrar una dosis terapéutica de plasma y luego volver a medir la IgG sérica. Si no se ha logrado la concentración deseada, será necesario administrar más plasma. Algunos potrillos con fracaso parcial de la transferencia pasiva (IgG entre >400 y <800 mg/dl) pueden encontrarse bien sin transfusión de plasma siempre que no existan infecciones y se minimice la exposición a patógenos. Estos potrillos deben ser muy controlados14.
Materiales y Métodos
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 9 ; B D R v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp2218article56Este trabajo se realizó en un establecimiento de cría de caballos S.P.C. en la provincia de Buenos Aires, a partir de los datos obtenidos de muestras tomadas de yeguas y sus potrillos en temporada de parición.
Animales. Se tomaron muestras de 13 yeguas, de acuerdo a la disponibilidad de animales en el momento del estudio. La edad y número de partos de cada yegua se detalla en la tabla 1.
Tabla 1. Edades y número de partos de las yeguas, características de sus calostros y de los sueros de sus potrillos en las diferentes pruebas realizadas.
Ref.: AB: Amarillento Blancuzco; AA: Amarillento Azucarado; A: Amarillento; BL; Blanco Lechoso
Muestras. Se tomaron 50 ml de calostro de cada yegua luego del parto. A las 12 h postnacimiento, a cada potrillo se le tomó una muestra de sangre sin anticoagulante.
Métodos. El calostro se colocó en tubos de ensayo para realizar una evaluación macroscópica de su aspecto, teniendo como control un calostro de muy buena calidad.
Se utilizó un calostrómetro, que posee una escala de 1030 a 1090, para determinar la densidad específica del calostro. Se colocó la muestra, que debía estar a una temperatura aproximada de 27°C, dentro de una probeta y se introdujo el calostrómetro.
Para determinar la concentración de azúcares se utilizó refractometría. Con una pipeta se tomó una gota de calostro y se descargó sobre el refractómetro, luego se colocó una gota de agua destilada de la misma forma y se observó a la luz. La línea divisoria entre el azul oscuro y el blanco indica los grados brix siendo 20-30% el valor adecuado.
La prueba de precipitación con glutaraldehído se realizó con el kit comercial Inmuno G Test Calostro® (ACV-EQUIMEL, S.R.L. Buenos Aires-Argentina). Se colocó en los tubos de reacción (con jeringa de 1 ml) 0,5 ml de calostro. Se adicionó una gota (50 μl) de reactivo, manteniendo el gotero en posición vertical. A partir del agregado del reactivo, se tomó el tiempo hasta verificar la coagulación (solidificación) del calostro. Cuando el calostro coagula dentro de los 10 min de adicionado el reactivo, tiene concentraciones de IgG superiores a 3 g/dl (densidad del calostrómetro mayor a 1.060). Cuando el coágulo se forma luego de los 10 min posteriores al agregado del reactivo, el calostro presenta concentraciones de IgG inferiores a 3 g/ dl (densidad de calostrómetro inferior a 1.060).
A las 12 h postparto, a cada potrillo se le tomó una muestra de sangre sin anticoagulante y se obtuvo el suero dejando el tubo a temperatura ambiente (37°C) 1 o 2 horas, para favorecer la retracción del coágulo.
Se colocó una gota del suero en el refractómetro para determinar el contenido de proteínas totales. La técnica consistió en depositar el suero del tubo en el prisma del refractómetro con un movimiento rápido del tubo hacia abajo y en dirección al prisma teniendo en cuenta de no tocar el prisma con el tubo. Luego de cerrar la tapa del prisma se observa la escala interna correspondiente al nivel de proteínas. El valor obtenido debe ser mayor a 6.
La prueba de coagulación con glutaraldehído se realizó mediante un kit comercial Inmuno-G Test® (ACV-EQUIMEL, S.R.L. Buenos Aires- Argentina), similar al utilizado en la prueba de calostro. Se tomaron 0,5 ml de suero con jeringa de 1ml y se colocaron en el tubo pequeño transparente, enrasando en la marca inferior del mismo. Se agregó una gota (50 μl) de Reactivo IgG Inmuno-G Test® (ACVEQUIMEL, S.R.L. Buenos Aires-Argentina) en tiempo cero y se mezcló suavemente. Se tomó el tiempo desde la adición del reactivo. La reacción es positiva cuando se forma un “gel sólido” (coágulo) a posteriori de la adición del reactivo. Esto se visualiza inclinando el tubo unos 45°. Si el tiempo de reacción obtenido es entre 0 y 10 min, la concentración de IgG (mg/dl) es mayor a 800, por lo que no es necesaria la transfusión de plasma. Si el tiempo es entre 10 y 60 min, la concentración de IgG (mg/dl) es de 400 a 800. En esta última hay una falla parcial de transferencia y el potrillo está en riesgo, por lo que hay que transfundir 500 cc de plasma. Si existe riesgo de infección se duplica la dosis. Si es mayor a 60 min, la concentración es menor a 400 mg/dl, hay una falla total de transferencia pasiva, por lo que hay que transfundir mínimo 1000 cc de plasma, ya que el potrillo se encuentra en alto riesgo.
Resultados
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 9 ; B D = v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp2622article56 Como se describe en la tabla 1, de las 13 muestras de calostro analizadas por densitometría sólo una muestra perteneciente a la yegua 5, de 14 años, presentó una densidad de 1030 con una concentración de IgG menor de 3 g/dl cuando se evaluó el calostro con el kit comercial Inmuno G Test Calostro®. El resto de las muestras presentaron una densidad que osciló entre 1055 y 1080 con una concentración de IgG mayor a 3 g/dl.
Si bien el valor de referencia tomado como aceptable con respecto a los grados Brix fue de 20%, la muestra de calostro de la yegua 5 demostró un menor valor (29%) en comparación con las otras muestras (entre 45% y 50%).
Las muestras de suero de los potrillos 1 y 5 (hijos de dos yeguas de 18 y 14 años, respectivamente) analizadas con el kit comercial Inmuno-G Test® presentaron una concentración de Ig G entre 400 y 800 mg/dl, aunque los valores obtenidos con las otras técnicas fueron normales (Tabla1).
Las concentraciones de proteínas totales de los sueros de los potrillos fueron consideradas normales, encontrándose variaciones entre 4,2 y 7,5.
Discusión
^cYv18n2a05.htm l N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp2824article56En el establecimiento en el cual se llevó a cabo este estudio no se realizaban pruebas para evaluar la concentración de IgG ni en calostro ni en suero de los potrillos, a excepción de la prueba para determinar la concentración de proteína total sérica En la muestra 1 de calostro, la densidad del mismo estuvo por debajo del valor normal (1065) pero la concentración de IgG fue normal (>3 g/ dl). Sin embargo, el potrillo tuvo bajos valores de IgG correspondiéndose con una falla parcial en el calostrado. Esto pudo deberse a que previo al parto, la yegua perdió cierta cantidad del mismo, debido a un efecto de ordeño espontáneo.
En la muestra 5 se observaron todos valores de IgG, tanto del calostro como del suero del potrillo, muy por debajo de los normales. Esta muestra también se obtuvo de una yegua que tuvo ordeño espontáneo, por lo cual se presume que perdió todo el calostro y el potrillo sólo ingirió leche.
Respecto de los niveles de azúcares del calostro medidos por refractometría, los valores tampoco fueron indicativos de la concentración de IgG, pues cuando los valores de azúcares son mayores a 30%, la concentración de IgG es muy buena (>80%). En la mayoría de las muestras, este valor fue normal o mayor al normal, excepto en la muestra 5, donde todos los valores determinados fueron bajos.
La observación del aspecto del calostro ni bien es extraído de la yegua puede orientar acerca de la calidad del calostro, pero no es una medida eficaz y exacta. El calostro de las yeguas 5 y 10 presentaron aspecto similar al de la leche (blanco lechoso). Sin embargo, en el caso de la muestra 5 coincidió con que era un calostro de mala calidad, no así en el caso de la muestra 10, en la cual todos los valores fueron normales.
La determinación de la concentración de proteínas totales en el suero, mediante una reacción de Biuret o un refractómetro, no brinda una idea de la cantidad de globulinas, dado el gran rango de concentraciones “normales” de proteína total en potrillos normales8. Tanto Tizard (2009) como McAuliffe (2010) concuerdan con que las técnicas de refractometría de proteína total sérica y electroforesis no son adecuadas. La primera por ser poco confiable y dar resultados falsos, y la segunda porque requiere equipos especializados y lleva mucho tiempo. Además, la refractometría es poco confiable como indicador de niveles de globulinas, dado el amplio rango de concentraciones normales. La correlación de la proteína total con el nivel de IgG también es poco precisa en el potrillo enfermo, en términos generales (tanto en condiciones clínicas como subclínicas), debido al aumento de otras proteínas (globulinas alfa y beta y proteínas de fase aguda) 8,11. En los potrillos, los valores de proteínas totales fueron variables. Los animales 1 y 4 tuvieron el mismo valor por refractometría, sin embargo el contenido de IgG fue mayor a 800 mg/dl en el potrillo 4 y menor a 800 mg/ dl en el potrillo 1.
La prueba de coagulación con glutaraldehído es económica y confiable, no es afectada por la hemólisis en comparación con otros métodos y se puede hacer en la caballeriza8. Se debe tener en cuenta que este método es semicuantitativo y podría dar lugar a algún error de interpretación.
Existen otras pruebas como ELISA o IDR, que aunque no se utilizan de rutina en Haras debido al costo y tiempo de lectura, deberían utilizarse para determinar la validez del IgG Inmuno-G Test®.
La prevalencia de falla parcial de la transferencia pasiva de la inmunidad tiene varía de 3 a 37%14, y parecería depender, principalmente, de factores de manejo que aseguran la ingestión precoz del calostro. La inclusión de pruebas tales como coagulación con glutaraldehído a la rutina del haras es de suma importancia para detectar una falla en la transferencia pasiva de Ig, prevenir un riesgo de sepsis y lograr la sobrevida del recién nacido.
Conclusión
^cYv18n2a05.htm N 0 5 6 7 9 ; B D S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a05.htmSp3026article56La prueba de coagulación con glutaraldehído usando kits comerciales es un método práctico, rápido y económico. Es de suma importancia que se incorporen estas pruebas a la rutina del haras en temporada de partos. Con la detección de IgG mediante kits comerciales en calostro, se puede determinar la calidad del calostro y por ende si éste es de buena calidad, conservarlo para suplementar a otros potrillos cuyas madres tengan un calostro de mala calidad y evitar futuros tratamientos por enfermedades o la mortandad del animal. Con la detección de IgG mediante kits comerciales en suero, se determina si el potrillo no adquirió la suficiente cantidad de Ac y así poder tratarlo a tiempo.
Lo recomendable es usar dos métodos en paralelo y evitar cualquier tipo de falla en la transferencia de inmunidad, ya sea por mala calidad de calostro, pérdida de calostro antes del parto o mal calostrado por parte del potrillo recién nacido.
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Neorickettsia risticii es un endosimbionte de trematodos que presentan un complejo ciclo de vida con varios hospedadores como artrpodos, caracoles acuticos y vertebrados insectvoros. Distintos estudios filogenticos revelaron que se compone de diversas cepas en EEUU, pero no se cuenta con informacin disponible de Brasil y Uruguay. En nuestro pas, N. risticii se detect por primera vez en 2013 en murcilagos Tadarida brasiliensis procedentes de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires (CABA). El objetivo de nuestro estudio fue caracterizar filogenticamente a N. risticii detectada en CABA anteriormente. Se estudiaron tres muestras de ADN previamente obtenidas resultando positivas mediante una PCR anidada para un fragmento del ARNr 16S del gnero Neorickettsia. Las secuencias tuvieron un 100 % de similitud entre ellas y 99,5 a 99,7 % con distintos hallazgos de N. risticii en EEUU. Slo una muestra pudo ser amplificada con la PCR anidada de un fragmento del gen groESL y el anlisis filogentico revel que N. risticii hallada en CABA se relaciona con hallazgos de la costa oeste de EEUU. Dado el potencial impacto en medicina veterinaria, la caracterizacin molecular de N. risticii circulante en Sudamrica es de suma importancia. Adems, la circulacin de este patgeno en nuestro pas hace necesario realizar estudios adicionales para comprender la ecologa y transmisin de N. risticii, y detectar la aparicin de casos equinos.^dnd^i1^tm^les^kNeorickettsia risticii;^i1^tm^les^kEhrlichiosis monoctica equina^i1^tm^les^kFiebre equina del Potomac;^i1^tm^les^kMurcilagos^i1^tm^les^kArgentina^i1Phylogenetic analysis of Neorickettsia risticii detected in bats, Argentina^len^len^aPotomac horse fever (equine monocytic ehrlichiosis) is caused by Neorickettsia risticii (formerly Ehrlichia risticii), with clinical cases reported only in the USA, Brazil and Uruguay. N. risticii is an endosymbiont of flukes with a complex life cycle utilizing various hosts such as aquatic snails and arthropods, and vertebrate insectivores. Different phylogenetic studies revealed that N. risticii consists of various strains in the USA, but no information is available from Brazil and Uruguay. In our country, N. risticii was first detected in 2013 in Tadarida brasiliensis bats from Buenos Aires city (CABA). The aim of our study was to characterize phylogenetically N. risticii detected in CABA. The three DNA samples previously obtained were positive by nested-PCR for a fragment of 16S rRNA of Neorickettsia genus and were sequenced, resulting in a 100% similarity among them and 99.5 to 99.7% with various strains of N. risticii from USA. Only one sample could be amplified by nested-PCR for a fragment of groESL gene. Phylogenetic analysis revealed that the current strain is related to strains of N. risticii along the west coast of the USA. Given the potential impact of veterinary medicine, molecular characterization of N. risticii circulating in South America is of great importance. In addition, the circulation of this pathogen in our country requires additional studies to understand the ecology and transmission of N. risticii, and detecting the occurrence of equine cases.^dnd^i2^tm^len^kNeorickettsia risticii^i2^tm^len^kEquine monocytic ehrlichiosis^i2^tm^len^kPotomac horse fever^i2^tm^len^kBats^i2^tm^len^kArgentina^i2other17v18n2a06.htm n D3 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M & Q y T 1 V ^ ` e g A h p # z g F ' F B< p ~ o r q S U I U P* U z* U & U U ] S S 'U z U ) U ) U U U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUSTAB06invet030ndInVet18220161200^f341^l3471668-3498Anlisis filogentico de Neorickettsia risticii detectada en murcilagos de Argentina^les^rND^1A01^sCicuttin^nG.L.^rND^1A02^sGreiman^nS.E.Instituto de Zoonosis Luis Pasteur^iA01Georgia Southern University^iA02^1Department of Biology^pUSA2016040606/04/20162017070101/07/2017^les^aLa fiebre equina del Potomac (ehrlichiosis monoctica equina) es causada por Neorickettsia risticii (anteriormente Ehrlichia risticii), con casos clnicos notificados solamente en EEUU, Canad, Brasil y Uruguay. Neorickettsia risticii es un endosimbionte de trematodos que presentan un complejo ciclo de vida con varios hospedadores como artrpodos, caracoles acuticos y vertebrados insectvoros. Distintos estudios filogenticos revelaron que se compone de diversas cepas en EEUU, pero no se cuenta con informacin disponible de Brasil y Uruguay. En nuestro pas, N. risticii se detect por primera vez en 2013 en murcilagos Tadarida brasiliensis procedentes de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires (CABA). El objetivo de nuestro estudio fue caracterizar filogenticamente a N. risticii detectada en CABA anteriormente. Se estudiaron tres muestras de ADN previamente obtenidas resultando positivas mediante una PCR anidada para un fragmento del ARNr 16S del gnero Neorickettsia. Las secuencias tuvieron un 100 % de similitud entre ellas y 99,5 a 99,7 % con distintos hallazgos de N. risticii en EEUU. Slo una muestra pudo ser amplificada con la PCR anidada de un fragmento del gen groESL y el anlisis filogentico revel que N. risticii hallada en CABA se relaciona con hallazgos de la costa oeste de EEUU. Dado el potencial impacto en medicina veterinaria, la caracterizacin molecular de N. risticii circulante en Sudamrica es de suma importancia. Adems, la circulacin de este patgeno en nuestro pas hace necesario realizar estudios adicionales para comprender la ecologa y transmisin de N. risticii, y detectar la aparicin de casos equinos.^dnd^i1^tm^les^kNeorickettsia risticii;^i1^tm^les^kEhrlichiosis monoctica equina^i1^tm^les^kFiebre equina del Potomac;^i1^tm^les^kMurcilagos^i1^tm^les^kArgentina^i1Phylogenetic analysis of Neorickettsia risticii detected in bats, Argentina^len^len^aPotomac horse fever (equine monocytic ehrlichiosis) is caused by Neorickettsia risticii (formerly Ehrlichia risticii), with clinical cases reported only in the USA, Brazil and Uruguay. N. risticii is an endosymbiont of flukes with a complex life cycle utilizing various hosts such as aquatic snails and arthropods, and vertebrate insectivores. Different phylogenetic studies revealed that N. risticii consists of various strains in the USA, but no information is available from Brazil and Uruguay. In our country, N. risticii was first detected in 2013 in Tadarida brasiliensis bats from Buenos Aires city (CABA). The aim of our study was to characterize phylogenetically N. risticii detected in CABA. The three DNA samples previously obtained were positive by nested-PCR for a fragment of 16S rRNA of Neorickettsia genus and were sequenced, resulting in a 100% similarity among them and 99.5 to 99.7% with various strains of N. risticii from USA. Only one sample could be amplified by nested-PCR for a fragment of groESL gene. Phylogenetic analysis revealed that the current strain is related to strains of N. risticii along the west coast of the USA. Given the potential impact of veterinary medicine, molecular characterization of N. risticii circulating in South America is of great importance. In addition, the circulation of this pathogen in our country requires additional studies to understand the ecology and transmission of N. risticii, and detecting the occurrence of equine cases.^dnd^i2^tm^len^kNeorickettsia risticii^i2^tm^len^kEquine monocytic ehrlichiosis^i2^tm^len^kPotomac horse fever^i2^tm^len^kBats^i2^tm^len^kArgentina^i2other17v18n2a06.htm h P5 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y & ] y ` 1 b j l q s A t | # Y F ) F B> p o r q S U 5 U <# U _* U & U U O S * U U " U ;) U d U U u H \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilustab06invet030ndInVet18220161200^f341^l3471668-3498Anlisis filogentico de Neorickettsia risticii detectada en murcilagos de Argentina^les^rND^1A01^sCicuttin^nG. L^rND^1A02^sGreiman^nS. E^iA01^1Instituto de Zoonosis Luis Pasteur^iA02^1Georgia Southern University^2Department of Biology^pUSA2016040606/04/20162017070101/07/2017^les^aLa fiebre equina del Potomac (ehrlichiosis monoctica equina) es causada por Neorickettsia risticii (anteriormente Ehrlichia risticii), con casos clnicos notificados solamente en EEUU, Canad, Brasil y Uruguay. Neorickettsia risticii es un endosimbionte de trematodos que presentan un complejo ciclo de vida con varios hospedadores como artrpodos, caracoles acuticos y vertebrados insectvoros. Distintos estudios filogenticos revelaron que se compone de diversas cepas en EEUU, pero no se cuenta con informacin disponible de Brasil y Uruguay. En nuestro pas, N. risticii se detect por primera vez en 2013 en murcilagos Tadarida brasiliensis procedentes de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires (CABA). El objetivo de nuestro estudio fue caracterizar filogenticamente a N. risticii detectada en CABA anteriormente. Se estudiaron tres muestras de ADN previamente obtenidas resultando positivas mediante una PCR anidada para un fragmento del ARNr 16S del gnero Neorickettsia. Las secuencias tuvieron un 100 por ciento de similitud entre ellas y 99,5 a 99,7 por ciento con distintos hallazgos de N. risticii en EEUU. Slo una muestra pudo ser amplificada con la PCR anidada de un fragmento del gen groESL y el anlisis filogentico revel que N. risticii hallada en CABA se relaciona con hallazgos de la costa oeste de EEUU. Dado el potencial impacto en medicina veterinaria, la caracterizacin molecular de N. risticii circulante en Sudamrica es de suma importancia. Adems, la circulacin de este patgeno en nuestro pas hace necesario realizar estudios adicionales para comprender la ecologa y transmisin de N. risticii, y detectar la aparicin de casos equinos.^dnd^i1^tm^les^kNeorickettsia risticii;^i1^tm^les^kEhrlichiosis monoctica equina^i1^tm^les^kFiebre equina del Potomac;^i1^tm^les^kMurcilagos^i1^tm^les^kArgentina^i1Phylogenetic analysis of Neorickettsia risticii detected in bats, Argentina^len^len^aPotomac horse fever (equine monocytic ehrlichiosis) is caused by Neorickettsia risticii (formerly Ehrlichia risticii), with clinical cases reported only in the USA, Brazil and Uruguay. N. risticii is an endosymbiont of flukes with a complex life cycle utilizing various hosts such as aquatic snails and arthropods, and vertebrate insectivores. Different phylogenetic studies revealed that N. risticii consists of various strains in the USA, but no information is available from Brazil and Uruguay. In our country, N. risticii was first detected in 2013 in Tadarida brasiliensis bats from Buenos Aires city (CABA). The aim of our study was to characterize phylogenetically N. risticii detected in CABA. The three DNA samples previously obtained were positive by nested-PCR for a fragment of 16S rRNA of Neorickettsia genus and were sequenced, resulting in a 100 percent similarity among them and 99.5 to 99.7 percent with various strains of N. risticii from USA. Only one sample could be amplified by nested-PCR for a fragment of groESL gene. Phylogenetic analysis revealed that the current strain is related to strains of N. risticii along the west coast of the USA. Given the potential impact of veterinary medicine, molecular characterization of N. risticii circulating in South America is of great importance. In addition, the circulation of this pathogen in our country requires additional studies to understand the ecology and transmission of N. risticii, and detecting the occurrence of equine cases.^dnd^i2^tm^len^kNeorickettsia risticii^i2^tm^len^kEquine monocytic ehrlichiosis^i2^tm^len^kPotomac horse fever^i2^tm^len^kBats^i2^tm^len^kArgentina^i2other17v18n2a06.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200006 N 0 5 6 7 8 9 @ B q v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp51article61COMUNICACIÓN BREVE
^cYv18n2a06.htm ^ N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp62article61Análisis filogenético de Neorickettsia risticii detectada en murciélagos de Argentina
^cYv18n2a06.htm " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp73article61Cicuttin, G.L.1; Greiman, S.E.2
^cYv18n2a06.htm ! ! N 0 5 6 7 8 9 @ B " d v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp84article611Instituto de Zoonosis Luis Pasteur (ZBPTV-IZLP), Laboratorio de Zoonosis Bacterianas y Parasitarias Transmitidas por Vectores.
2Department of Biology, Georgia Southern University (USA).
Correspondencia e-mail: Gabriel Cicuttin gcicuttin@gmail.com
^cYv18n2a06.htm# # 0 N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp106article61Recibido: 06/04/2016
Aceptado: 01/07/2017
Resumen
^cYv18n2a06.htm% % D N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp128article61La fiebre equina del Potomac (ehrlichiosis monocítica equina) es causada por Neorickettsia risticii (anteriormente Ehrlichia risticii), con casos clínicos notificados solamente en EEUU, Canadá, Brasil y Uruguay. Neorickettsia risticii es un endosimbionte de trematodos que presentan un complejo ciclo de vida con varios hospedadores como artrópodos, caracoles acuáticos y vertebrados insectívoros. Distintos estudios filogenéticos revelaron que se compone de diversas cepas en EEUU, pero no se cuenta con información disponible de Brasil y Uruguay. En nuestro país, N. risticii se detectó por primera vez en 2013 en murciélagos Tadarida brasiliensis procedentes de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA). El objetivo de nuestro estudio fue caracterizar filogenéticamente a N. risticii detectada en CABA anteriormente. Se estudiaron tres muestras de ADN previamente obtenidas resultando positivas mediante una PCR anidada para un fragmento del ARNr 16S del género Neorickettsia. Las secuencias tuvieron un 100 % de similitud entre ellas y 99,5 a 99,7 % con distintos hallazgos de N. risticii en EEUU. Sólo una muestra pudo ser amplificada con la PCR anidada de un fragmento del gen groESL y el análisis filogenético reveló que N. risticii hallada en CABA se relaciona con hallazgos de la costa oeste de EEUU. Dado el potencial impacto en medicina veterinaria, la caracterización molecular de N. risticii circulante en Sudamérica es de suma importancia. Además, la circulación de este patógeno en nuestro país hace necesario realizar estudios adicionales para comprender la ecología y transmisión de N. risticii, y detectar la aparición de casos equinos.
^cYv18n2a06.htm& & | N 0 5 6 7 9 : A C " v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp139article61Palabras clave: Neorickettsia risticii; Ehrlichiosis monocítica equina; Fiebre equina del Potomac; Murciélagos; Argentina.
^cYv18n2a06.htm' ' @ N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp1410article61Phylogenetic analysis of Neorickettsia risticii detected in bats, Argentina
^cYv18n2a06.htm( ( N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp1511article61Summary
^cYv18n2a06.htm ) ) N 0 5 6 7 9 ; B D k v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp1612article61Potomac horse fever (equine monocytic ehrlichiosis) is caused by Neorickettsia risticii (formerly Ehrlichia risticii), with clinical cases reported only in the USA, Brazil and Uruguay. N. risticii is an endosymbiont of flukes with a complex life cycle utilizing various hosts such as aquatic snails and arthropods, and vertebrate insectivores. Different phylogenetic studies revealed that N. risticii consists of various strains in the USA, but no information is available from Brazil and Uruguay. In our country, N. risticii was first detected in 2013 in Tadarida brasiliensis bats from Buenos Aires city (CABA). The aim of our study was to characterize phylogenetically N. risticii detected in CABA. The three DNA samples previously obtained were positive by nested-PCR for a fragment of 16S rRNA of Neorickettsia genus and were sequenced, resulting in a 100% similarity among them and 99.5 to 99.7% with various strains of N. risticii from USA. Only one sample could be amplified by nested-PCR for a fragment of groESL gene. Phylogenetic analysis revealed that the current strain is related to strains of N. risticii along the west coast of the USA. Given the potential impact of veterinary medicine, molecular characterization of N. risticii circulating in South America is of great importance. In addition, the circulation of this pathogen in our country requires additional studies to understand the ecology and transmission of N. risticii, and detecting the occurrence of equine cases..
^cYv18n2a06.htm * * d N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp1713article61Key words: Neorickettsia risticii; Equine monocytic ehrlichiosis; Potomac horse fever; Bats; Argentina.
Introducción
^cYv18n2a06.htm, , N 0 5 6 7 9 ; B D f v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp1915article61Neorickettsia risticii (anteriormente Ehrlichia risticii) es el agente de la fiebre equina del Potomac (ehrlichiosis monocítica equina), una enfermedad del verano descripta a fines de los 70s en los condados rurales de Maryland y Virginia cerca del río Potomac (Washington, EEUU)1. Los signos clínicos son variados, pero usualmente incluyen fiebre (a menudo bifásica), depresión, anorexia y colitis con diarrea aguda. En casos graves, los caballos presentan laminitis y las hembras pueden abortar1,4,7,16. La letalidad varía del 5 al 30 % en animales sin tratar4. Hasta la actualidad, se han notificado casos clínicos sólo en EEUU, Canadá, Brasil y Uruguay5,7,16. Interesantemente, en Brasil y Uruguay durante casi 100 años se ha conocido la ocurrencia de una enfermedad diarreica en caballos durante el verano en las costas del lago Merín. Esta enfermedad es denominada localmente como churrido equino y fue descripta en 19486.
Neorickettsia risticii es una bacteria intracelular obligada endosimbionte de trematodos principalmente de los géneros Acanthatrium y Lecithodendrium. El ciclo de vida de estos parásitos es complejo e involucra varios hospedadores, incluyendo caracoles acuáticos, artrópodos acuáticos y vertebrados. En general, el ciclo de vida comienza cuando un caracol acuático ingiere un huevo del parásito, el huevo eclosiona y el miracidio penetra los tejidos del caracol, desarrollando a un esporoquiste primario. El esporoquiste primario produce esporoquistes secundarios a través de reproducción asexual, estos esporoquistes se extienden por todos los tejidos del caracol y producen miles de cercarias. Las cercarias salen del caracol y entran en el ambiente externo, donde pueden penetrar en un artrópodo acuático y enquistarse en forma de metacercarias. Cuando los murciélagos y aves insectívoras ingieren los artrópodos infectados por metacercarias, los trematodos adultos se desarrollan en su intestino1,13,16,17. Complementariamente, se ha demostrado que N. risticii puede ser transmitida horizontalmente, de los trematodos infectados a tejidos no parasitados (como hígado y bazo) de aves y murciélagos, sugiriéndose que los animales insectívoros también podrían ser reservorios7,14,16.
La transmisión de N. risticii a los equinos ocurre cuando ingieren accidentalmente insectos infestados con metacercarias (infectadas con N. risticii) durante el pastoreo o comiendo heno, o al beber insectos que con el agua. También es posible que los caballos puedan adquirir la enfermedad al ingerir cercarias con el agua de bebida16.
Neorickettsia risticii se compone de diversas cepas en distintas regiones, según indican estudios realizados por caracterización molecular de genes ARNr 16S, groESL, p51, análisis de Western blot y morfología4,6,11. Las posibles explicaciones para esta amplia variación molecular incluyen los sistemas defectuosos de reparación de ADN, tanto en N. risticii como en Neorickettsia sennetsu, lo cual daría lugar a mayores tasas de mutación para el género Neorickettsia, coincidiendo con los cambios temporales y la ocurrencia de cepas atípicas de N. risticii. Además, la variación genética de N. risticii podría haber surgido debido a presiones selectivas sobre los trematodos infectados y/o los hospedadores de los trematodos8.
En Argentina, N. risticii se detectó por primera vez en 2013 en tres murciélagos Tadarida brasiliensis procedentes de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA), a partir de muestras de hígado, bazo y pulmón, utilizándose una PCR que amplificaba un fragmento de 345 pb de ARNr 16S2, siendo esta la única información genética de N. risticii disponible para Sudamérica. El presente estudio tuvo como objetivo caracterizar filogenéticamente a N. risticii detectada en el estudio previo de 2013.
Materiales y Métodos
^cYv18n2a06.htm . . N 0 5 6 7 9 ; B D } v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp2117article61Se analizaron tres muestras de ADN positivos detectados en 2013 utilizando dos PCRs anidadas para el género Neorickettsia: la primera dirigida al ARNr 16S9,10 y la segunda dirigida al gen groESL12 (Tabla 1).
^cYv18n2a06.htm / / N 0 5 6 7 9 ; B D N v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp2218article61Tabla 1. Detalle de los cebadores utilizados
Ambas reacciones de PCR se realizaron con un volumen final de 25 μl utilizando OneTaq Quick-Load 2X Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), siguiendo las instrucciones del fabricante. El termociclado se realizó en un termociclador EP Gradient Masthercycler (Eppendorf, Hauppauge, New York) utilizando una desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos, seguido por 40 ciclos con una desnaturalización a 94ºC por 30 segundos, alineamiento a 58ºC por 30 segundos y extensión a 68ºC por 1 minuto con 45 segundos, para finalizar con una extensión a 68ºC por 5 minutos. Como control positivo se utilizó Neorickettsia sp. endosimbionte de Plagiorchis elegans11 y como control negativo se usó agua libre de nucleasas.
Los productos amplificados fueron purificados utilizando Zymo DNA Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA) o ExoSap PCR clean-up enzymatic kit from Affimetrix (Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante, y fueron secuenciados en un secuenciador ABI Prism 3100. Las secuencias fueron ensambladas usando el software Sequencher 4.2 (GeneCodes Corp., Ann Arbor, MI). El análisis de alineamiento múltiple fue realizado con el algoritmo CLUSTAL y la construcción del árbol filogenético fue hecha con el software MEGA versión 6 usando el método del vecino más cercano (neighbourjoining, NJ) y los parámetros del modelo Tamura Nei. Los valores de confianza para cada rama de los árboles resultantes fueron determinados mediante 1000 replicaciones de remuestreo (bootstrap). En el caso del gen groESL el análisis filogenético se realizó sobre un fragmento parcial de 526 pb para los cuales se disponía de varias secuencias en GenBank para comparar.
Las secuencias obtenidas en este estudio fueron depositadas en GenBank con los siguientes números de acceso: KX001784 (fragmento del ARNr 16S) y KX001785 (fragmento del gen groESL). .
Resultados
^cYv18n2a06.htm2 2 N 0 5 6 7 9 ; B D j v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp2521article61Las tres muestras resultaron positivas para N. risticii mediante la PCR anidada del fragmento del ARNr 16S y fueron secuenciadas, resultando en un 100 % de similitud entre ellas, 99,7 % (1305/1309) a 99,6 % (1304/1309) con distintos hallazgos de N. risticii en California (AF206300 y AF036654, AF037211 y AF37210, respectivamente) y 99,5 % (1303/1309) con N. risticii cepa Illinois (Maryland, CP001431) y N. risticii de Ohio (AY005439). La relación filogenética se muestra en la figura 1.
^cYv18n2a06.htm3 3 N 0 5 6 7 9 ; B D 2 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp2622article61
Figura 1. Árbol filogenético inferido por la comparación de secuencias parciales del ARNr 16S de Neorickettsia risticii. Los números en los nodos son los valores de soporte. La barra de escala representa la diferencia en nucleótidos de las secuencias.
Sólo una muestra pudo ser amplificada con la PCR anidada del fragmento groESL. La secuencia resultante tuvo una similitud del 97,5 % (1812/1858) con N. risticii cepa Illinois (CP001431). Además considerando un fragmento parcial de 526 pb con mayor disponibilidad en GenBank, presentó una identidad del 98,3 % (517/526) y 98,1 % (516/526) con distintas secuencias de N. risticii de California (AF036665 y AF037213, respectivamente), 97,9 % (515/526) con N. risticii de Oregon (AF036670 y AF036660) y California (AF036663), 97,7 % (514/526) con hallazgos en Oregon (AF36661) y 97,3 % (512/526) con hallazgos en California (AF193413 y AF036662) y Pensilvania (AF036664). Además, tuvo una mayor diferencia con otros hallazgos en el centro-este de EEUU. El análisis filogenético del fragmento groESL se detalla en la figura 2.
^cYv18n2a06.htm 5 5 N 0 5 6 7 9 ; B D A v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp2824article61
Figura 2. Árbol filogenético inferido por la comparación de secuencias parciales del gen groESL de Neorickettsia risticii. Los números en los nodos son los valores de soporte. La barra de escala representa la diferencia en nucleótidos de las secuencias
Lamentablemente no se encuentran secuencias genéticas disponibles para su comparación de N. risticii halladas en Brasil y Uruguay, así como de hallazgos previos en murciélagos en EEUU.
^cYv18n2a06.htm7 7 N 0 5 6 7 9 ; B D ` v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3026article61Discusión
^cYv18n2a06.htm8 8 J N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3127article61Este es el primer análisis filogenético de N. risticii hallada en Sudamérica. El uso de dos fragmentos génicos (ARNr 16S y groESL) permitió develar la relación filogenética de N. risticii presente en nuestra región respecto a hallazgos previos en EEUU. En este sentido, a medida que más información se acumula respecto a las distintas variantes de N. risticii que circulan en distintos lugares, es posible detectar patrones regionales en las asociaciones de estos endosimbiontes y los trematodos hospedadores, y con ello definir nichos ecológicos específicos de transmisión16. Por otra parte, la única información genética previa de N. risticii disponible para Sudamérica era un fragmento de 345 pb del ARNr 16S obtenido de murciélagos T. brasiliensis en CABA2. La descripción de N. risticii infectando caballos en Sudamérica (Brasil y Uruguay) utilizó enzimas de restricción sobre una PCR de un fragmento ARNr 16S6, no habiendo secuencias genéticas disponibles para su comparación. A su vez, otro estudio realizado en Brasil en trematodes Parapleurolophocercous sp. utiliza también una PCR para un fragmento 16S ARNr pero sin secuenciar los productos obtenidos3. Por último, no hay secuencias genéticas disponibles (ARNr 16S y groESL) de hallazgos previos en murciélagos (Myotis yumanensis14, Myotis lucifugus y Eptescicus fuscus7) estudiados en EEUU.
La mayoría de los estudios de diversidad genética de las cepas de N. risticii utilizan únicamente las secuencias del gen ARNr 16S, pero las diferencias en las secuencias de diferentes cepas de la misma especie de organismos rickettsiales son muy pequeñas (de 0 a 0,1%), lo cual puede hacer al análisis filogenético poco concluyente15, aunque otros autores refieren que aislamientos de N. risticii pueden diverger casi por 15 nucleótidos en su ARNr 16S4. En nuestro estudio encontramos pequeñas diferencias (hasta 5 nucleótidos) y se observó un agrupamiento relativo a regiones geográficas de la costa oeste de EEUU (Figura 1).
En este sentido, el análisis de genes adicionales (como el gen de choque térmico, groESL) permite reflejar una diversidad genética más extensa, permitiendo evidenciar mejor asociaciones geográficas entre cepas de N. risticii15. Sólo pudo amplificarse y secuenciarse una muestra mediante la PCR anidada para el gen groESL, esto podría deberse al mayor tamaño del fragmento que complejiza la amplificación siendo más sensible a la calidad del ADN. El análisis filogenético del fragmento groESL realizado en nuestro estudio revela también dos grupos de N. risticii: un grupo perteneciente a la costa oeste de EEUU (California y Oregon) con hallazgos en caballos, caracoles acuáticos y trematodes, y el otro grupo con N. risticii halladas en el centro-este de EEUU (Michigan, Pennsylvania y Maryland) en caballos. N. risticii hallada en CABA se relaciona con uno de los grupos de la costa oeste de EEUU (Figura 2). El agrupamiento de los hallazgos de EEUU en el grupo de la costa oeste y del centro-este del país ya fue detectado en estudios previos utilizando otros fragmentos génicos8.
Dado el potencial impacto en medicina veterinaria, la caracterización molecular de N. risticii circulante en Sudamérica es de suma importancia dado que actualmente la información es muy limitada y no permite establecer conclusiones. Por otra parte, no hay registros de casos de ehrlichiosis monocítica equina en nuestro país, pero dada la circulación de este patógeno es necesario realizar estudios adicionales para comprender la ecología y transmisión de N. risticii, y detectar la aparición de casos en equinos.
1. Baird, J.D.; Arroyo, L.G. Historical aspects of Potomac horse fever in Ontario (1924-2010). Can Vet J. 2013; 54:565-572. ^cYv18n2a06.htm; ; N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3430article61
^cYv18n2a06.htm < < T 0 5 6 7 9 ; B xD E < v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3531article6122. Cicuttin, G.L.; Boeri E.J.; Beltrán F.J.; Gury Dohmen F.E. Molecular detection of Neorickettsia risticii in Brazilian free-tailed bats (Tadarida brasiliensis) from Buenos Aires, Argentina. Pesq Vet Bras. 2013; 33(5):648-650. ^cYv18n2a06.htm = = N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3632article61
^cYv18n2a06.htm > > " T 0 5 6 7 9 ; B xD E } v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3733article6133. Coimbra, H.S.; Schuch, L.F.D.; Veitenheimer Mendes, I.L.; Meireles, M.C.A. Neorickettsia (Ehrlichia) risticii no sul do brasil: Heleobia spp . (Mollusca: Hydrobilidae) e Parapleurolophocecous cercariae (Trematoda: Digenea) como possíveis vetores. Arq Inst Biol. 2005; 72(3):325-329. ^cYv18n2a06.htm? ? N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSp3834article61
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Las muestras se tomaron de caninos con signos clnicos de la enfermedad y consistieron en hisopados nasales, oculares, farngeos (tonsilas) y conjuntivales. Los aislamientos se realizaron en clulas MDCK, las cuales mostraron efecto citopatognico caracterstico. Los virus provenientes de la cosecha, se detectaron por RT-PCR de una regin que codifica la nucleoprotena NP asociada al RNA (posicin 769 a la 1055 del genoma) obtenindose en todos los casos un producto de 287 pb comparable con el obtenido con cepas vacunales (cepas Ondersterpoort y Lederle), lo que indica presencia viral en todas las muestras procesadas. Las cepas aisladas se sometieron a pruebas de neutralizacin en clulas MDCK con el anticuerpo monoclonal frente a la protena H y slo 6 de ellas fueron neutralizadas. Este hallazgo sugiere la incapacidad de las cepas vacunales para proteger a los caninos frente a la circulacin de algunas cepas virales autctonas.^dnd^i1^tm^les^kVirus^i1^tm^les^kDistemper canino^i1^tm^les^kEstudio molecula^i1^tm^les^kRT-PCR^i1Canine distemper virus; molecular detection of isolates in Santa Fe, Argentina during the years 2000-2010^len^len^aIn the city of Santa Fe, Argentina, during years 2000 and 2010, 13 wild type strains of canine distemper virus were isolated. All the samples were obtained from dogs with clinical signs of disease. Isolations were performed in MDCK cells which shown characteristic cytopathogenic effect. Identification of the wild type strains was performed by RT-PCR of a region that encodes NP nucleoprotein associated to RNA. The amplified product was a 287-bp corresponding to positions 769-1055 of the Onderstepoort and Lederle vaccine strains genome, which confirmed presence of the virus in all the samples. The isolate strains were tested by neutralization on MDCK cells with the monoclonal antibody against protein H, and only 6 of them were neutralized. This finding suggests the inability of the vaccine strains to protect the canines against the circulation of some wild type strains^dnd^i2^tm^len^kVirus^i2^tm^len^kCanine distemper^i2^tm^len^kMolecular study^i2^tm^len^kRT-PCR^i2other09v18n2a07.htmn n V6 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M & Q y T 1 V ^ ` e g A h p # z 1 G [ s F b F 4a p o r q S 4U U U U ! U = O{ S uU ? U F U W U s U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUSTAB07invet060ndInVet18220161200^f349^l3551668-3498Virus de Distemper Canino: deteccin molecular de diferentes aislamientos provenientes de perros de la provincia de santa fe, argentina, entre los aos 2000 y 2010^les^rND^1A01^sPinotti^nM.^rND^1A01^sGollan^nA^rND^1A01^sCanavesio^nM.^rND^1A01^sPasseggi^nC.^rND^1A01^sLarrateguy^nM.V.^rND^1A01^sPaz^nM.E.^rND^1A02^sFormentini^nE.Universidad Nacional del Litoral^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de MicrobiologaUniversidad Nacional del Litoral^iA02^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Farmacologa2016100110/01/20162017090101/09/2017^les^aEn la ciudad de Santa Fe, Argentina, durante los aos 2000 y 2010, se aislaron 13 cepas autctonas del virus Distemper Canino. Las muestras se tomaron de caninos con signos clnicos de la enfermedad y consistieron en hisopados nasales, oculares, farngeos (tonsilas) y conjuntivales. Los aislamientos se realizaron en clulas MDCK, las cuales mostraron efecto citopatognico caracterstico. Los virus provenientes de la cosecha, se detectaron por RT-PCR de una regin que codifica la nucleoprotena NP asociada al RNA (posicin 769 a la 1055 del genoma) obtenindose en todos los casos un producto de 287 pb comparable con el obtenido con cepas vacunales (cepas Ondersterpoort y Lederle), lo que indica presencia viral en todas las muestras procesadas. Las cepas aisladas se sometieron a pruebas de neutralizacin en clulas MDCK con el anticuerpo monoclonal frente a la protena H y slo 6 de ellas fueron neutralizadas. Este hallazgo sugiere la incapacidad de las cepas vacunales para proteger a los caninos frente a la circulacin de algunas cepas virales autctonas.^dnd^i1^tm^les^kVirus^i1^tm^les^kDistemper canino^i1^tm^les^kEstudio molecula^i1^tm^les^kRT-PCR^i1Canine distemper virus; molecular detection of isolates in Santa Fe, Argentina during the years 2000-2010^len^len^aIn the city of Santa Fe, Argentina, during years 2000 and 2010, 13 wild type strains of canine distemper virus were isolated. All the samples were obtained from dogs with clinical signs of disease. Isolations were performed in MDCK cells which shown characteristic cytopathogenic effect. Identification of the wild type strains was performed by RT-PCR of a region that encodes NP nucleoprotein associated to RNA. The amplified product was a 287-bp corresponding to positions 769-1055 of the Onderstepoort and Lederle vaccine strains genome, which confirmed presence of the virus in all the samples. The isolate strains were tested by neutralization on MDCK cells with the monoclonal antibody against protein H, and only 6 of them were neutralized. This finding suggests the inability of the vaccine strains to protect the canines against the circulation of some wild type strains^dnd^i2^tm^len^kVirus^i2^tm^len^kCanine distemper^i2^tm^len^kMolecular study^i2^tm^len^kRT-PCR^i2other09v18n2a07.htm o o h b8 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y & ] y ` 1 b j l q s A t | # 6 K _ v F d F 7c p o r q S 4U U U U & U B Tm S uU 6 U = U N U j U u H \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilustab07invet060ndInVet18220161200^f349^l3551668-3498Virus de Distemper Canino: deteccin molecular de diferentes aislamientos provenientes de perros de la provincia de santa fe, argentina, entre los aos 2000 y 2010^les^rND^1A01^sPinotti^nM^rND^1A01^sGollan^nA^rND^1A01^sCanavesio^nM^rND^1A01^sPasseggi^nC^rND^1A01^sLarrateguy^nM. V^rND^1A01^sPaz^nM. E^rND^1A02^sFormentini^nE^iA01^1Universidad Nacional del Litoral^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Ctedra de Microbiologa^iA02^1Universidad Nacional del Litoral^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Ctedra de Farmacologa2016100110/01/20162017090101/09/2017^les^aEn la ciudad de Santa Fe, Argentina, durante los aos 2000 y 2010, se aislaron 13 cepas autctonas del virus Distemper Canino. Las muestras se tomaron de caninos con signos clnicos de la enfermedad y consistieron en hisopados nasales, oculares, farngeos (tonsilas) y conjuntivales. Los aislamientos se realizaron en clulas MDCK, las cuales mostraron efecto citopatognico caracterstico. Los virus provenientes de la cosecha, se detectaron por RT-PCR de una regin que codifica la nucleoprotena NP asociada al RNA (posicin 769 a la 1055 del genoma) obtenindose en todos los casos un producto de 287 pb comparable con el obtenido con cepas vacunales (cepas Ondersterpoort y Lederle), lo que indica presencia viral en todas las muestras procesadas. Las cepas aisladas se sometieron a pruebas de neutralizacin en clulas MDCK con el anticuerpo monoclonal frente a la protena H y slo 6 de ellas fueron neutralizadas. Este hallazgo sugiere la incapacidad de las cepas vacunales para proteger a los caninos frente a la circulacin de algunas cepas virales autctonas.^dnd^i1^tm^les^kVirus^i1^tm^les^kDistemper canino^i1^tm^les^kEstudio molecula^i1^tm^les^kRT-PCR^i1Canine distemper virus; molecular detection of isolates in Santa Fe, Argentina during the years 2000-2010^len^len^aIn the city of Santa Fe, Argentina, during years 2000 and 2010, 13 wild type strains of canine distemper virus were isolated. All the samples were obtained from dogs with clinical signs of disease. Isolations were performed in MDCK cells which shown characteristic cytopathogenic effect. Identification of the wild type strains was performed by RT-PCR of a region that encodes NP nucleoprotein associated to RNA. The amplified product was a 287-bp corresponding to positions 769-1055 of the Onderstepoort and Lederle vaccine strains genome, which confirmed presence of the virus in all the samples. The isolate strains were tested by neutralization on MDCK cells with the monoclonal antibody against protein H, and only 6 of them were neutralized. This finding suggests the inability of the vaccine strains to protect the canines against the circulation of some wild type strains^dnd^i2^tm^len^kVirus^i2^tm^len^kCanine distemper^i2^tm^len^kMolecular study^i2^tm^len^kRT-PCR^i2other09v18n2a07.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200007p p " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp51article51ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a07.htm q q N 0 5 6 7 8 9 @ B C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp62article51Virus de Distemper Canino: detección molecular de diferentes aislamientos provenientes de perros de la provincia de santa fe, argentina, entre los años 2000 y 2010
^cYv18n2a07.htm r r N 0 5 6 7 8 9 @ B G v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp73article51Pinotti, M.1; Gollan, A.1; Canavesio, M.1; Passeggi, C.1; Larrateguy, M.V.1; Paz, M.E.1; Formentini, E.2
^cYv18n2a07.htm s s N 0 5 6 7 8 9 @ B J v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp84article51Universidad Nacional del Litoral, Facultad de Ciencias Veterinarias,
1Cátedra de Microbiología.
2Cátedra de Farmacología.
Correspondencia e-mail: Mario Andrés Pinotti mpinotti@fcv.unl.edu.ar
^cYv18n2a07.htm u u 0 N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp106article51Recibido: 10/01/2016
Aceptado: 01/09/2017
Resumen
^cYv18n2a07.htm w w N 0 5 6 7 9 : A C 1 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp128article51En la ciudad de Santa Fe, Argentina, durante los años 2000 y 2010, se aislaron 13 cepas autóctonas del virus Distemper Canino. Las muestras se tomaron de caninos con signos clínicos de la enfermedad y consistieron en hisopados nasales, oculares, faríngeos (tonsilas) y conjuntivales. Los aislamientos se realizaron en células MDCK, las cuales mostraron efecto citopatogénico característico. Los virus provenientes de la cosecha, se detectaron por RT-PCR de una región que codifica la nucleoproteína NP asociada al RNA (posición 769 a la 1055 del genoma) obteniéndose en todos los casos un producto de 287 pb comparable con el obtenido con cepas vacunales (cepas Ondersterpoort y Lederle), lo que indica presencia viral en todas las muestras procesadas. Las cepas aisladas se sometieron a pruebas de neutralización en células MDCK con el anticuerpo monoclonal frente a la proteína H y sólo 6 de ellas fueron neutralizadas. Este hallazgo sugiere la incapacidad de las cepas vacunales para proteger a los caninos frente a la circulación de algunas cepas virales autóctonas.
^cYv18n2a07.htm x x 0 N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp139article51Palabras clave: Virus; Distemper canino; Estudio molecula; RT-PCR.
^cYv18n2a07.htm y y ^ N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp1410article51Canine distemper virus; molecular detection of isolates in Santa Fe, Argentina during the years 2000-2010
^cYv18n2a07.htmz z N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp1511article51Summary
^cYv18n2a07.htm { { X N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp1612article51In the city of Santa Fe, Argentina, during years 2000 and 2010, 13 wild type strains of canine distemper virus were isolated. All the samples were obtained from dogs with clinical signs of disease. Isolations were performed in MDCK cells which shown characteristic cytopathogenic effect. Identification of the wild type strains was performed by RT-PCR of a region that encodes NP nucleoprotein associated to RNA. The amplified product was a 287-bp corresponding to positions 769-1055 of the Onderstepoort and Lederle vaccine strains genome, which confirmed presence of the virus in all the samples. The isolate strains were tested by neutralization on MDCK cells with the monoclonal antibody against protein H, and only 6 of them were neutralized. This finding suggests the inability of the vaccine strains to protect the canines against the circulation of some wild type strains.
^cYv18n2a07.htm | | 2 N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp1713article51Key words: Virus; Canine distemper; Molecular study; RT-PCR.
Introducción
^cYv18n2a07.htm~ ~ N 0 5 6 7 9 ; B D C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp1915article51El Distemper Canino fue descripto por Edward Jenner en 1809 y su etiología fue demostrada por Carré en 1906. Es una enfermedad infecto-contagiosa causada por un agente viral del orden Mononegavirales, familia Paramyxoviridae, género Morbillivirus, que produce una infección sistémica con altos índices de morbilidad y apreciable letalidad, principalmente en animales jóvenes y desprotegidos inmunológicamente1. El período de mayor susceptibilidad se da entre los tres y los seis meses de vida, aunque pueden enfermar individuos de todas las edades6,7.
El virus de Distemper Canino (VDC) posee un ARN monocatenario de polaridad negativa, con nucleocápside helicoidal, rodeada de una envoltura lipoproteica que contiene proteínas como Hemaglutinina (H), de Fusión (F) y de Matriz (M), las que participan en los mecanismos de infección, replicación viral y determinan el tropismo. Mundialmente se conoce un solo serotipo. No obstante, varios estudios realizados en distintas latitudes demuestran la existencia de cepas con diferentes genotipos que a su vez difieren de las cepas vacunales5.
La enfermedad reviste dos presentaciones clínicas: una temprana, con compromiso respiratorio, entérico, cutáneo y nervioso agudo; y una tardía, con desarrollo de signos neurológicos por lesiones inmunomediadas1. El virus tiene la particularidad de ser linfotrópico y altamente inmunosupresor. Se lo indica también como agente causal de la encefalitis de perros viejos, una rara encefalomielitis de los perros maduros9. El diagnóstico de esta patología suele ser clínico, con auxilio de métodos complementarios.
Los métodos específicos incluyen el aislamiento en cultivo de líneas celulares como MDCK (Madin-Darby canine kidney) y VERO (Kidney from African Green monkey) y la Inmunofluorescencia Directa (IFD). Pruebas más sensibles son el Enzimainmunoensayo (ELISA) y la Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa reversa (RT-PCR), existiendo en la actualidad métodos de RT-PCR que detectan diferencialmente cadenas de cepas salvajes y cepas vacunales de manera efectiva4.
Aunque se trata de una enfermedad controlada con vacunas vivas atenuadas, se reportan brotes de distemper canino en todo el mundo5. Por nuestra parte, hemos reportado datos epidemiológicos regionales7. En la actualidad es motivo de preocupación la descripción de casos en individuos vacunados3, lo que podría indicar diferencias entre las cepas circulantes y las cepas vacunales utilizadas.
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar genéticamente cepas de campo regionales de virus de Distemper Canino, aisladas a partir de muestras tomadas de perros con diagnóstico clínico de la enfermedad, en la ciudad Santa Fe y zona de influencia de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Litoral (FCV-UNL), Argentina, entre los años 2000 y 2010 y compararlas con cepas vacunales utilizadas en el país. .
Materiales y Métodos
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D h v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2117article51Muestras clínicas
^cYv18n2a07.htm P N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2218article51Las muestras provinieron de 29 caninos con diagnóstico clínico de Distemper Canino procedentes de la ciudad de Santa Fe y de la zona de influencia de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Litoral (Argentina) entre los años 2000 y 2010. De estos animales se obtuvieron hisopados nasales, oculares, faríngeos (tonsilas) y conjuntivales en forma estéril. El material así obtenido se extrajo por presión, acondicionándolo en tubos con 0,5 ml de medio de transporte con el agregado de antibiótico-antimicótico. Las muestras fueron procesadas a 4ºC y se centrifugaron por 15 min a 2000 r.p.m. Los sobrenadantes fueron controlados bacteriológica y micológicamente en agar sangre y en agar ogy en condiciones de aerobiosis y microaerofilia durante cinco días.
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2319article51Aislamientos virales en líneas celulares
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2420article51Se utilizaron líneas celulares establecidas MDCK, (pasajes 121 y sucesivos) certificadas y conservadas en nitrógeno líquido. Las mismas se obtuvieron del Banco de Células Argentino (ABAC). Luego de descongelarse se sembraron en botellas T25 para cultivos celulares empleando D-MEM sin aminoácidos esenciales y 10% de suero fetal bovino (SFB), con Hepes comercial GIBCO al 1% y antibiótico - antimicótico comercial GIBCO al 1% (100000 U/ml de penicilina, 10000 ug de estreptomicina y 25 μg de Fungizona), manteniéndolas en estufa a 37ºC hasta obtener monocapas de 100% de confluencia.
Las monocapas celulares se inocularon con 0,2 ml del sobrenadante de las 29 muestras y se dejaron una hora a 37ºC para permitir la adsorción del virus. Previamente se descartó el medio de crecimiento y se realizaron tres lavados con buffer fosfato salino pH7 (PBS). Se completó el volumen del frasco con D-MEM sin SFB. Cada capa fue observada diariamente realizándose la cosecha de los sobrenadantes de cultivos en el momento de la aparición del efecto citopatogénico (ECP) o en su defecto a los 7-10 días de incubación a 37 ºC. El material proveniente de las 21 muestras que presentaron ECP se recolectó en viales individuales, conservándolos a -20°C hasta la realización de las restantes pruebas. En todos los casos se realizaron tres pasajes consecutivos hasta considerar al material como negativo.
RT-PCR
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D @ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2622article51La RT-PCR se realizó sobre 13 muestras de cultivos celulares elegidas al azar entre las 21 que produjeron ECP. Como controles positivos se utilizaron 4 vacunas comerciales a virus atenuados conteniendo las cepas de referencia (Lederle 1-2010, Lederle 2-2011, Onderstepoort 1-2010 y Onderstepoort 2-2011). Estos materiales provenían de lotes comerciales diferentes. Los controles negativos internos se obtuvieron a partir de los líquidos sobrenadantes de los cultivos de células MDCK sin infectar.
La extracción del RNA se realizó a partir de 150 μL de los respectivos sobrenadantes o vacunas utilizando RNAzol® (Genbiotech), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los primers utilizados para la amplificación de un sector del genoma que codifica la NP (desde la posición 769 a la 1055) fueron descriptos previamente por otros autores2,3. El producto final de amplificación fue de 287 pb.
Para la RT-PCR se utilizó el kit QIAGEN OneStep RT-PCR y un termociclador TECNE modelo TC3000 partiendo de 5 μL del producto de extracción de RNA con el agregado de 1 μL de RNAsin. El programa utilizado fue: un paso de 50°C durante 30 min seguido por un paso de 95ºC de 15 min. Luego 35 ciclos a 94ºC de 1 min, 60ºC de 1 min, 72ºC de 1 min y un paso de extensión final de 72ºC durante 5 min. La reacción se realizó en un volumen de 50 μL.
Los productos obtenidos de la amplificación de controles positivos (cepas vacunales) y controles negativos (células no infectadas) se revelaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, en buffer TBE (Promega), con el agregado de 1x de SBYR Gold nucleic acid gel stain®, durante 50 min a 75 V y 400 mA. Para la visualización de los productos de amplificación de las cepas se realizó el mismo procedimiento.
Neutralización
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D h v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2824article51Las pruebas de microseroneutralización de la glicoproteína H se realizaron en policubetas de 96 pocillos con monocapas de línea MDCK, en su variante suero constante/virus variable. Se utilizó el reactivo comercial VMRD: MoAb- 1 C 42 H 11-IgG 1 que neutraliza el componente H de envoltura de las cepas Rockborn, Snyder Hill y Onderstepoort. Se descartó el medio de crecimiento y se lavaron las células con solución buffer PBS estéril, y se efectuaron diluciones. Luego se tomaron 100 μl de las diluciones 10-1 a 10-5, tituladas por el método de Reed y Muench, a las que se les adicionó 100 μL del anticuerpo monoclonal en dilución 1:20. De esta mezcla se colocaron 50 μL en pocillos, se incubaron durante 60 min a 37º C y posteriormente se adicionaron 100 μL de D-MEM sin SFB. Este procedimiento se realizó por duplicado y durante siete a diez días se observaron y registraron los resultados. La presencia de virus sin neutralizar fue revelada por ECP.
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D Z v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp2925article51Resultados
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D d v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp3026article51A fin de obtener un orden en la identificación de las cepas aisladas, éstas se denominaron en base a criterios tentativos teniendo en cuenta que no existe una estandarización en la nomenclatura de las cepas conocidas de VDC. En la Figura 1 puede observarse que el fragmento 287 pb fue claramente puesto de manifiesto en las cepas vacunales utilizadas como controles positivos Lederle (1 2010) y (2 2011) y Onderstepoort (1 2010) y (2 2011). El mismo estuvo ausente en los dos controles negativos.
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D @ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp3127article51
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de RT-PCR obtenidos a partir de cepas vacunales para la obtención de controles positivos y negativos de referencia. La distribución de las muestras en la corrida electroforética es la siguiente: Calle 1: Vacuna Lederle (1-2010); Calle 2: Vacuna Lederle (2-2011); Calle 3: Vacuna Onderstepoort (1-2010); Calle 4: Vacuna Onderstepoort (2-2011); Calle 5: Control (-); Calle 6: Control (-); Calle 7: Vacío; Calle 8: Control de PM (cada banda tiene un valor de 100 pb
En la figura 2, puede observarse que el fragmento 287 pb fue evidenciado en las trece cepas estudiadas y que resultó idéntico en peso molecular al fragmento obtenido. Dicho fragmento estuvo ausente en los controles negativos
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D T v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp3329article51
Figura 2. Corrida electroforética de RT-PCR (Región NP- Posición 769-1055) de 13 cepas autóctonas de virus Distemper canino aisladas en la ciudad de Santa Fe, Argentina, durante los años 2000 y 2010. La distribución de las muestras es la siguiente: 1-Marcador de PM (100 pbP); 2-CDV/Esperanza-SFE-ARG/58/2000; 3-CDV/Esperanza-SFEARG/ 104/2003; 4-CDV/Esperanza-SFE-ARG/127/2000; 5-CDV/Esperanza-SFEARG/ 264/2001; 6-CDV/Esperanza-SFE-ARG/268/2001; 7-CDV/Esperanza-SFEARG/ 279/2001; 8-CDV/Esperanza-SFE-ARG/284/2001; 9-CDV/Esperanza-SFEARG/ 289/2001; 10-CDV/Esperanza-SFE-ARG/458/2001; 11-CDV/Esperanza-SFEARG/ 516/2005; 12-CDV/Esperanza-SFE-ARG/579/2006; 13-CDV/Esperanza-SFEARG/ 605/2004; 14-CDV/Esperanza-SFE-ARG/632/2004; 15-Control(+)-Vacuna 1-2011- Cepa Onderstepoort; 16-Control (-).
En las pruebas de Neutralización (NT) en células MDCK de las 13 cepas con el anticuerpo monoclonal frente a la proteína H, se evidenció que solo 6 de ellas pudieron ser neutralizadas (Tabla 1).
^cYv18n2a07.htm N 0 5 6 7 9 ; B D - q v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp3531article51
Tabla 1. Resultados obtenidos en las pruebas de neutralización de 13 cepas autóctonas de virus de Distemper Canino con anticuerpo monoclonal frente a la proteína H. Las cepas virales fueron aisladas en la ciudad de Santa Fe, Argentina,entre los años 2000 y 2010. Las pruebas se realizaron en células MDCK.
Discusión y conclusiones
^cYv18n2a07.htm n N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSp3733article51En el presente estudio se tomaron 13 cepas del VDC aisladas en células MDCK que mostraron ECP, a las que se les efectuaron pruebas moleculares mediante el método de RT-PCR, confirmándose de este modo los aislamientos. En las mismas se detectó que el fragmento amplificado de 287 pb fue del mismo peso molecular que los controles de las cepas vacunales de referencia8. Si bien no pudo realizarse la secuenciación, el hecho de que algunas cepas no hayan sido neutralizadas sugiere la presencia de variabilidad antigénica como consecuencia de una variabilidad genética de las cepas autóctonas respecto de las cepas vacunales.
El kit QUIAGEN one step RT-PCR y el funcionamiento del termociclador han sido optimizados para su empleo por los fabricantes, por lo que se descarta la presencia de bandas inespecíficas debidas a fallas en la concentración de Cl2Mg y/o temperatura de hibridización. Por otra parte, el kit mencionado utiliza una Hot-Star Taq DNA polimerasa, lo que reduce considerablemente la formación de dímeros de primers. La no aparición de bandas inespecíficas en el control negativo (Fig. 1 calles 5 y 6) indica que no existe contaminación en los reactivos que pudieran dar lugar a la su formación.
Las muestras para la extracción de RNA para los controles positivos (Fig. 1) se tomaron directamente del envase original comercial. Es aquí donde aparecen bandas inespecíficas en las calles 1, 3 y 4. La calle 2, muestra una concentración menor del producto amplificado de 287 pb, no detectándose bandas inespecíficas. Las mismas no aparecen en ninguna de las calles de la Fig. 2 cuyas muestras para la extracción de RNA se tomaron del sobrenadante de cultivos celulares.
La aparición de esas bandas inespecíficas se atribuye a la amplificación de restos de RNA presente en los viales de vacunas comerciales, debido a la conservación de las mismas.
Las modificaciones halladas en las cepas circulantes podrían sugerir la existencia de mecanismos de evasión de la protección inmunitaria otorgada por las vacunas. En diferentes trabajos alrededor del mundo han sido demostradas claras diferencias a nivel antigénico y genético entre las cepas vacunales más utilizadas y las cepas de campo, con aparición de infecciones en animales vacunados3.
Trabajos complementarios, permitirán estudiar la expresión de las proteínas virales tanto in vitro como in vivo. De esta manera se podrá evaluar la capacidad protectora de las vacunas y eventualmente sugerir modificaciones en la composición de las mismas.
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SINort AmSmall Animal Practice.220080000200838787-79720161200v18n2a07.htm 0 5 6 7 9 : A v B C T b s ? A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc616article96^rND^sMorales^nM.^rND^sMora^nL.^rND^sSalazar^nJ.Distemper canino: sobrevida por edad, sexo raza y estacin.^lesAvances en Ciencias Veterinarias21997000019971220161200v18n2a07.htm 0 5 6 7 9 : A v B C S b s # 0 # 1 A : @ B F H O aT \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc627article97^rND^sPinotti^nM^rND^sGolln^nA^rND^sPasseggi^nC^rND^sFormentini^nEAspectos clnicos y epidemiolgicos del distemper canino: Estudio de casos diagnosticados en la ciudad de Santa Fe, entre los aos 1998 y 2009. Rev. FAVE^lesSec. Cs. Vet.21666-938X20120000201211^s1 y 283-9420161200v18n2a07.htm 0 5 6 7 9 : A v B C W i x = " A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc638article98^rND^sScagliarini^nA^rND^sBattilani^nM^rND^sCiulli^nS^rND^sPrsperi^nS^rND^sMorganti^nLMolecular analysis of the NP Gene of Italian CDV Isolates^lenVeterinary Research Communications2200000002000^s1355-35720161200v18n2a07.htm 0 5 6 7 9 : A v B C V i w > A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc649article99^rND^sVandevelde^nB^rND^sKristensen^nK^rND^sBrand^nC^rND^sGreene^nL.^rND^sHoerlein^nBChronic Canine distemper virus encephalitis in mature dogs^lenVeterinary Pathology21980000019801717-2920161200v18n2a07.html Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSo11article120180306105732v18n2a07.htm64 T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSo11article120180306105733v18n2a08.htm l n: 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y P 1 R Z \ a c A d l # v ! > T F nb F p o r q S U U % U , U A U ^ U n U } U U w S !U A U H $ U l U U U U U U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSh21article1oaesFVET14.0TAB08invet060ndInVet18220161200^f357^l3621668-3498El uso de reacciones de PCR anidadas mejora la tipificacin gentica de Mycoplasma hyopneumoniae a partir de diferentes muestras clnicas^les^rND^1A01^sRebaque^nF^rND^1A02^sLucchesi^nP. M. A.^rND^1A01^sAmbrogi^nA.^rND^1A01^sTamiozzo^nP. J.Universidad de Ro Cuarto^iA01^1Facultad de Agronoma y Veterinaria^2Departamento Patologa AnimalCONICET^iA022016113030/11/20162017062222/06/2017^les^aIdentificar distintos genotipos de Mycoplasma hyopneumoniae es importante para estudiar y entender mejor algunos aspectos epidemiolgicos de la enfermedad que ste produce. La metodologa de MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) sera la ms adecuada para la tipificacin del patgeno a partir de muestras clnicas. El objetivo del presente trabajo fue disear PCR anidadas para los loci VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) P97, H4 y H5 con la finalidad de obtener pruebas de mayor sensibilidad analtica. Para evaluarlas se analizaron muestras de ADN positivas para M. hyopneumoniae en paralelo con una PCR convencional para cada locus y se compararon las proporciones de positivos con cada formato. Dada la mayor sensibilidad de las reacciones desarrolladas en el presente estudio, se recomienda utilizar reacciones anidadas de estos loci para la tipificacin de M. hyopneumoniae en muestras clnicas, y realizarlas en conjunto con la PCR anidada para el locus P146 previamente informada^dnd^i1^tm^les^kMycoplasma hyopneumoniae;^i1^tm^les^kGenotipos^i1^tm^les^kMuestras clnicas^i1^tm^les^kMLVA^i1^tm^les^kP97^i1^tm^les^kP146^i1^tm^les^kH4^i1^tm^les^kH5^i1The use of nested PCR reactions improves genetic typing of Mycoplasma hyopneumoniae from different clinical samples^len^len^aIt is important to identify distinct Mycoplasma hyopneumoniae genotypes to improve the study and understanding of some epidemiological aspects of the disease it produces. MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) methodology would be the most adequate for typing this pathogen from clinical samples. The objective of the present study was to design nested PCR assays for VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) loci P97, H4, and H5 with the aim to obtain a high analytical sensitivity. To evaluate them, DNA samples positive for M. hyopneumoniae were analyzed by the nested PCR assays in parallel to conventional PCR assays, and the proportion of positive results with each approach were compared. Taking into account the higher sensitivity of the PCR assays developed in this study, it was concluded that the recommended approach to type M. hyopneumoniae from clinical samples - even when they contain a low load of the agent- is to perform nested PCR assays for these loci, along with the other one previously informed for P146.^dnd^i2^tm^len^kMycoplasma hyopneumoniae^i2^tm^len^kGenotypes^i2^tm^len^kClinical specimens^i2^tm^len^kMLVA^i2^tm^len^kP97^i2^tm^len^kP146^i2^tm^len^kH4^i2^tm^len^kH5^i2other12v18n2a08.htm n: 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y P 1 R Z \ a c A d l # v / L b F |b F p o r q S #U 1 U 8% U ] U r U U U U U S _DU U $ U U U U U U 0 U > u L H Q S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSf31article1oaesFVET14.0TAB08invet060ndInVet18220161200^f357^l3621668-3498El uso de reacciones de PCR anidadas mejora la tipificacin gentica de Mycoplasma hyopneumoniae a partir de diferentes muestras clnicas^les^rND^1A01^sRebaque^nF^rND^1A02^sLucchesi^nP. M. A.^rND^1A01^sAmbrogi^nA.^rND^1A01^sTamiozzo^nP. J.Universidad de Ro Cuarto^iA01^1Facultad de Agronoma y Veterinaria^2Departamento Patologa AnimalCONICET^iA022016113030/11/20162017062222/06/2017^les^aIdentificar distintos genotipos de Mycoplasma hyopneumoniae es importante para estudiar y entender mejor algunos aspectos epidemiolgicos de la enfermedad que ste produce. La metodologa de MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) sera la ms adecuada para la tipificacin del patgeno a partir de muestras clnicas. El objetivo del presente trabajo fue disear PCR anidadas para los loci VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) P97, H4 y H5 con la finalidad de obtener pruebas de mayor sensibilidad analtica. Para evaluarlas se analizaron muestras de ADN positivas para M. hyopneumoniae en paralelo con una PCR convencional para cada locus y se compararon las proporciones de positivos con cada formato. Dada la mayor sensibilidad de las reacciones desarrolladas en el presente estudio, se recomienda utilizar reacciones anidadas de estos loci para la tipificacin de M. hyopneumoniae en muestras clnicas, y realizarlas en conjunto con la PCR anidada para el locus P146 previamente informada^dnd^i1^tm^les^kMycoplasma hyopneumoniae;^i1^tm^les^kGenotipos^i1^tm^les^kMuestras clnicas^i1^tm^les^kMLVA^i1^tm^les^kP97^i1^tm^les^kP146^i1^tm^les^kH4^i1^tm^les^kH5^i1The use of nested PCR reactions improves genetic typing of Mycoplasma hyopneumoniae from different clinical samples^len^len^aIt is important to identify distinct Mycoplasma hyopneumoniae genotypes to improve the study and understanding of some epidemiological aspects of the disease it produces. MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) methodology would be the most adequate for typing this pathogen from clinical samples. The objective of the present study was to design nested PCR assays for VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) loci P97, H4, and H5 with the aim to obtain a high analytical sensitivity. To evaluate them, DNA samples positive for M. hyopneumoniae were analyzed by the nested PCR assays in parallel to conventional PCR assays, and the proportion of positive results with each approach were compared. 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M. A^rND^1A01^sAmbrogi^nA^rND^1A01^sTamiozzo^nP. J^iA01^1Universidad de Ro Cuarto^2Facultad de Agronoma y Veterinaria^3Departamento Patologa Animal^iA02^1CONICET2016113030/11/20162017062222/06/2017^les^aIdentificar distintos genotipos de Mycoplasma hyopneumoniae es importante para estudiar y entender mejor algunos aspectos epidemiolgicos de la enfermedad que ste produce. La metodologa de MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) sera la ms adecuada para la tipificacin del patgeno a partir de muestras clnicas. El objetivo del presente trabajo fue disear PCR anidadas para los loci VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) P97, H4 y H5 con la finalidad de obtener pruebas de mayor sensibilidad analtica. Para evaluarlas se analizaron muestras de ADN positivas para M. hyopneumoniae en paralelo con una PCR convencional para cada locus y se compararon las proporciones de positivos con cada formato. Dada la mayor sensibilidad de las reacciones desarrolladas en el presente estudio, se recomienda utilizar reacciones anidadas de estos loci para la tipificacin de M. hyopneumoniae en muestras clnicas, y realizarlas en conjunto con la PCR anidada para el locus P146 previamente informada^dnd^i1^tm^les^kMycoplasma hyopneumoniae;^i1^tm^les^kGenotipos^i1^tm^les^kMuestras clnicas^i1^tm^les^kMLVA^i1^tm^les^kP97^i1^tm^les^kP146^i1^tm^les^kH4^i1^tm^les^kH5^i1The use of nested PCR reactions improves genetic typing of Mycoplasma hyopneumoniae from different clinical samples^len^len^aIt is important to identify distinct Mycoplasma hyopneumoniae genotypes to improve the study and understanding of some epidemiological aspects of the disease it produces. MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) methodology would be the most adequate for typing this pathogen from clinical samples. The objective of the present study was to design nested PCR assays for VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) loci P97, H4, and H5 with the aim to obtain a high analytical sensitivity. To evaluate them, DNA samples positive for M. hyopneumoniae were analyzed by the nested PCR assays in parallel to conventional PCR assays, and the proportion of positive results with each approach were compared. 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^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B 7 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp62article59El uso de reacciones de PCR anidadas mejora la tipificación genética de Mycoplasma hyopneumoniae a partir de diferentes muestras clínicas
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2CIVETAN, UNCPBA, CICPBA, CONICET, Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias.
Correspondencia e-mail: Pablo Tamiozzo topo.vet@gmail.com
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Aceptado: 22/06/2017
Resumen
^cYv18n2a08.htm X N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp128article59Identificar distintos genotipos de Mycoplasma hyopneumoniae es importante para estudiar y entender mejor algunos aspectos epidemiológicos de la enfermedad que éste produce. La metodología de MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) sería la más adecuada para la tipificación del patógeno a partir de muestras clínicas. El objetivo del presente trabajo fue diseñar PCR anidadas para los loci VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) P97, H4 y H5 con la finalidad de obtener pruebas de mayor sensibilidad analítica. Para evaluarlas se analizaron muestras de ADN positivas para M. hyopneumoniae en paralelo con una PCR convencional para cada locus y se compararon las proporciones de positivos con cada formato. Dada la mayor sensibilidad de las reacciones desarrolladas en el presente estudio, se recomienda utilizar reacciones anidadas de estos loci para la tipificación de M. hyopneumoniae en muestras clínicas, y realizarlas en conjunto con la PCR anidada para el locus P146 previamente informada.
^cYv18n2a08.htm T N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp139article59Palabras clave: Mycoplasma hyopneumoniae; Genotipos; Muestras clínicas; MLVA; P97; P146; H4, H5.
^cYv18n2a08.htm h N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp1410article59The use of nested PCR reactions improves genetic typing of Mycoplasma hyopneumoniae from different clinical samples
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp1511article59Summary
^cYv18n2a08.htm & N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp1612article59It is important to identify distinct Mycoplasma hyopneumoniae genotypes to improve the study and understanding of some epidemiological aspects of the disease it produces. MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeats Analysis) methodology would be the most adequate for typing this pathogen from clinical samples. The objective of the present study was to design nested PCR assays for VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) loci P97, H4, and H5 with the aim to obtain a high analytical sensitivity. To evaluate them, DNA samples positive for M. hyopneumoniae were analyzed by the nested PCR assays in parallel to conventional PCR assays, and the proportion of positive results with each approach were compared. Taking into account the higher sensitivity of the PCR assays developed in this study, it was concluded that the recommended approach to type M. hyopneumoniae from clinical samples - even when they contain a low load of the agent- is to perform nested PCR assays for these loci, along with the other one previously informed for P146.
^cYv18n2a08.htm R N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp1713article59Key words: Mycoplasma hyopneumoniae; Genotypes; Clinical specimens; MLVA; P97; P146; H4; H5.
Introducción
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ( v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp1915article59El Mycoplasma hyopneumoniae es el agente causal de la neumonía enzoótica porcina (NEP), una enfermedad respiratoria crónica de los cerdos11 de alto impacto económico en la producción porcina de nuestro país y el mundo. Reconocer distintos genotipos del microorganismo es importante ya que permitiría entender mejor algunos aspectos epidemiológicos que redundarían en un mejor control de la NEP. Tal variabilidad ha sido informada utilizando distintas técnicas moleculares5-7, de las cuales el análisis de las repeticiones en tándem de número variable en múltiples loci (MLVA, por sus siglas en inglés) ha sido señalado como el más adecuado para la tipificación del patógeno a partir de muestras clínicas12.
El desarrollo y/o adaptación de estas técnicas con una gran sensibilidad analítica es ideal ya que permitiría la identificación de perfiles genéticos del agente a partir de muestras con baja carga del microorganismo, lo que resulta en la posibilidad de tomar muestras clínicas poco invasivas. Así, la utilización de la técnica de PCR anidada sería de elección para trabajar con material clínico, dada su elevada sensibilidad.
Debido a que dentro del amplio repertorio de regiones polimórficas propuesto por de Castro et al.2, los loci P146, P97, H4 y H5 han sido señalados como los más polimórficos 2, 12 y dado que nosotros ya hemos informado sobre el desarrollo de una PCR anidada para la región R3 del locus P1468 que ha permitido la tipificación genética del agente a partir de muestras clínicas8, 10, el objetivo del presente trabajo fue diseñar PCR anidadas para los loci P97, H4 y H5 con la finalidad de obtener pruebas de mayor sensibilidad analítica.
Materiales y Métodos
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D 5 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2117article59Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Patología Animal de la Facultad de Agronomía y Veterinaria (UNRC, Río Cuarto, Córdoba, Argentina), de acuerdo con las normas internacionales del Consejo Internacional de Organizaciones de las Ciencias Médicas (CIOMS).
En distintos experimentos se amplificaron mediante reacciones de PCR estándar y PCR anidadas tres regiones VNTR altamente polimórficas de los loci: P97, H4, H5 a partir de diferentes tipos de muestras. Todas las muestras habían sido positivas a la PCR anidada considerada tamiz, que se utiliza de rutina en el Laboratorio de Patología Animal-FAV-UNRC para la detección de M. hyopneumoniae1.
Previo al análisis de las muestras y con el fin de estimar la sensibilidad de las PCR de tres loci analizados, se hicieron cinco diluciones en base 10 del ADN de una cepa pura (M. hyopneumoniae 232) con una concentración inicial de 207,87 ng/μl, que fueron amplificadas por ambos formatos de PCR utilizando los cebadores y condiciones propias de cada loci que se detallan en cada experimento.
Experimento 1: VNTR R1 del locus P97
^cYv18n2a08.htm N N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2319article59Se trabajó con un total de 48 muestras de ADN de dis tintos or í genes [23 muestras provenientes de seis bacterinas comerciales contra M. hyopneumoniae, 14 muestras de lavados bronquio-alveolares (LBA) y 11 muestras de hisopados nasales (HN)]. Las muestras fueron amplificadas independientemente por una PCR convencional y otra anidada. La primera, considerada la PCR estándar, utilizando los cebadores y condiciones descriptas por de Castro et al.2 para el locus P97R1. La segunda, una PCR anidada utilizando en la primera ronda de amplificación esos cebadores y condiciones, y en la segunda utilizando los cebadores y condiciones descriptas por Vranckx et al.12 para el mismo locus con las siguientes condiciones de ciclado: 95°C por 5 min de desnaturalización inicial, 35 ciclos de 95°C por 45 seg (desnaturalización), 52°C por 45 seg (annealing) y 72°C por 45 seg (extensión), con una extensión final de 72°C por 10 min. Los productos de PCR fueron visualizados en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Al igual que en los experimentos que se describen a continuación, se comparó la proporción de muestras positivas a la PCR estándar vs la PCR anidada usando el programa Epidat 4.1
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D g v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2420article59Experimento 2: VNTR H4
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D V v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2521article59En este caso se trabajó con 21 muestras de ADN de distintos orígenes (6 de bacterinas comerciales de M. hyopneumoniae, 11 de LBA y 4 de HN). Para la PCR estándar, se utilizaron los cebadores y condiciones descriptas por de Castro et al.2 para el locus H4. En la primera ronda de amplificación de la PCR anidada se utilizaron dichos cebadores y condiciones, y en la segunda ronda, los informados por Vranckx et al.12.
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D w v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2622article59Experimento 3: VNTRs R1/R2 del locus H5
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D J v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2723article59Para el desarrollo de una PCR anidada de los VNTRs del locus H5, se diseñaron cebadores para la primera ronda de amplificación y se determinaron las condiciones para la misma. Los cebadores fueron diseñados utilizando el programa Primer3 (v. 0.4.0), tomando como base las secuencias del gen H5 de tres cepas de M. hyopneumoniae disponibles en el GenBank (secuencias codificantes MHJ0662 de la cepa J, mhp683 de la cepa 232 y MHP0662 de la cepa 7448). Los cebadores diseñados fueron: H5TAM-F 3`-GCAAAAATAGGTAAGGGGTCAA-5` y H5TAM-R 3`-TTTGATTTTGCCTGGGAAGT -5`. La especificidad de los cebadores fue evaluada in silico utilizando Primer-BLAST e in vitro amplificando ADN de: M. hyopneumoniae (cepa 232), cepas vacunales de dos bacterinas comerciales contra el agente, Mycoplasma gallisepticum (cepa X95), Mycoplasmas ynoviae (cepa WVU), Mycoplasma mycoides (V. myc PG1), Mycoplasma hyorhinis (cepa BTS-7) y cepas de campo de Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis y Mycoplasma canadense. Las condiciones de amplificación fueron: 30 μL de volumen final, con 5 μL de ADN templado, 200 μM de cada dNTP, 0,2 μM de cada cebador, 3 mM de MgCl2, buffer de PCR 1X (provisto con la Taq polimerasa) y 2,5 U Taq polimerasa (T-Plus ADN polimerasa, Inbio-Highway), bajo las siguientes condiciones de ciclado: desnaturalización inicial de 94°C por 5 min, seguida por 35 ciclos de 94°C por 2 min (desnaturalización), 56°C por 2 min (annealing) y 72°C por 2 min (extensión), con una extensión final de 72°C por 10 min.
Una vez confirmada la especificidad y luego de determinar la sensibilidad, se trabajó con 57 muestras de LBA que fueron amplificadas con la PCR estándar utilizando los cebadores y condiciones descriptos por de Castro et al.2 y una PCR anidada, utilizando en la primera ronda de amplificación los cebadores H5TAM-F/ H5TAM-R bajo las condiciones arriba descriptas y en la segunda ronda de amplificación los cebadores y condiciones descriptos por de Castro et al.2, utilizando como templado 2 μL del producto de la primera reacción.
Resultados
^cYv18n2a08.htm Z N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp2925article59Para los tres loci analizados, la sensibilidad de la PCR anidada fue mayor a la PCR estándar (tabla 1). En el caso de P97 y de H4, la PCR anidada fue capaz de detectar una dilución más que la PCR estándar, siendo la sensibilidad de la PCR anidada equivalente a una concentración en la muestra de 2,08 ng de ADN de M. hyopneumoniae/μl para P97 y de 0,21 ng de ADN/μl para H4. En el caso de H5, el uso de la PCR anidada permitió detectar hasta dos diluciones más (0,02 ng/ μl) respecto a la PCR estándar (tabla 1).
^cYv18n2a08.htm 6 N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp3026article59
Tabla 1. Límite de detección de las PCR estándar y anidadas para los loci P97, H4 y H5 utilizando diluciones en base 10 de ADN de la cepa 232 de M. hyopneumoniae.
La mayor sensibilidad de las PCR anidadas se observó de igual modo en el análisis de las muestras clínicas ya que su uso permitió la amplificación de una mayor proporción de muestras que fue estadísticamente significativa (p <0,05) para H4 y H5. En las tablas 2 y 3 se muestra la proporción de positivos para cada tipo de muestra y el total para P97 y H4 respectivamente.
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ; v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp3228article59Tabla 2. Proporción de muestras donde se obtuvo amplificación para el VNTR R1 P97 con la PCR estándar (cebadores descriptos por de Castro et al. 2006) vs PCR anidada (cebadores descriptos por de Castro et al.2 +Vranckx et al.12).*p= 0,057
Tabla 3. Proporción de muestras donde se obtuvo amplificación para el VNTR H4 con la PCR estándar (cebadores descriptos por de Castro et al.2) vs PCR anidada (cebadores descriptos por de Castro et al.2- Vranckx et al.12). *p= 0,049 (IC95% - 0,555 -0,017).
Respecto al locus H5, los cebadores diseñados fueron específicos in silico e in vitro puesto que no amplificaron en otras muestras que no fueran M. hyopneumoniae. La PCR estándar detectó 16/57 muestras de LBA, mientras que la PCR anidada detectó 35/57 (p= 0,0007 [IC95% - 0,523 -0,144]).
Los productos de PCR de los tres loci fueron secuenciados y este análisis confirmó la especificidad de la PCR anidada.
Discusión
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D % i v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp3632article59La identificación de distintos perfiles genéticos de M. hyopneumoniae resulta muy útil para estudios epidemiológicos enfocados a identificar el origen de brotes, evaluar la transmisión aérea3, determinar infección o reinfección y evaluar programas de saneamiento de granjas porcinas9. Contar con técnicas muy sensibles permitiría realizar estos estudios a partir de muestras poco invasivas, sin complicadas maniobras semiológicas y sin necesidad de sacrificar animales en las granjas, hecho que está siendo regulado por la Comunidad Económica Europea en lo que respecta a bienestar animal.
Los loci P97, P146, H4 y H5 son altamente polimórficos2 y son adecuados para la tipificación por MLVA de M. hyopneumoniae a partir de muestras clínicas12. Incluso un reciente estudio demostró un alto poder discriminatorio analizando sólo los loci P97 y P1464. Sin embargo, la incorporación de otros dos loci como H4 y H5 convierte a esta herramienta de tipificación en más robusta. En un trabajo previo, desarrollamos una reacción de PCR anidada para el locus P146, que fue útil para la tipificación genética de M. hyopneumoniae en piaras de nuestro país8 y también para la tipificación y posterior comparación de los perfiles genéticos de cepas vacunales y muestras de LBA de cerdos de distintas piaras10.
Las reacciones anidadas, adaptadas y/o desarrolladas en el presente trabajo para los loci P97, H4 y H5 fueron más sensibles que las PCR estándar para los mismos loci desarrolladas por de Castro et al.2. Esto aumenta las posibilidades de tipificar al agente a partir de muestras con escasa cantidad de ADN de M. hyopneumoniae, incluso en infecciones subclínicas, pudiéndose analizar muestras clínicas poco invasivas como hisopados nasales.
Conclusión
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D b v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp3834article59Dado el alto grado de polimorfismo de los loci P97, P146, H4 y H5 y la mayor sensibilidad de las reacciones adaptadas y desarrolladas en el presente estudio, además de la previamente informada para P146, consideramos que la tipificación de M. hyopneumoniae utilizando reacciones anidadas de estos cuatro loci es la técnica recomendada cuando se analizan muestras clínicas, incluso cuando éstas posean una baja carga del agente.
^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ~ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp3935article59 ^cYv18n2a08.htm T 0 5 6 7 9 ; B xD E L v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp4036article5911. Calsamiglia, M.; Pijoan, C.; Trigo, A. Applications of a nested- polymerase chain reaction assay to detect Mycoplasma hyopneumoniae from nasal swabs. J. Vet. Diag. Inv. 1999; 1: 246-51. ^cYv18n2a08.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSp4137article59
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^cYv18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D X g u q A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc641article121^rND^sCalsamiglia^nM^rND^sPijoan^nC^rND^sTrigo^nAApplications of a nested- polymerase chain reaction assay to detect Mycoplasma hyopneumoniae from nasal swabs^lenJ. Vet. Diag. Inv21999000019991246-5120161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D Y s * t A @ a& . v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc652article122^rND^sde Castro^nL.A.^rND^sRodrigues Pedroso^nT^rND^sKuchiishi^nS.S.et alVariable number of tandem aminoacid repeats in adhesion-related CDS products in Mycoplasma hyopneumoniae strains^lenVet. Microbiol.2200600002006116258-6920161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D Q ` q ~ A @ a % v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc663article123^rND^sDee^nS.^rND^sOtake^nS.^rND^sOliveira^nS^rND^sDeen^nJEvidence of long distance airborne transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae^lenVet. 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Microbiol.2201100002011152338-4520161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D W f *u { m A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc696article126^rND^sStakenborg^nT^rND^sVicca^nJ.^rND^sButaye^nPet al.The diversity of Mycoplasma hyopneumoniae within and between herds using pulsed-field gel electrophoresis^lenVet. Microbiol.2200500002005109^s1-229-3620161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D W e *s y Z A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc707article127^rND^sStakenborg^nT^rND^sVicca^nJ^rND^sMaes^nD.et al.Comparison of molecular techniques for the typing of Mycoplasma hyopneumoniae isolates^lenJ. Microbiol. Methods.2200600002006662263-7520161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D U k | % A & @ . 2 4 a9 A v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc718article128^rND^sTamiozzo^nP^rND^sLucchesi,^nP.M.A^rND^sAmbrogi^nA.Diversidad gentica de Mycoplasma hyopneumoniae en granjas porcinas de Argentina [Mycoplasma hyopneumoniae genetic diversity in swine farms from Argentina]^lesInVet.22011000020111327-3520161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 : A v C D V m ~ 2 A 3 @ ; ? A aG O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc729article129^rND^sTamiozzo^nP.^rND^sLucchesi,^nP.M.A.^rND^sAmbrogi^nA.Monitoring for Mycoplasma hyopneumoniae before and after a partial depopulation program using a typing scheme based on the polyserine repeat motif of p146.^lenJ. Swine Health Prod.220130000201321309-1220161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 ; B v D F W f *} G A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc7310article1210^rND^sTamiozzo^nP^rND^sZamora^nR^rND^sLucchesi,^nP.M.A.et alMLVA typing of Mycoplasma hyopneumoniae bacterins and field strains^lenVet. Rec. Open.220150000201520161200v18n2a08.htm Z 0 5 6 7 9 ; B v D F V f w > B C A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc7411article1211^rND^sThacker^nE^rND^sMinion^nC.Mycoplasmosis^lenDiseases of Swine2Wiley-Blackwell PublishingIowaUSA20120000201220161200v18n2a08.htm 0 5 6 7 9 ; B v D F V c *q w " A # @ + / 1 a7 ? v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc7512article1212^rND^sVranckx^nK^rND^sMaes^nD^rND^sCalus^nDet al.Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis is a suitable tool for differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae strains without cultivation^lenJ. Clin. Microbiol.2201100002011492020-320161200v18n2a08.htm Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSo11article120180306105733v18n2a08.htm75 T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSo11article120180306105733v18n2a09.htm J4 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y Q 1 S [ ] b d A e m # w ^ & A F X5 F F O p o r q S U U U U U / IW S [U U U U ) U = u X H ] _ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSh21article1oaesFVET14.0ILUS09invet060ndInVet18220161200^f363^l3701668-3498Desarrollo de una tcnica de inmunodifusin para la deteccin del virus Sacbrood en abejas^les^rND^1A01^sAlbo^nGN.^rND^1A01^sKuzmanich^nR.^rND^1A02 A03^sReynaldi^nFJ.^rND^1A02 A03^sPicotto^nLD.^rND^1A03^sSguazza^nGH.UNLP^iA01^1Facultad de Ciencias Agrarias y ForestalesCONICET^iA02^cLa PlataUNLP^iA03^1Facultad de Ciencias Veterinarias^cLa Plata^sBuenos Aires^pARGENTINA2016112828/11/20162017062222/06/2017^les^aLa apicultura es una de las actividades agrcolas ms importantes de la Repblica Argentina. En los ltimos aos se ha observado, a nivel mundial, una marcada disminucin en el nmero de abejas. La mortalidad de las abejas, puede atribuirse a la interaccin de factores ambientales, al manejo de las colonias o a la accin de diversos microorganismos, entre ellos los virus. Teniendo en cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con tcnicas de diagnostico moleculares para la deteccin de virus, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un test de inmunodifusin que permita la deteccin del Virus de la Cra Ensacada de forma ms sencilla y econmica. Para ello una cepa autctona del virus Virus de la Cra Ensacada fue utilizada para inocular un conejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos especficos contra este virus, que posteriormente fueron utilizados para estandarizar la tcnica de inmuodifusin. Esta tcnica podra ser de gran utilidad en el futuro para realizar un relevamiento rpido de las condiciones sanitarias para SBV en colmenas de la Repblica Argentina ya que debido a su baja complejidad podra ser llevada a cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el pas.^dnd^i1^tm^les^kAbejas melferas^i1^tm^les^kVirus^i1^tm^les^kCra ensacada^i1^tm^les^kInmunodifusin^i1Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus^len^len^aBeekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.^dnd^i2^tm^len^kHoney bees^i2^tm^len^kVirus^i2^tm^len^kSacbrood^i2^tm^len^kImmunodiffusion^i2other16v18n2a09.htm J4 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M y Q 1 S [ ] b d A e m # w e - H F _5 F F O p o r q S U U U U U 6 Pe S [U U U - U > U R u m H r t v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUS09invet060ndInVet18220161200^f363^l3701668-3498Desarrollo de una tcnica de inmunodifusin para la deteccin del virus Sacbrood en abejas^les^rND^1A01^sAlbo^nGN.^rND^1A01^sKuzmanich^nR.^rND^1A02 A03^sReynaldi^nFJ.^rND^1A02 A03^sPicotto^nLD.^rND^1A03^sSguazza^nGH.UNLP^iA01^1Facultad de Ciencias Agrarias y ForestalesCONICET^iA02^cLa PlataUNLP^iA03^1Facultad de Ciencias Veterinarias^cLa Plata^sBuenos Aires^pARGENTINA2016112828/11/20162017062222/06/2017^les^aLa apicultura es una de las actividades agrcolas ms importantes de la Repblica Argentina. En los ltimos aos se ha observado, a nivel mundial, una marcada disminucin en el nmero de abejas. La mortalidad de las abejas, puede atribuirse a la interaccin de factores ambientales, al manejo de las colonias o a la accin de diversos microorganismos, entre ellos los virus. Teniendo en cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con tcnicas de diagnostico moleculares para la deteccin de virus, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un test de inmunodifusin que permita la deteccin del Virus de la Cra Ensacada de forma ms sencilla y econmica. Para ello una cepa autctona del virus Virus de la Cra Ensacada fue utilizada para inocular un conejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos especficos contra este virus, que posteriormente fueron utilizados para estandarizar la tcnica de inmuodifusin. Esta tcnica podra ser de gran utilidad en el futuro para realizar un relevamiento rpido de las condiciones sanitarias para SBV en colmenas de la Repblica Argentina ya que debido a su baja complejidad podra ser llevada a cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el pas.^dnd^i1^tm^les^kAbejas melferas^i1^tm^les^kVirus^i1^tm^les^kCra ensacada^i1^tm^les^kInmunodifusin^i1Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus^len^len^aBeekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.^dnd^i2^tm^len^kHoney bees^i2^tm^len^kVirus^i2^tm^len^kSacbrood^i2^tm^len^kImmunodiffusion^i2other16v18n2a09.htm N V6 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y y ] 1 _ g i n p A q y # ^ / I F _Z F F Q p " o * r 4 q < S FU U U 5 U F U _ yW S [U + U 2 U H U Y U m u H \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilus09invet060ndInVet18220161200^f363^l3701668-3498Desarrollo de una tcnica de inmunodifusin para la deteccin del virus Sacbrood en abejas^les^rND^1A01^sAlbo^nGN^rND^1A01^sKuzmanich^nR^rND^1A02 A03^sReynaldi^nFJ^rND^1A02 A03^sPicotto^nLD^rND^1A03^sSguazza^nGH^iA01^1UNLP^2Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales^cLa Plata^sBuenos Aires^pARGENTINA^iA02^1CONICET^cLa Plata^iA03^1UNLP^2Facultad de Ciencias Veterinarias^cLa Plata^sBuenos Aires^pARGENTINA2016112828/11/20162017062222/06/2017^les^aLa apicultura es una de las actividades agrcolas ms importantes de la Repblica Argentina. En los ltimos aos se ha observado, a nivel mundial, una marcada disminucin en el nmero de abejas. La mortalidad de las abejas, puede atribuirse a la interaccin de factores ambientales, al manejo de las colonias o a la accin de diversos microorganismos, entre ellos los virus. Teniendo en cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con tcnicas de diagnostico moleculares para la deteccin de virus, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un test de inmunodifusin que permita la deteccin del Virus de la Cra Ensacada de forma ms sencilla y econmica. Para ello una cepa autctona del virus Virus de la Cra Ensacada fue utilizada para inocular un conejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos especficos contra este virus, que posteriormente fueron utilizados para estandarizar la tcnica de inmuodifusin. Esta tcnica podra ser de gran utilidad en el futuro para realizar un relevamiento rpido de las condiciones sanitarias para SBV en colmenas de la Repblica Argentina ya que debido a su baja complejidad podra ser llevada a cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el pas.^dnd^i1^tm^les^kAbejas melferas^i1^tm^les^kVirus^i1^tm^les^kCra ensacada^i1^tm^les^kInmunodifusin^i1Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus^len^len^aBeekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.^dnd^i2^tm^len^kHoney bees^i2^tm^len^kVirus^i2^tm^len^kSacbrood^i2^tm^len^kImmunodiffusion^i2other16v18n2a09.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200009 " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp51article71ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a09.htm \ N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp62article71Desarrollo de una técnica de inmunodifusión para la detección del virus Sacbrood en abejas
^cYv18n2a09.htm p N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp73article71Albo, GN.1*; Kuzmanich, R.1; Reynaldi, FJ.2,3; Picotto, LD.2,3; Sguazza, GH.3
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 8 9 @ B H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp84article711Curso de Producción Animal I. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP,
2CCT-CONICET La Plata
3LAVIR (Laboratorio de Virología), Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP * e-mail: albo.graciela@yahoo.com.ar; Calle 60 y 118 s/n. Curso de Producción Animal I. FCAyF, UNLP. La Plata, Provincia de Buenos Aires. ARGENTINA
Recibido: 28/11/2016
Aceptado: 22/06/2017
Resumen
^cYv18n2a09.htm p N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp117article71La apicultura es una de las actividades agrícolas más importantes de la República Argentina. En los últimos años se ha observado, a nivel mundial, una marcada disminución en el número de abejas. La mortalidad de las abejas, puede atribuirse a la interacción de factores ambientales, al manejo de las colonias o a la acción de diversos microorganismos, entre ellos los virus. Teniendo en cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con técnicas de diagnostico moleculares para la detección de virus, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un test de inmunodifusión que permita la detección del Virus de la Cría Ensacada de forma más sencilla y económica.
Para ello una cepa autóctona del virus Virus de la Cría Ensacada fue utilizada para inocular un conejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos específicos contra este virus, que posteriormente fueron utilizados para estandarizar la técnica de inmuodifusión. Esta técnica podría ser de gran utilidad en el futuro para realizar un relevamiento rápido de las condiciones sanitarias para SBV en colmenas de la República Argentina ya que debido a su baja complejidad podría ser llevada a cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el país.
Palabras clave: Abejas melíferas; Virus; Cría ensacada; Inmunodifusión.
^cYv18n2a09.htm H N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp139article71Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp1410article71Summary
^cYv18n2a09.htm < N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp1511article71Beekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.
^cYv18n2a09.htm . N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp1612article71Key words: Honey bees; Virus; Sacbrood; Immunodiffusion.
Introducción
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D + v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp1814article71La apicultura es importante para el hombre, fundamentalmente por el rol de la abeja melífera (Apis mellífera., L) en su desempeño como polinizador de cultivos10. La polinización no solo asegura la reproducción sexual en la mayoría de la plantas con flores, si no también, en forma indirecta la sustentabilidad productiva y el mantenimiento de la biodiversidad de la mayoría de los ecosistemas terrestres14. En particular la polinización producida por las abejas es necesaria para más del 35% de los cultivos del mundo que producen alimentos básicos para el hombre1.
Desde el punto de vista de la producción de miel, la apicultura es una de las actividades agrícolas más importantes de la República Argentina (en la actualidad, nuestro país ocupa el 5º lugar como productor mundial de miel) lo que representa un ingreso promedio anual cercano a los 100 millones de dólares, provenientes de la explotación de más de 4,5 millones de colmenas.
Desde octubre de 2006, comenzaron a producirse a gran escala, pérdidas inexplicables de abejas en Estados Unidos y la Unión Europea, que afectaron negativamente la oferta global de miel. El fenómeno, denominado “Síndrome de despoblamiento de las colmenas” (SDC), fue en parte responsable de la disminución del 2% en la producción mundial de miel, desde 2006 hasta 2007. En la actualidad, el SDC sigue siendo un problema para la producción y el comercio de miel; particularmente en Estados Unidos y la Unión Europea, que han sido las regiones más afectadas.
Las abejas son susceptibles de padecer enfermedades causadas por distintos tipos de parásitos, hongos, bacterias y virus. En los últimos años las enfermedades de origen viral de las abejas han adquirido un particular interés ya que han causado diversos problemas en países productores como en Estados Unidos5. Hasta el presente se han identificado 24 virus de abejas que infectan las colonias 6, 9. La mayoría de estos virus tienen un genoma de ARN de simple cadena con polaridad positiva y son clasificados como virus tipo Picornavirus 4, 12. Si bien muchos de estos virus con frecuencia existen en la colonia como infecciones latentes pueden multiplicarse rápidamente bajo condiciones de estrés y causar enfermedad.
En A. mellifera la enfermedad de la cría ensacada es producida por el virus Sacbrood, también conocido como SBV (de acuerdo a su sigla en inglés). El SBV pertenece al Género Iflavirus, Familia Iflaviridae, Orden Picornavirales. SBV es una de las virosis de abejas más extensamente distribuidas, encuentrandose en colonias de A. mellifera de todos los continentes.
En la cría en desarrollo el virus se multiplica en el interior de las glándulas dermales que recubren el cuerpo del insecto; dichas glándulas son las encargadas de segregar enzimas que desprenden la cutícula durante el proceso de muda. El virus inhibe la secreción de estas enzimas, por lo que la larva no puede desprenderse de su cutícula. Por lo tanto, las larvas van cambiando de color conforme progresa la enfermedad.
No obstante, SVB también se multiplica en abejas jóvenes sin causar síntomas aparentes2, esto permite que el virus persista en las colonias año a año, sin embargo no se observa un gran porcentaje de muerte de larvas porque las abejas adultas detectan y remueven la mayoría de las larvas en estadios tempranos de infección. Los brotes más comunes de esta enfermedad ocurren en primavera y a comienzos de verano o cuando el forraje es limitado3. Ya que los efectos de la infección viral no siempre son observables, existe un reto adicional en el diagnóstico y seguimiento de estas infecciones virales6. El conocimiento de la incidencia y diseminación de cada uno de estos virus a nivel mundial, es vital para la predicción de epizootias, lo cual permite, el control más efectivo de la enfermedad. Los datos epidemiológicos de la enfermedad también aportarían información sobre la causa de la resistencia de las abejas de América del Sur con respecto a las de América del Norte y Europa6.
En base a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue el de desarrollar un método de doble inmunodifusión con el fin de simplificar el diagnostico de esta enfermedad. .
Materiales y Métodos
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D w v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2016article71Aislamiento y purificación viral
^cYv18n2a09.htm $ N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2117article71Para el desarrollo de este trabajo se utilizó como punto de partida una cepa autóctona de SBV, previamente aislada en la Cátedra de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNLP durante el año 2011. Con el fin de aumentar el título viral de esta muestra, se inoculo inicialmente 10μl de la suspensión viral en el abdomen de 15 pupas de abejas de 15 días de edad (pupas de ojos rojos), utilizando una jeringa Hamilton. Una vez inoculadas las pupas fueron mantenidas a 22°C (±1) durante tres días (para permitir la replicación del virus). Transcurrido el tiempo de incubación, se realizo un macerado en mortero con arena estéril de las pupas infectadas con solución fisiológica. El homogenizado obtenido fue clarificado por centrifugación a 5.000 g durante 15 minutos, y posteriormente esterilizado por filtración (con filtro de 0,22 μm) y almacenado a -70°C hasta su uso. De la misma manera que se explicó anteriormente, se realizaron dos nuevos pasajes del virus en un mayor número de pupas de abeja (40 y 100 pupas respectivamente).
La suspensión viral obtenida en los tres pasajes se concentró por centrifugación a 28.000 g durante 5 horas y posteriormente fue purificada por ultra-centrifugación en gradiente de sacarosa (20-60%) a 40.000 g en una Ultracentrífuga (Beckman, Modelo L8-80M) con un rotor de ángulo fijo (Type 50Ti) a 5ºC durante 6 horas.
La fracción que contenía las partículas virales fue finalmente concentrada por ultracentrifugación a 28.000 g durante 4 horas. El pellet que se obtuvo fue resuspendido en solución fisiológica, la suspensión obtenida de esta manera se esterilizo por filtración con filtro de 0,22 μm y conservada a -70° C hasta su posterior uso en los ensayos de obtención de anticuerpos. Para confirmar la presencia del virus en la fracción purificada se llevo a cabo un examen por microscopia electrónica. La identidad del virus purificado fue corroborada por medio de una RT-PCR que permite la detección de distintos virus de abejas (entre ellos SBV) previamente estandarizada en nuestro laboratorio13.
Obtención de anticuerpos anti-SBV
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ( v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2319article71 Para la obtención de anticuerpos específicos contra SBV, la solución de virus previamente purificada fue inoculada en un conejo de acuerdo al protocolo estándar16. Brevemente, la suspensión de virus purificado conteniendo aproximadamente 250 μg de proteínas virales totales fue combinada en partes iguales con adyuvante completo de Freund y se mezcló enérgicamente con ayuda de un vortex durante 5 minutos. La emulsión así obtenida (aproximadamente 1 cm3) fue inoculada en un conejo por vía subcutánea. A los 15 días post-inoculación se efectuó una segunda inoculación (1er booster) con las mismas condiciones descriptas anteriormente, pero utilizando adyuvante incompleto de Freund. A los 30 días posteriores a la primo-inoculación se realizó una tercera inoculación (2do booster) utilizando 500 μg de la solución de proteínas virales totales en solución acuosa (sin adyuvante). Todas las técnicas previamente descriptas fueron avaladas por el CICUAL (protocolo nº 58-4-16P).
Pasados los 45 días post-inoculación, una muestra de suero del conejo inoculado fue analizada por un ensayo de western blot con el fin de confirmar la presencia de anticuerpos contra el virus.
Western Blot
^cYv18n2a09.htm < N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2521article71El análisis del suero por western blot se llevo a cabo de acuerdo al protocolo original de Towbin15. Inicialmente se sembraron 15 μl de la solución viral (la misma con que se inoculó el conejo) en un gel de poliacrilamida al 12,5%. Luego de la electroforesis el gel se equilibro con un buffer de transferencia (48 mM Tris, 39 mM Glicina y 20% metanol - pH 9.2) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, previamente humedecida en el mismo buffer, aplicando una corriente transversal de 15 V durante 30 min. Una vez realizada la transferencia, la membrana se bloqueo con una solución de PBS conteniendo 5% de leche en polvo durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente la membrana se incubó con una dilución 1:500 del suero obtenido del conejo durante 2 hs a 37ºC con agitación suave, luego se realizaron 3 lavados con PBS con 0.1% de Tween-20. Finalmente la membrana se incubó con una dilución 1:2000 del segundo anticuerpo (anti-conejo marcado con peroxidasa) durante 2 hs a 37º con agitación suave. El revelado se realizó incubando la membrana en una solución de diaminobencidina y agua oxigenada. También se utilizo como control negativo, un suero normal de conejo en las mismas condiciones previamente descriptas.
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D y v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2622article71Desarrollo del test inmunodifusión
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D % v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2723article71Una vez que se comprobó la presencia de anticuerpos en el conejo inoculado, este fue sangrado. El suero obtenido se fracciono en alícuotas y se conservaron a -20°C para su posterior uso en el desarrollo de la prueba de inmunodifusión. La técnica de inmunodifusión se realizó en placas de Petri de acuerdo al método de Ouchterlony8. Para ello, se realizaron perforaciones en el gel con un sacabocados de 6 pocillos periféricos alrededor de un pocillo central (en forma de roseta). El suero específico anti-SBV fue colocado en el pocillo central y el antígeno control (virus purificado) en tres pocillos exteriores alternados, mientras que las muestras a probar en los fueron sembradas en los tres pocillos restantes. Finalmente la placa fue incubada en atmósfera de humedad dentro de un rango de temperatura de 20 a 25ºC y se realizó la lectura de las líneas de precipitación utilizando una luz puntiforme a las 24-48 hs.
Para conseguir las condiciones óptimas de precipitación, en primer lugar se probaron distintas cantidades de salinidad y pH del agar y posteriormente se estandarizaron las concentraciones de antígeno y anticuerpos. Una vez puesta a punto la técnica, se analizaron 40 muestras de campo obtenidas a partir del sobrenadante del macerado de 15 abejas en 2 ml de PBS provenientes de distintos colmenares de la provincia de Buenos Aires. Todos los resultados obtenidos por la prueba de inmunodifusion (tanto positivos como negativos) fueron confirmados por medio de una RT-PCR13.
Resultados
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D w v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp2925article71Aislamiento y purificación viral
^cYv18n2a09.htm b N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp3026article71La suspensión viral obtenida luego de los tres pasajes por pupas fue concentrada y parcialmente purificada por ultra-centrifugación (Figura 1A). La fracción purificada fue analizada por microscopia electrónica para confirmar la presencia del virus, observándose partículas virales correspondientes a virus sin envoltura, con simetría icosaédrica y un diámetro de aproximadamente 30nm, consistente con las características esperadas para un picornavirus (Figura 1B). Para corroborar la identidad del virus purificado se realizó una RT-PCR, por medio de la cual pudo observarse la presencia de una banda de aproximadamente 350pb (Figura 1C), lo cual se condice con el tamaño esperado del fragmento amplificado a partir del virus SBV (342pb).
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D m v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp3127article71
Figura 1. A: Purificación del virus por ultra-centrifugación. B: Micrografía electrónica de la muestra de virus purificado
Obtención de anticuerpos anti-SBV
Al analizar por Western Blot una muestra de suero del conejo inoculado (a los 45 días posteriores a la primer inoculación), se observó la presencia de varias bandas especificas para el virus SBV, de aproximadamente 25, 34, 37 y 44 KDa que pueden corresponder a las proteínas estructurales de virus y una banda de gran intensidad con un peso estimado de 80 KDa, posiblemente debido a la presencia de la pre-proteína VP0. Mientras que al realizar este mismo ensayo utlilizando un suero normal de conejo (control negativo) no se observo la presencia de ninguna de estas bandas (Figura 2).
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D i v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp3430article71
Figura 2. Western blot. 1: Suero del conejo inoculado; 2: Marcador de peso molecular PegeRuler (Fermentas); 3: Suero normal de conejo (control negativo).
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D y v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp3632article71
Desarrollo del test inmunodifusión
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D 1 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp3733article71Para conseguir las condiciones óptimas de precipitación, en primer lugar se probaron distintas cantidades de salinidad y pH del agar. De todas las condiciones analizadas, la mejor definición de las líneas de precipitación fue conseguida con un gel a pH de 8.6, conteniendo un 1% de agar noble, 9% de acido bórico y 2% de hidróxido de sodio (Figura 3).
^cYv18n2a09.htm P N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp3834article71
Figura 3. Inmunodifusion en gel de agar: Ag: Antigeno (Virus purificado); S+: Suero Control Positivo (obtenido a partir de la inoculacion del conejo); S-: Suero Control Negativo (proveniente de un conejo normal, sin inocular).
Una vez que se hallaron las condiciones óptimas para la precipitación, se estandarizaron las concentraciones de antígeno (virus purificado) y anticuerpos (suero de conejo) Con el fin de obtener una línea de precipitación nítida y equidistante entre el pocillo central y los pocillos periféricos. Una vez puesta a punto la técnica, se analizaron 40 muestras de campo obtenidas a partir del sobrenadante del macerado de 15 abejas en 2 ml de PBS provenientes de distintos colmenares de la provincia de Buenos Aires. Para el análisis de las muestras tomadas a campo, el suero específico anti-SBV fue colocado en el pocillo central y el antígeno control (virus purificado) fue sembrado en tres pocillos exteriores alternados. Las muestras a probar en los fueron sembradas en los tres pocillos restantes. Luego de las 48hs de incubación se procedió a la lectura de los resultados considerando positivas aquellas muestras formaban una línea continua (línea de identidad) con las líneas correspondientes a los pocillos de antígeno control flanqueantes (por ejemplo Figura 4 muestras 1 y 2). Las muestras en que solo aparecieron las líneas de los controles del antígeno, fueron consideradas negativas (Figura 4, muestra 3).
^cYv18n2a09.htm > N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp4036article71
Figura 4. Resultados obserbados de la Inmunodifusion. Ag: Antigeno (Virus purificado); S+: Suero Control Positivo (obtenido a partir de la inoculacion del conejo). Muesta 1 y 2 positivas. Muestra 3 negativa.
Por medio de esta técnica, 4 de las muestras analizadas (10% del total de muestras) resultaron positivas para SBV. Para confirmar los resultados obtenidos con la prueba de inmunodifusión, las 40 muestras de campo fueron analizadas por medio de una RT-PCR (utilizando el mismo protocolo ya descripto en la sección de Materiales y Métodos), obteniéndose una total concordancia en el resultado de ambas técnicas.
^cYv18n2a09.htm N 0 5 6 7 9 ; B D \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp4238article71Conclusiones
^cYv18n2a09.htm! ! N N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSp4339article71En el presente trabajo se logro poner a punto una técnica serológica de inmunodifusión doble que permite la detección del virus SBV a partir de muestras de abejas. También se compararon diferentes técnicas (RT-PCR y Western Wlot) con el objetivo de incrementar las herramientas diagnósticas de modo de aumentar la detección temprana de casos positivos de SBV y poder definir el diagnóstico de esta enfermedad aún en colmenas asintomáticas De todas las técnicas ensayadas, Western Blot es sin duda la más laboriosa de las tres debido que requiere varias horas de desarrollo (48 - 72hs). Mientras que por su parte, si bien la RT-PCR es una técnica mucho más rápida, su costo es muy elevado en comparación con las otras técnicas ensayadas.
En cuanto a la técnica de Inmunodifusión en Gel de Agar (IDGA), si bien son necesarias 48 horas para emitir el diagnóstico, la misma posee una alta especificidad. Es una técnica muy sencilla y de bajo costo, lo que la convierte en una técnica apropiada para su implementación en el diagnóstico de esta enfermedad.
La IDGA ya ha sido adoptada como Gold Standard para el diagnóstico de muchas enfermedades de interés veterinario, como por ejemplo la Anemia Infecciosa Equina, la Leucosis Bovina y la Brucelosis. Para el diagnostico de estas enfermedades, la IDGA ha sido considerada como una técnica moderadamente sensible pero altamente especifica (con una especificidad en algunos casos cercana al 100%). En un trabajo previo (con características similares al aquí desarrollado) realizado por Ribiere et. al (2000)11 con el virus de la Parálisis Crónica de la Abeja se ha demostrado que el Western Blot es un método eficaz en el diagnóstico de esta infección. Simultáneamente con el Western Blot también desarrollaron una técnica de IDGA. Los autores concluyeron que si bien es menos sensible que el Western Blot, la IDGA es más sencilla, rápida y no requerir grandes cantidades de reactivos. La comparación de los resultados de ambas técnicas mostró una buena concordancia.
Por todo lo expuesto se podría proponerse a la IDGA como una técnica económica destinada al screening de un gran número de muestras y utilizar otras técnicas más laboriosas con la RT-PCR para la confirmación de las muestras sospechosas. .
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Elsevier Acad Press Inc.San Diego20070000200733-8020161200v18n2a09.htm F F 0 5 6 7 9 : A v C D Z j *{ C A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc805article165^rND^sCox-Foster^nD.L.^rND^nS.^sConlan^rND^nE.C^sHolmeset alA metagenomic survey of microbes in honey bee collapse disorder^lenSci2200700002007318283-8720161200v18n2a09.htmG G 0 5 6 7 9 : A v C D U f v T A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc816article166^rND^sFreiberg^nM^rND^nD^sDe Jong,^rND^nD^sMessage^rND^nD.^sCox-FosterFirst report of sacbrood virus in honey bee (Apis mellifera) colonies in Brazil.^lenGen Mol Res22012000020121133310-14 pp20161200v18n2a09.htm H H h 0 5 6 7 9 : A v C D V e F A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc827article167^rND^sGenersch,^nE^rND^nM^sAubertEmerging and re-emerging viruses of the honey bee (Apis mellifera)^lenVet Res22010000020104165420161200v18n2a09.htmI I @ 0 5 6 7 9 : A v C D X 7 A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc838article168^rND^sOuchterlony^nODiffusion-in-gel methods for immunological analysis^lenAllergy219580000195851-7820161200v18n2a09.htmJ J f 0 5 6 7 9 : A v C D Z k 0 A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc849article169^rND^sMc Menamin^nA.J.^rND^sGenersch^nEHoney bee colony losses and associated virus^lenCurr. Opin. Insect. Sci.22015000020158121-12920161200v18n2a09.htmK K 0 5 6 7 9 ; B v D F U g *| s A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8510article1610^rND^sRader^nR.^rND^sHowlett^nB.G^rND^sCunningham^nS.Aet alAlternative pollinator taxa are equally efficient but not as effective as the honeybee in a mass flowering crop^lenJ Appl Ecol2200900002009461080-8720161200v18n2a09.htm L L 0 5 6 7 9 ; B v D F V h w p A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8611article1611^rND^sRibiere^nM^rND^sFaucon^nJ.P.^rND^sPpin^nM.Detection of chronic honey bee (Apis mellifera L.) paralysis virus infection: application to a field survey.^lenApidologie220000000200031567-7720161200v18n2a09.htmM M 0 5 6 7 9 ; B v D F W l *~ > A @ ! a" * v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8712article1612^rND^sRunckel^nC.^rND^sFlenniken^nM.L.^rND^sEngel,^nJ.C.et alTemporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, nosema and aethidia^lenPLoS ONE201100002011620161200v18n2a09.htmN N 0 5 6 7 9 ; B v D F Y m ~ A @ ; a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8813article1613^rND^sSguazza^nG.H.^rND^sReynaldi^nF.J.^rND^sGalosi^nC.M^rND^sPecoraro^nM.R.201300002013Simultaneous detection of bee viruses by multiplex PCR.^lenJournal of Virological Methods,2194102-10620161200v18n2a09.htm O O n 0 5 6 7 9 ; B v D F U c s A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8914article1614^rND^sSpivak^nM^rND^sMader^nE^rND^sVaughan^nM^rND^sEuliss^nJr. N.HThe Plight of the bees^lenEnv Sci & Tech22011000020114534-820161200v18n2a09.htm P P 0 5 6 7 9 ; B v D F U h w } A @ C a & v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc9015article1615^rND^sTowbin^nH^rND^sStaehelin^nT.^rND^sGordon^nJElectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:: procedure and some applications.^lenProc Nat Acad Sci2197900001979USA764350-5420161200v18n2a09.htmQ Q 0 5 6 7 9 ; B v D F Z m K A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc9116article1616^rND^sVaitukaitis^nJ^rND^sRobbins^nJ.B.^rND^sNieschlag^nE^rND^sRoss^nG.TA method for producing specific antisuera with small doses of immunogen^lenJ Clin Endocrinol Metab219710000197133988-9120161200v18n2a09.htm Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSo11article120180306105733v18n2a09.htm91 R R T 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSo11article120180306105734v18n2a10.htm S S H \7 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M & Q y T 1 V ^ ` e g A h p # z 4 G \ r F j F k p ` o h r r q z S U 0 U 7 U R U h U y U o S FU ` U g U U U U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSh21article1oaesFVET14.0ILUSTAB10invet060ndInVet18220161200^f371^l3781668-3498Farmacocintica plasmtica, concentraciones tisulares y urinarias de cefuroxima en gatos luego de su administracin parenteral*^les^rND^1A01^sLorenzini^nPM^rND^1A01^sPassini^nSM^rND^1A01^sLupi^nMP^rND^1A01^sMontoya^nL^rND^1A02^sLandoni^nMF^rND^1A01^sAlbarellos^nGAUniversidad de Buenos Aires^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Farmacologa^cBuenos AiresUniversidad Nacional de La Plata^iA02^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Farmacologa^cLa Plata2016093030/09/20162017090505/09/2017^les^aCefuroxima es una cefalosporina de segunda generacin que incluye en su espectro antibitico a cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos y anaerobios. El objetivo de este trabajo es caracterizar la farmacocintica plasmtica de cefuroxima en gatos luego de su administracin por va intravenosa, intramuscular y subcutnea, y determinar la concentracin de cefuroxima en algunos tejidos y en la orina de los animales. Luego de la administracin del antibitico (20 mg/kg), se tomaron muestras sanguneas y de orina durante 8 horas y muestras de tejidos entre las 1-1,5 horas. Los principales parmetros farmacocinticos (mediadesvo estndar) para la administracin intravenosa fueron: concentracin inicial (g/mL): 135,4681,42; vida media de eliminacin (h): 0,210,15. Para las administraciones intramuscular y subcutnea los principales parmetros farmacocinticos fueron respectivamente: concentracin mxima (g/mL): 48,656,71 y 28,178,44, tiempo de la concentracin mxima (h): 0,180,06 y 0,820,30, y vida media de eliminacin (h): 1,040,10 y 1,590,18. Las concentraciones (g/g) en tejidos estuvieron entre 3, 350,65 y 23.028.77. Al cabo de 8 horas se recuper en la orina el 78,0924,59% de la dosis administrada. Estos resultados indicaran que cefuroxima administrada a una dosis de 20 mg/kg por las vas estudiadas sera de utilidad para el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos susceptibles en gatos.^dnd^i1^tm^les^kFarmacocintica^i1^tm^les^kCefuroxima^i1^tm^les^kGatos^i1^tm^les^kAntibiticos^i1^tm^les^kCefalosporinas^i1Cefuroxime plasma pharmacokinetics, tissue and urine concentrations after parenteral administration to cats^len^len^aCefuroxime is a second generation cephalosporin active against gram-positive cocci, gramnegative rods and anaerobes. The aim of the present study is to characterize cefuroxime plasma pharmacokinetics after intravenous, intramuscular and subcutaneous administration to cats; and, to determine cefuroxime concentrations in some tissues and in urine of the animals. After antibiotic administration (20 mg/kg), blood and urine samples were taken during 8 hours and, tissue samples at 1-1.5 hours. After intravenous administration, main pharmacokinetic parameters (meanSD) were: initial plasma concentration (g/mL): 135.4681.42; half-life (h): 0.210.15. After intramuscular and subcutaneous administration, main pharmacokinetic parameters were, respectively: maximum plasma concentrations (g/mL): 48.656.71 and 28.178.44; time of maximum plasma concentration were 0.180.06 h and 0.820.30 h; and, elimination half-life (h): 1.040.10 and 1.590.18. Tissue concentrations (g/g) ranged between 3,350,65 and 23.028.77. After 8 hours, 78,0924,59% of the administered cefuroxime was recovered from urine. The present results showed that cefuroxime, administered at a dosage of 20 mg/kg by intravenous, intramuscular or subcutaneous route, would be a useful tool for the infection treatment in cats when produced by susceptible microorganisms.^dnd^i2^tm^len^kPharmacokinetic^i2^tm^len^kCefuroxime^i2^tm^len^kCats^i2^tm^len^kAntibiotics^i2^tm^len^kCephalosporins^i2other17v18n2a10.htmT T ^ \7 0 5 6 7 8 9 @ G A ( C E * I x J & M & Q y T 1 V ^ ` e g A h p # z % ; N c y F j F k p g o o r y q S U 7 U > U Y U o U U } S / FU u U | U U U U u H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSf31article1oaesFVET14.0ILUSTAB10invet060ndInVet18220161200^f371^l3781668-3498Farmacocintica plasmtica, concentraciones tisulares y urinarias de cefuroxima en gatos luego de su administracin parenteral*^les^rND^1A01^sLorenzini^nPM^rND^1A01^sPassini^nSM^rND^1A01^sLupi^nMP^rND^1A01^sMontoya^nL^rND^1A02^sLandoni^nMF^rND^1A01^sAlbarellos^nGAUniversidad de Buenos Aires^iA01^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Farmacologa^cBuenos AiresUniversidad Nacional de La Plata^iA02^1Facultad de Ciencias Veterinarias^2Ctedra de Farmacologa^cLa Plata2016093030/09/20162017090505/09/2017^les^aCefuroxima es una cefalosporina de segunda generacin que incluye en su espectro antibitico a cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos y anaerobios. El objetivo de este trabajo es caracterizar la farmacocintica plasmtica de cefuroxima en gatos luego de su administracin por va intravenosa, intramuscular y subcutnea, y determinar la concentracin de cefuroxima en algunos tejidos y en la orina de los animales. Luego de la administracin del antibitico (20 mg/kg), se tomaron muestras sanguneas y de orina durante 8 horas y muestras de tejidos entre las 1-1,5 horas. Los principales parmetros farmacocinticos (mediadesvo estndar) para la administracin intravenosa fueron: concentracin inicial (g/mL): 135,4681,42; vida media de eliminacin (h): 0,210,15. Para las administraciones intramuscular y subcutnea los principales parmetros farmacocinticos fueron respectivamente: concentracin mxima (g/mL): 48,656,71 y 28,178,44, tiempo de la concentracin mxima (h): 0,180,06 y 0,820,30, y vida media de eliminacin (h): 1,040,10 y 1,590,18. Las concentraciones (g/g) en tejidos estuvieron entre 3, 350,65 y 23.028.77. Al cabo de 8 horas se recuper en la orina el 78,0924,59% de la dosis administrada. Estos resultados indicaran que cefuroxima administrada a una dosis de 20 mg/kg por las vas estudiadas sera de utilidad para el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos susceptibles en gatos.^dnd^i1^tm^les^kFarmacocintica^i1^tm^les^kCefuroxima^i1^tm^les^kGatos^i1^tm^les^kAntibiticos^i1^tm^les^kCefalosporinas^i1Cefuroxime plasma pharmacokinetics, tissue and urine concentrations after parenteral administration to cats^len^len^aCefuroxime is a second generation cephalosporin active against gram-positive cocci, gramnegative rods and anaerobes. The aim of the present study is to characterize cefuroxime plasma pharmacokinetics after intravenous, intramuscular and subcutaneous administration to cats; and, to determine cefuroxime concentrations in some tissues and in urine of the animals. After antibiotic administration (20 mg/kg), blood and urine samples were taken during 8 hours and, tissue samples at 1-1.5 hours. After intravenous administration, main pharmacokinetic parameters (meanSD) were: initial plasma concentration (g/mL): 135.4681.42; half-life (h): 0.210.15. After intramuscular and subcutaneous administration, main pharmacokinetic parameters were, respectively: maximum plasma concentrations (g/mL): 48.656.71 and 28.178.44; time of maximum plasma concentration were 0.180.06 h and 0.820.30 h; and, elimination half-life (h): 1.040.10 and 1.590.18. Tissue concentrations (g/g) ranged between 3,350,65 and 23.028.77. After 8 hours, 78,0924,59% of the administered cefuroxime was recovered from urine. The present results showed that cefuroxime, administered at a dosage of 20 mg/kg by intravenous, intramuscular or subcutaneous route, would be a useful tool for the infection treatment in cats when produced by susceptible microorganisms.^dnd^i2^tm^len^kPharmacokinetic^i2^tm^len^kCefuroxime^i2^tm^len^kCats^i2^tm^len^kAntibiotics^i2^tm^len^kCephalosporins^i2other17v18n2a10.htm U U h9 0 5 6 7 8 9 @ @ A G M ( O Q * U x V & Y & ] y ` 1 b j l q s A t | # * @ S h ~ F l F m p p o x r q S U J U Q U l U U U o S 4 MU U U U U U u H \ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSl41article1^mdic.^a2016oaesFVET14.0ilustab10invet060ndInVet18220161200^f371^l3781668-3498Farmacocintica plasmtica, concentraciones tisulares y urinarias de cefuroxima en gatos luego de su administracin parenteral*^les^rND^1A01^sLorenzini^nPM^rND^1A01^sPassini^nSM^rND^1A01^sLupi^nMP^rND^1A01^sMontoya^nL^rND^1A02^sLandoni^nMF^rND^1A01^sAlbarellos^nGA^iA01^1Universidad de Buenos Aires^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Ctedra de Farmacologa^cBuenos Aires^iA02^1Universidad Nacional de La Plata^2Facultad de Ciencias Veterinarias^3Ctedra de Farmacologa^cLa Plata2016093030/09/20162017090505/09/2017^les^aCefuroxima es una cefalosporina de segunda generacin que incluye en su espectro antibitico a cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos y anaerobios. El objetivo de este trabajo es caracterizar la farmacocintica plasmtica de cefuroxima en gatos luego de su administracin por va intravenosa, intramuscular y subcutnea, y determinar la concentracin de cefuroxima en algunos tejidos y en la orina de los animales. Luego de la administracin del antibitico (20 mg/kg), se tomaron muestras sanguneas y de orina durante 8 horas y muestras de tejidos entre las 1-1,5 horas. Los principales parmetros farmacocinticos (mediadesvo estndar) para la administracin intravenosa fueron: concentracin inicial (g/mL): 135,4681,42; vida media de eliminacin (h): 0,210,15. Para las administraciones intramuscular y subcutnea los principales parmetros farmacocinticos fueron respectivamente: concentracin mxima (g/mL): 48,656,71 y 28,178,44, tiempo de la concentracin mxima (h): 0,180,06 y 0,820,30, y vida media de eliminacin (h): 1,040,10 y 1,590,18. Las concentraciones (g/g) en tejidos estuvieron entre 3, 350,65 y 23.028.77. Al cabo de 8 horas se recuper en la orina el 78,0924,59 por ciento de la dosis administrada. Estos resultados indicaran que cefuroxima administrada a una dosis de 20 mg/kg por las vas estudiadas sera de utilidad para el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos susceptibles en gatos.^dnd^i1^tm^les^kFarmacocintica^i1^tm^les^kCefuroxima^i1^tm^les^kGatos^i1^tm^les^kAntibiticos^i1^tm^les^kCefalosporinas^i1Cefuroxime plasma pharmacokinetics, tissue and urine concentrations after parenteral administration to cats^len^len^aCefuroxime is a second generation cephalosporin active against gram-positive cocci, gramnegative rods and anaerobes. The aim of the present study is to characterize cefuroxime plasma pharmacokinetics after intravenous, intramuscular and subcutaneous administration to cats; and, to determine cefuroxime concentrations in some tissues and in urine of the animals. After antibiotic administration (20 mg/kg), blood and urine samples were taken during 8 hours and, tissue samples at 1-1.5 hours. After intravenous administration, main pharmacokinetic parameters (meanSD) were: initial plasma concentration (g/mL): 135.4681.42; half-life (h): 0.210.15. After intramuscular and subcutaneous administration, main pharmacokinetic parameters were, respectively: maximum plasma concentrations (g/mL): 48.656.71 and 28.178.44; time of maximum plasma concentration were 0.180.06 h and 0.820.30 h; and, elimination half-life (h): 1.040.10 and 1.590.18. Tissue concentrations (g/g) ranged between 3,350,65 and 23.028.77. After 8 hours, 78,0924,59 percent of the administered cefuroxime was recovered from urine. The present results showed that cefuroxime, administered at a dosage of 20 mg/kg by intravenous, intramuscular or subcutaneous route, would be a useful tool for the infection treatment in cats when produced by susceptible microorganisms.^dnd^i2^tm^len^kPharmacokinetic^i2^tm^len^kCefuroxime^i2^tm^len^kCats^i2^tm^len^kAntibiotics^i2^tm^len^kCephalosporins^i2other17v18n2a10.htmInternet^ihttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1668-34982016000200010 V V " N 0 5 6 7 8 9 @ B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp51article83
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
^cYv18n2a10.htm W W N 0 5 6 7 8 9 @ B & v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp62article83Farmacocinética plasmática, concentraciones tisulares y urinarias de cefuroxima en gatos luego de su administración parenteral*
^cYv18n2a10.htmX X N 0 5 6 7 8 9 @ B ' v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp73article83Lorenzini, PM1; Passini, SM1; Lupi, MP1; Montoya, L1; Landoni, MF2; Albarellos, GA1
^cYv18n2a10.htm Y Y N 0 5 6 7 8 9 @ B U v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp84article831Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Veterinarias, Cátedra de Farmacología.
2Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Veterinarias, Cátedra de Farmacología.
*Premio Estímulo a la Investigación Científica 2015 (Resolución CD Nº 3055/17). Categoría: Alumnos de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires.
Recibido: 30/09/2016
Aceptado: 05/09/2017
Correspondencia e-mail: Paula Lorenzini pmlorenzini@gmail.com
Resumen
^cYv18n2a10.htm\ \ t N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp117article83Cefuroxima es una cefalosporina de segunda generación que incluye en su espectro antibiótico a cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos y anaerobios. El objetivo de este trabajo es caracterizar la farmacocinética plasmática de cefuroxima en gatos luego de su administración por vía intravenosa, intramuscular y subcutánea, y determinar la concentración de cefuroxima en algunos tejidos y en la orina de los animales. Luego de la administración del antibiótico (20 mg/kg), se tomaron muestras sanguíneas y de orina durante 8 horas y muestras de tejidos entre las 1-1,5 horas. Los principales parámetros farmacocinéticos (media±desvío estándar) para la administración intravenosa fueron: concentración inicial (μg/mL): 135,46±81,42; vida media de eliminación (h): 0,21±0,15. Para las administraciones intramuscular y subcutánea los principales parámetros farmacocinéticos fueron respectivamente: concentración máxima (μg/mL): 48,65±6,71 y 28,17±8,44, tiempo de la concentración máxima (h): 0,18±0,06 y 0,82±0,30, y vida media de eliminación (h): 1,04±0,10 y 1,59±0,18. Las concentraciones (μg/g) en tejidos estuvieron entre 3, 35±0,65 y 23.02±8.77. Al cabo de 8 horas se recuperó en la orina el 78,09±24,59% de la dosis administrada. Estos resultados indicarían que cefuroxima administrada a una dosis de 20 mg/kg por las vías estudiadas sería de utilidad para el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos susceptibles en gatos.
^cYv18n2a10.htm ] ] L N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp128article83Palabras clave: Farmacocinética; Cefuroxima; Gatos; Antibióticos; Cefalosporinas.
^cYv18n2a10.htm^ ^ ` N 0 5 6 7 9 : A C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp139article83Cefuroxime plasma pharmacokinetics, tissue and urine concentrations after parenteral administration to cats
^cYv18n2a10.htm _ _ N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp1410article83Summary
^cYv18n2a10.htm ` ` < N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp1511article83Cefuroxime is a second generation cephalosporin active against gram-positive cocci, gramnegative rods and anaerobes. The aim of the present study is to characterize cefuroxime plasma pharmacokinetics after intravenous, intramuscular and subcutaneous administration to cats; and, to determine cefuroxime concentrations in some tissues and in urine of the animals. After antibiotic administration (20 mg/kg), blood and urine samples were taken during 8 hours and, tissue samples at 1-1.5 hours. After intravenous administration, main pharmacokinetic parameters (mean±SD) were: initial plasma concentration (μg/mL): 135.46±81.42; half-life (h): 0.21±0.15. After intramuscular and subcutaneous administration, main pharmacokinetic parameters were, respectively: maximum plasma concentrations (μg/mL): 48.65±6.71 and 28.17±8.44; time of maximum plasma concentration were 0.18±0.06 h and 0.82±0.30 h; and, elimination half-life (h): 1.04±0.10 and 1.59±0.18. Tissue concentrations (μg/g) ranged between 3,35±0,65 and 23.02±8.77. After 8 hours, 78,09±24,59% of the administered cefuroxime was recovered from urine. The present results showed that cefuroxime, administered at a dosage of 20 mg/kg by intravenous, intramuscular or subcutaneous route, would be a useful tool for the infection treatment in cats when produced by susceptible microorganisms.
^cYv18n2a10.htma a @ N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp1612article83Key words: Pharmacokinetic; Cefuroxime; Cats; Antibiotics; Cephalosporins.
Introducción
^cYv18n2a10.htmc c N 0 5 6 7 9 ; B D U v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp1814article83Cefuroxima (CFU) es una cefalosporina de segunda generación que incluye en su espectro a cocos gram-positivos (Staphylococcuss pp, Streptococcuss pp), bacilos gram-negativos (Enterobacteriaceae) y anaerobios11. Hasta la fecha no hay información publicada sobre la susceptibilidad de bacterias de origen animal a CFU. Para aislamientos bacterianos humanos la concentración inhibitoria mínima (CIM) es de 1 μg/ml (CIM90 para estafilococos) y 4 μg/ ml (CIM90 para E. coli)9, 16.
La eficacia antibiótica de las cefalosporinas se relaciona con el tiempo en que las concentraciones plasmáticas superan la CIM (T>CIM), y se considera que un T>CIM=40-60% del intervalo posológico es necesario para una adecuada eficacia terapéutica8, 10, 15.
La farmacocinética de CFU ha sido descripta en seres humanos4, en animales de laboratorio12 y en algunos animales domésticos: cabras1, terneros14 y perros2.
Luego de la administración parenteral, CFU se caracteriza por distribuirse ampliamente en los tejidos y por eliminarse rápidamente en forma activa por riñón (por filtración glomerular y secreción tubular) con una vida media (t½) ≈1 h1, 2, 4, 7, 12.
Las indicaciones terapéuticas de CFU en pacientes humanos son para el tratamiento de infecciones causadas por microorganismos susceptibles localizadas en vías respiratorias altas y bajas y en otros tejidos blandos, en las vías urinarias y en huesos y articulaciones. También se la indica para la profilaxis de infecciones en el sitio quirúrgico en cirugías limpiascontaminadas y contaminadas de la cavidad abdominal7. CFU también sería de utilidad para indicaciones similares en los animales domésticos lo que determina el interés de su estudio en estas especies. Hasta la fecha no se registran publicaciones sobre la farmacocinética de CFU en gatos, por este motivo, el objetivo del presente trabajo es caracterizar la farmacocinética plasmática de CFU en gatos luego de su administración por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) y subcutánea (SC), como así también determinar la concentración de CFU en algunos tejidos y las concentraciones de CFU en la orina de los animales.
Materiales y Métodos
^cYv18n2a10.htm e e J N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2016article83Para obtener las muestras de sangre, tejidos y orina, el estudio se diseñó con gatos que iban a ser esterilizados quirúrgicamente, para lo que se utilizó la sedación y anestesia de los animales para obtener las muestras plasmáticas, de orina y de los tejidos abordados durante el procedimiento quirúrgico.
^cYv18n2a10.htmf f N 0 5 6 7 9 ; B D r v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2117article83Animales de experimentación
^cYv18n2a10.htmg g N 0 5 6 7 9 ; B D B v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2218article83Se trabajó con gatos jóvenes (1,5±0,5 años) clínicamente sanos. Para la administración IV se utilizaron 7 animales (4 hembras y 3 machos), 8 para la IM (5 hembras y 3 machos) y 7 para la SC (6 hembras y 1 macho).
^cYv18n2a10.htmh h N 0 5 6 7 9 ; B D b v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2319article83Antibiótico
^cYv18n2a10.htmi i t N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2420article83Se empleó cefuroxima sódica (Cefuroxima Richet 1,5 g®, Richet, Argentina) diluida en agua destilada (100 mg/ml).
^cYv18n2a10.htmj j N 0 5 6 7 9 ; B D j v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2521article83Diseño experimental
^cYv18n2a10.htmk k N 0 5 6 7 9 ; B D 3 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2622article83Las muestras de plasma y tejidos se obtuvieron durante procedimientos quirúrgicos estándares (ovariectomías y orquidectomías) que se realizaron por las técnicas convencionales y bajo anestesia general5.
Luego de un ayuno de 12 horas se realizó la anestesia de los animales, utilizando midazolam 0,2 mg/kg, IM (Midazolam®, Richmond VetPharma, Buenos Aires, Argentina), ketamina 10 mg/kg, IM (Ketonal 100®, Richmond VetPharma, Buenos Aires, Argentina), xilazina 0,5 mg/kg IV (Rompun®, Bayer, Buenos Aires, Argentina) y butorfanol 0.2 mg/kg SC (Butormin®, Holliday, Buenos Aires, Argentina).
Para la toma de muestras sanguíneas y la administración de fluidos (solución fisiológica, 10 ml/kg/h) se colocaron catéteres intravenosos en la vena cefálica antebraquial derecha. Las muestras de tejidos (en hembras: piel, subcutáneo, músculo, ovarios y útero; y en machos: piel, testículos y epidídimos) se tomaron durante la cirugía a 60-90 minutos luego de la administración de CFU. A los gatos a los que se les administró CFU IV se les colocó una sonda uretral para la recolección de toda la orina producida durante las primeras 8 horas posteriores a la administración de CFU.
El diseño y los procedimientos empleados con los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires (protocolo n° 2013/25).
Administración del antibiótico
^cYv18n2a10.htm m m N 0 5 6 7 9 ; B D u v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2824article83Para las diferentes vías de administración se utilizó la misma dosis de CFU (20 mg/kg). La aplicación IV se realizó a través de la vena cefálica antebraquial izquierda, la IM se realizó en la musculatura lumbar y la SC sobre la parrilla costal.
^cYv18n2a10.htm n n N 0 5 6 7 9 ; B D i v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp2925article83Muestreo sanguíneo
^cYv18n2a10.htm o o 8 N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3026article83Con jeringas heparinizadas se tomaron muestras de sangre (0,7 ml), previo a la administración del antibiótico y a los 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360 y 480 minutos posteriores. Las muestras se centrifugaron (1500g, 15 minutos), se separó el plasma y se almacenó a -20°C hasta su procesamiento.
^cYv18n2a10.htm p p N 0 5 6 7 9 ; B D ` v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3127article83Muestreo tisular
^cYv18n2a10.htmq q | N 0 5 6 7 9 ; B D " v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3228article83Los tejidos muestreados se secaron con gasa estéril para minimizar el contenido de sangre. Se pesaron y almacenaron a -20ºC hasta su procesamiento. Este consistió en la homogenización de las muestras en solución de buffer fosfato pH 7 (1:2 p/v), posterior centrifugado y recuperación del sobrenadante que se empleó para determinar la concentración de CFU.
^cYv18n2a10.htmr r N 0 5 6 7 9 ; B D a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3329article83Muestreo de orina
^cYv18n2a10.htm s s N 0 5 6 7 9 ; B D 6 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3430article83Se recolectó la orina producida a intervalos de 1 hora durante 8 horas. Se midió el volumen y se guardó una muestra a -20°C hasta su procesamiento.
^cYv18n2a10.htmt t P N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3531article83Determinación de la concentración de CFU en las distintas matrices biológicas
^cYv18n2a10.htmu u N 0 5 6 7 9 ; B D b v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3632article83Dado que CFU no se metaboliza, el método microbiológico3 resulta apropiado para determinar sus concentraciones en todas las matrices biológicas. Se utilizó Kokuria rhizophila ATCC 9341 como cepa test. Se construyeron curvas estándar de CFU en plasma normal de gato, buffer fosfato pH 7 y en orina normal de gato para el cálculo de las concentraciones incógnitas de CFU en las muestras de plasma, tejidos y orina, respectivamente. Las curvas fueron lineales entre 0,39 y 50 μg/ml (r=0.9985), con coeficientes de variación intra e inter-día <8%. El límite de cuantificación del método fue de 0,78 μg/ml.
Para estimar el grado de penetración tisular de CFU, se calculó la relación entre la concentración en tejido y la correspondiente concentración plasmática al momento de la obtención de la muestra tisular (concentración tejido/concentración plasma).
Análisis farmacocinético
^cYv18n2a10.htmw w N 0 5 6 7 9 ; B D p v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3834article83Con las concentraciones plasmáticas de CFU se construyeron las curvas de concentración plasmática de CFU en función del tiempo para cada uno de los animales estudiados. Estas se analizaron por regresión no-lineal usando un programa computarizado (Phoenix WinNonlin 6.3, 2005-2012; Certara, USA). El número de exponentes necesarios para cada vía de administración se determinó aplicando los criterios de Schwartz13 y Akaike17 y la distribución de los residuales alrededor de las concentraciones estimadas. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante ecuaciones clásicas asociadas al análisis compartimental6.
^cYv18n2a10.htmx x N 0 5 6 7 9 ; B D r v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp3935article83Análisis estadístico
^cYv18n2a10.htmy y N 0 5 6 7 9 ; B D | v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4036article83Los parámetros farmacocinéticos se expresaron como media±DE. Mediante un test de ANOVA y un test de comparaciones múltiples de Tukey (GraphPadPrism, GraphPad Software, version 5.00, 2007, San Diego, CA, USA) se compararon estadísticamente los parámetros farmacocinéticos, las concentraciones en tejidos y las relaciones de concentración en tejidos/concentración plasmática para cada una de las vías de administración estudiadas. Se consideraron diferencias significativas si P<0,05.
^cYv18n2a10.htmz z ( N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4137article83Integración Farmacocinética / Farmacodinamia
^cYv18n2a10.htm{ { V N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4238article83Se estimó el T>CIM para las 3 vías de administración evaluadas. Debido a la falta de valores de CIM a CFU para aislamientos bacterianos animales, se utilizaron valores de CIM para aislamientos bacterianos humanos tomados de bibliografía (CIM90=1 μg/ml para estafilococos y CIM90=4 μg/ml para E. coli).
^cYv18n2a10.htm| | N 0 5 6 7 9 ; B D Z v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4339article83Resultados
^cYv18n2a10.htm} } N 0 5 6 7 9 ; B D T v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4440article83No se observaron efectos adversos en ningún animal ni durante ni después de la administración de CFU. Las curvas de concentración plasmática de CFU en función del tiempo se muestran en la Fig. 1. Para la administración IV el modelo farmacocinético que las describió mejor fue el bicompartimental abierto, mientras que para las vías IM y SC el modelo elegido fue el monocompartimental abierto. Los principales parámetros farmacocinéticos se muestran en la Tabla 1 y las concentraciones en tejidos y la relación entre las concentraciones en plasma/ tejido para cada vía de administración se muestran en la Tabla 2. Las concentraciones urinarias de CFU y los porcentajes acumulados de eliminación de CFU en orina luego de su administración IV se muestran en la Tabla 3.
^cYv18n2a10.htm~ ~ N 0 5 6 7 9 ; B D h v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4541article83
Figura 1. Concentración plasmática de CFU en función del tiempo luego de su administración IV, IM y SC (20 mg/kg) a gatos.
^cYv18n2a10.htm N 0 5 6 7 9 ; B D d v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4743article83
Tabla 1. Parámetros farmacocinéticos (media±DE) de CFU (20 mg/kg) administrada por vía IV (n=7), IM (n=8) y SC (n=7) a gatos.
C1, C2 concentración al tiempo 0 de la fase de distribución y de eliminación, respectivamente; Cp(0) concentración plasmática al tiempo 0; λ1 constante de distribución; λ2 constante de eliminación; ABC(0-inf ) área bajo la curva de concentración plasmática en función del tiempo de 0 a infinito; K12 constante de pasaje del compartimiento central al periférico; K21 constante de pasaje del compartimiento periférico al central; t½(d) vida media de distribución; Varea volumen de distribución de la fase de eliminación; V(d(ss)) volumen de distribución en el estado estacionario; Ka constante de absorción; t½(a) vida media de absorción; Tmax tiempo de la concentración plasmática máxima; Cmax concentración plasmática máxima; ClB clearance corporal total; t½ vida media de eliminación; MRT tiempo medio de residencia. * Diferencias significativas (P<0,05)
^cYv18n2a10.htm N 0 5 6 7 9 ; B D K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp4945article83Tabla 2. Concentraciones de CFU en tejidos luego de su administración por vía IV, IM y SC (20 mg/kg) a gatos
^cYv18n2a10.htm N 0 5 6 7 9 ; B D s v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp5147article83
Tabla 3. Concentración urinaria de CFU luego de su administración IV a gatos (20 mg/kg) y porcentaje acumulado de la dosis administrada en la orina.
Discusión
^cYv18n2a10.htm v N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp5349article83El perfil farmacocinético de CFU en los gatos fue el esperado para un antibiótico betalactámico y resultó similar al informado para otras especies animales (cabras, terneros y perros)1, 2, 14.
Si bien en este trabajo se tomaron muestras sanguíneas durante 8 horas luego de la administración del antibiótico, las concentraciones de CFU solo fueron cuantificables durante las 6 primeras horas para todas las vías estudiadas. Luego de la administración IV de CFU las concentraciones plasmáticas iniciales fueron muy elevadas (Cp0: 135,46±81,42 μg/ml) y declinaron rápidamente (T½(d): 0,21±0,15) señalando una distribución muy rápida aunque aparentemente restringida al líquido extracelular (V(d(ss)): 0,31±0,08 L). La eliminación de CFU también fue relativamente rápida (ClB: 0,20±0,06 L/h.kg, t½: 1,25±0,15 h y MRT: 1,59±0,19 h) y, el 78,09±24,59% del total de la dosis administrada por vía IV se recuperó en la orina de las primeras 8 horas (Tabla 3). Por este motivo las concentraciones de CFU en orina fueron muy elevadas en todos los tiempos muestreados (Tabla 3) siendo siempre muy superiores a los valores de CIM de los posibles patógenos. Estos valores urinarios son similares a los informados para pacientes humanos4.
Luego de la administración IM, las concentraciones plasmáticas fueron significativamente mayores que luego de la administración SC (Cmax: 48,65±6,71 ug/ml y 28,17±8,44 ug/ml, respectivamente) y se alcanzaron antes (Tmax: 0,18±0,06 h y 0,82±0,30 h, respectivamente). Estas diferencias están en relación con una absorción retardada y más lenta luego de la administración SC que podría deberse a la menor irrigación propia de este tejido. Hallazgos similares han sido informados en perros2. La t½ fue significativamente mayor luego de la administración SC que luego de la IV o IM (Tabla 1). Estas diferencias se evidencian en la Fig. 1 donde las concentraciones de CFU SC permanecen ≈1,5 hora más por encima de una CIM=4 μg/ml que cuando administrada por vía IV o IM. Esto se traduce en una ventaja terapéutica práctica para la administración SC de CFU en gatos ya que permitiría un mayor intervalo posológico.
Las concentraciones de CFU en los tejidos para todas las vías estudiadas (Tabla 2) siempre fueron mayores que valores de CIM=4μg/ml. No se hallaron diferencias significativas entre las distintas vías para las concentraciones de CFU en cada tejido, ni entre las relaciones concentración plasma/tejido. Sin embargo debe considerarse que los valores calculados de concentración de CFU en los tejidos mostraron una gran variación individual y que en el caso de la vía SC los tejidos de gatos machos estuvieron poco representados (1 solo animal). La gran variación inter-individual observada pudo responder a factores relativos al método de procesamiento de las muestras (homogeneizado tisular), a los tiempos de extracción de las mismas (rango entre 60-90 minutos post-administración del antibiótico) o bien a variabilidad individual entre los animales empleados.
Las relaciones de concentraciones plasma/ tejido (Tabla 2) siempre se encontraron por debajo de la unidad, lo que ratifica una distribución predominantemente extracelular. Los valores de estos índices para cada tejido mostraron una gran constancia al comparar las distintas vías de administración. Esto estaría relacionado con las particularidades de perfusión sanguínea propias de cada tejido (mayor para tejidos tales como útero, ovarios y piel y, menor para testículo y subcutáneo).
Al estimar el T>CIM (Fig. 1) se observa que para valores de CIM=1μg/ml, todas las vías de administración estudiadas mantienen concentraciones de CFU muy superiores a este valor por más de 6 horas. En cambio, para CIM=4μg/ml, la vía IV e IM permanecen por ≈4,5 h y la SC por ≈5,5 h. Para estos valores los intervalos posológicos de CFU en gatos serían cada ≈9 h para las vías IV e IM y de ≈11 horas para la administración SC.
Conclusiones
^cYv18n2a10.htm N 0 5 6 7 9 ; B D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp5551article83Dado que no hay información bibliográfica sobre la farmacocinética de CFU en gatos consideramos que los resultados obtenidos en el presente estudio son un aporte valioso para orientar el uso racional de este antibiótico en esta especie animal. CFU en una dosis de 20 mg/kg cada 9-11 horas (según la vía de administración) sería de utilidad para el tratamiento de infecciones en gatos producidas por microorganismos susceptibles. Este esquema posológico aseguraría el éxito terapéutico minimizando la posibilidad de aparición de cepas bacterianas resistentes. CFU a 20 mg/ kg también sería una opción adecuada para la profilaxis de infecciones en el sitio quirúrgico en cirugías de cavidad abdominal.
^cYv18n2a10.htm N 0 5 6 7 9 ; B D ~ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp5652article83 ^cYv18n2a10.htm T 0 5 6 7 9 ; B xD E 9 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp5753article8311. Abo El-Sooud, K.; El-Banna, H.A.; Hanafy, M.S.M.; Goudah, A. Pharmacokinetics and intramuscular bioavailability of cefuroxime sodium in goats. Res Vet Sci. 2000; 69: 219-24. ^cYv18n2a10.htm N 0 5 6 7 9 ; B D W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSp5854article83
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ASM Press,WashingtonUSA20060000200620161200v18n2a10.htm 0 5 6 7 9 : A v C D R b *u { A @ a# + v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc969article179^rND^sLerma^nM^rND^sCebrin^nL^rND^sGimnez^nM.J.et al.-lactam susceptibility of Escherichia coli isolates from urinary tract infections exhibiting different resistance phenotypes^lenRev Esp Quimioter.220080000200821149-5220161200v18n2a10.htm 0 5 6 7 9 ; B v D F Z s d A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc9710article1710^rND^sMcKellar^nQ.A.^rND^sSanchez Bruni^nS.F.^rND^sJones^nD.G.Pharmacokinetic/pharmacodynamic relationships of antimicrobial drugs used in veterinary medicine^lenJ vet Pharmacol Ther.220040000200427503-1420161200v18n2a10.htm 0 5 6 7 9 ; B v D F Y + 3 ? > B C A @ a$ , v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc9811article1711^rND^sPrescott^nJ.FBeta-lactam antibiotics: cephalosporins^len: Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine,^len4thedn^rND^sGigure^nS^rND^sPrescott^nJ.F.^rND^sDowling^nP.M.Wiley Blackwell, Ames^eIowaUSA201300002013153-7320161200v18n2a10.htm 0 5 6 7 9 ; B v D F ] l A @ V A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc9912article1712^rND^sRuiz-Carretero^nP^rND^sNacher^nA^rND^sMerino-Sanjuan^nM^rND^sCasabo^nV.G.200000002000Pharmacokinetics and absolute bioavailability of oral cefuroxime axetil in the rat^lenInt J Pharm220000000200020289-9620161200v18n2a10.htm 2 0 5 6 7 : < C v E G X ' A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10013article1713^rND^sSchwartz^nGEstimating the dimension of a model^lenAnn Stat21978000019786461-420161200v18n2a10.htm z 0 5 6 7 : < C v E G W c t > A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10114article1714^rND^sSoback^nS.^rND^sZiv^nG^rND^sKokue^nE.I.Probenecid effect on cefuroxime pharmacokinetics in calves^lenJ vet Pharm Ther21989000019891287-9320161200v18n2a10.htm > 0 5 6 7 : < C v E G [ % A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10215article1715^rND^sTurnidge^nJ.D.The pharmacodynamics of -lactams^lenJ Clin Infect Dis.21998000019982710-2220161200v18n2a10.htm 0 5 6 7 : < C v E G Y n } ' A ( @ 0 4 6 a< D v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10316article1716^rND^svon Eiff,^nC^rND^sFriedrich^nA.W.^rND^sBecker^nK.;^rND^sPeters^nGComparative in vitro activity of ceftobiprole against staphylococci displaying normal and small-colony variant phenotypes^lenAntimicrob Agents Chemother.2200500002005494372-420161200v18n2a10.htm 0 5 6 7 : < C v E G W h t m A @ a v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10417article1717^rND^sYamaoka^nK^rND^sNakagawa^nT^rND^sUno^nTApplication of Akaikes information criterion (AIC) in the evaluation of linear pharmacokinetic equations^lenJ Pharmacok Biopharm21978000019786165-7520161200v18n2a10.htm R Z 0 5 6 7 8 9 @ [ A \ I O [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSo11article120180306105734v18n2a10.htm104D e | 0 5 6 7 9 : A v C D U e t Q A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc671article141^rND^sBicalho^nRC^rND^sGalvao^nKN^rND^sGuard^nCL^rND^sSantos^nJEPOptimizing the accuracy of detecting a functional corpus luteum in dairy cows^lenTheriogenology220080000200870199-20720161200v18n2a01.htm0093-691X D 0 5 6 7 9 : A v C D U e t Q A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc671article141^rND^sBicalho^nRC^rND^sGalvao^nKN^rND^sGuard^nCL^rND^sSantos^nJEPOptimizing the accuracy of detecting a functional corpus luteum in dairy cows^lenTheriogenology20080000200870199-20720161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY E f 2 0 5 6 7 9 : A v C D W j x 0 > A ? @ G K M aT \ # h v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc682article142^rND^sCarvalho^nJBP^rND^sCarvalho^nNAT^rND^sReis^nEL^rND^sNichi^nM^rND^sSouza^nAH^rND^sBaruselli^nPSEffect of early luteolysis in progesterone-based timed AI protocols in Bos indicus, Bos indicus x Bos taurus, and Bos taurus heifers^lenTheriogenology220080000200869167-17520161200v18n2a01.htm0093-691X E & 0 5 6 7 9 : A v C D W j x 0 A > @ F J L aS [ # g !p v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc682article142^rND^sCarvalho^nJBP^rND^sCarvalho^nNAT^rND^sReis^nEL^rND^sNichi^nM^rND^sSouza^nAH^rND^sBaruselli^nPSEffect of early luteolysis in progesterone-based timed AI protocols in Bos indicus, Bos indicus x Bos taurus, and Bos taurus heifers^lenTheriogenology20080000200869167-17520161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY F g N 0 5 6 7 9 : A v C D T f y + A , @ 4 8 : aA I # U v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc693article143^rND^sColazo^nMG^rND^sKastelic^nJP^rND^sMapletoft^nRJEffects of estradiol cypionate (ECP) on ovarian follicular dynamics, synchrony of ovulation, and fertility in CIDR-based, fixed-time AI programs in beef heifers^lenTheriogenology220030000200360855-86520161200v18n2a01.htm0093-691XF 0 5 6 7 9 : A v C D T f y A + @ 3 7 9 a@ H # T !] v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc693article143^rND^sColazo^nMG^rND^sKastelic^nJP^rND^sMapletoft^nRJEffects of estradiol cypionate (ECP) on ovarian follicular dynamics, synchrony of ovulation, and fertility in CIDR-based, fixed-time AI programs in beef heifers^lenTheriogenology20030000200360855-86520161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGY NOLOGYJ k 0 5 6 7 9 : A v C D W i z - A . @ 6 : < aC K # W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc737article147^rND^sMeneghetti^nM^rND^sS Filho^nOG^rND^sPeres^nRFG.^rND^sLamb^nGC^rND^sVasconcelos^nJLMFixed-time artificial insemination with estradiol and progesterone for Bos indicus cows I: Basis for development of protocols^lenTheriogenology220090000200972179-18920161200v18n2a01.htm0093-691XJ 0 5 6 7 9 : A v C D W i z A - @ 5 9 ; aB J # V !_ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc737article147^rND^sMeneghetti^nM^rND^sS Filho^nOG^rND^sPeres^nRFG.^rND^sLamb^nGC^rND^sVasconcelos^nJLMFixed-time artificial insemination with estradiol and progesterone for Bos indicus cows I: Basis for development of protocols^lenTheriogenology20090000200972179-18920161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGY NOLOGYK l 0 5 6 7 9 : A v C D U e v p ( A ) @ 1 5 7 a@ H # T v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc748article148^rND^sRoelofs^nJB^rND^sGraat^nEAM^rND^sMullaart^nE^rND^sSoede^nNM^rND^sVoskamp-Harkema^nV^rND^sKemp^nBEffects of insemination-ovulation interval on fertilization rates and embryo characteristics in dairy cattle^lenTheriogenology2200600002006662173-218120161200v18n2a01.htm0093-691X K 0 5 6 7 9 : A v C D U e v p A ( @ 0 4 6 a? G # S !\ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc748article148^rND^sRoelofs^nJB^rND^sGraat^nEAM^rND^sMullaart^nE^rND^sSoede^nNM^rND^sVoskamp-Harkema^nV^rND^sKemp^nBEffects of insemination-ovulation interval on fertilization rates and embryo characteristics in dairy cattle^lenTheriogenology200600002006662173-218120161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY M m 0 5 6 7 9 ; B v D F X f *x ~ 8 F A G @ O S U a\ d # p v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7610article1410^rND^sS Filho^nMF^rND^sAyres^nH^rND^sFerreira^nRMet al.Equine chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone enhance fertility in a norgestomet-based, timed artificial insemination protocol in suckled Nelore (Bos indicus) cows^lenTheriogenology220100000201073651-65820161200v18n2a01.htm0093-691X M " 0 5 6 7 9 ; B v D F X f *x ~ 8 A F @ N R T a[ c # o !x v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7610article1410^rND^sS Filho^nMF^rND^sAyres^nH^rND^sFerreira^nRMet al.Equine chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone enhance fertility in a norgestomet-based, timed artificial insemination protocol in suckled Nelore (Bos indicus) cows^lenTheriogenology20100000201073651-65820161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY N o 0 5 6 7 9 ; B v D F X j } : H A I @ Q U W a^ f # r v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7711article1411^rND^sS Filho^nMF^rND^sSantos,^nJEP^rND^sFerreira^nRM.^rND^sSales^nJNS^rND^sBaruselli^nPSImportance of estrus on pregnancy per insemination in suckled Bos indicus cows submitted to estradiol/progesterone-based timed insemination protocols.^lenTheriogenology220110000201176455-46320161200v18n2a01.htm0093-691X N * 0 5 6 7 9 ; B v D F X j } : A H @ P T V a] e # q !z v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7711article1411^rND^sS Filho^nMF^rND^sSantos,^nJEP^rND^sFerreira^nRM.^rND^sSales^nJNS^rND^sBaruselli^nPSImportance of estrus on pregnancy per insemination in suckled Bos indicus cows submitted to estradiol/progesterone-based timed insemination protocols.^lenTheriogenology20110000201176455-46320161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY O p $ 0 5 6 7 9 ; B v D F V i *{ 4 B A C @ K O Q aX ` # l v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7812article1412^rND^sSales^nJNS^rND^sCarvalho^nJBP^rND^sCrepaldi^nGAet al.Effects of two estradiol esters (benzoate and cypionate) on the induction of synchronized ovulations in Bos indicus cows submitted to a timed artificial insemination protocol.^lenTheriogenology220120000201278510-51620161200v18n2a01.htm0093-691X O 0 5 6 7 9 ; B v D F V i *{ 4 A B @ J N P aW _ # k !t v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7812article1412^rND^sSales^nJNS^rND^sCarvalho^nJBP^rND^sCrepaldi^nGAet al.Effects of two estradiol esters (benzoate and cypionate) on the induction of synchronized ovulations in Bos indicus cows submitted to a timed artificial insemination protocol.^lenTheriogenology20120000201278510-51620161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY P q 8 0 5 6 7 9 ; B v D F U i *x ~ A @ $ & a+ 3 # ? v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7913article1413^rND^sSouza^nAH^rND^sViechnieski^nS^rND^sLima^nFA.et al.Effects of equine chorionic gonadotropin and type of ovulatory stimulus in a timed-AI protocol on reproductive responses in dairy cows.^lenTheriogenology22009000020097210-2120161200v18n2a01.htm0093-691XP 0 5 6 7 9 ; B v D F U i *x ~ A @ # % a* 2 # > !G v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a01.htmSc7913article1413^rND^sSouza^nAH^rND^sViechnieski^nS^rND^sLima^nFA.et al.Effects of equine chorionic gonadotropin and type of ovulatory stimulus in a timed-AI protocol on reproductive responses in dairy cows.^lenTheriogenology2009000020097210-2120161200v18n2a01.htm0093-691XTHERIOGENOLOGY NOLOGY 0 5 6 7 : ; B v D E S f r ! A " @ * . 0 a6 > # J v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc1442article432^rND^sGarbi^nM^rND^sRubinstein^nS^rND^sLax^nY^rND^sBreitbart^nHActivation of protein kinase C in the lysophosphatidic acid-induced bovine sperm acrosome reaction and phospholipase D1 regulation^lenBiology of reproduction2200000002000631271-720161200v18n2a02.htm0006-3363 0 5 6 7 : ; B v D E S f r A ! @ ) - / a5 = # I !R v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc1442article432^rND^sGarbi^nM^rND^sRubinstein^nS^rND^sLax^nY^rND^sBreitbart^nHActivation of protein kinase C in the lysophosphatidic acid-induced bovine sperm acrosome reaction and phospholipase D1 regulation^lenBiology of reproduction200000002000631271-720161200v18n2a02.htm0006-3363Biology of Reproduction uction 0 5 6 7 : ; B v D E W Q C A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc1464article434^rND^sVisconti^nPEUnderstanding the molecular basis of sperm capacitation through kinase design^lenProc Natl Acad Sci2USA200900002009106667-820161200v18n2a02.htm0027-8424 0 5 6 7 : ; B v D E W Q C A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc1464article434^rND^sVisconti^nPEUnderstanding the molecular basis of sperm capacitation through kinase design^lenProc Natl Acad SciUSA200900002009106667-820161200v18n2a02.htm0027-8424Proc Natl Acad Scicad Sci ! 0 5 6 7 : ; B v D E U d t A @ a # ' v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc1508article438^rND^sCrdoba^nM^rND^sPintos^nL^rND^sBeconi^nMTVariations in creatine kinase activity and reactive oxygen species levels are involved in capacitation of bovine spermatozoa^lenAndrologia220080000200840370-7620161200v18n2a02.htm0303-4569 0 5 6 7 : ; B v D E U d t A @ a # & !/ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc1508article438^rND^sCrdoba^nM^rND^sPintos^nL^rND^sBeconi^nMTVariations in creatine kinase activity and reactive oxygen species levels are involved in capacitation of bovine spermatozoa^lenAndrologia20080000200840370-7620161200v18n2a02.htm0303-4569Andrologia ologia # 0 5 6 7 : < C v E G V p A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15210article4310^rND^sPawson^nTSpecificity in signal transduction: from phosphotyrosine-SH2 domain interactions to complex cellular systems^lenCell2200400002004116191-20320161200v18n2a02.htm0092-8674 0 5 6 7 : < C v E G V p A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15210article4310^rND^sPawson^nTSpecificity in signal transduction: from phosphotyrosine-SH2 domain interactions to complex cellular systems^lenCell200400002004116191-20320161200v18n2a02.htm0092-8674Cell 74Cell $ p 0 5 6 7 : < C v E G X k z ^ A @ a # + v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15412article4312^rND^sEtkovitz^nN^rND^sRubinstein^nS^rND^sDaniel^nL^rND^sBreitbart^nH.Role of PI3-kinase and PI4-kinase in actin polymerization during bovine sperm capacitation^lenBiology of Reproduction220070000200777263-7320161200v18n2a02.htm0006-3363 0 5 6 7 : < C v E G X k z ^ A @ a # * !3 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15412article4312^rND^sEtkovitz^nN^rND^sRubinstein^nS^rND^sDaniel^nL^rND^sBreitbart^nH.Role of PI3-kinase and PI4-kinase in actin polymerization during bovine sperm capacitation^lenBiology of Reproduction20070000200777263-7320161200v18n2a02.htm0006-3363Biology of Reproductionduction % D 0 5 6 7 : < C v E G [ k x q A @ a% - # 9 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15513article4313^rND^sJungnickel^nMK^rND^sSutton^nKA^rND^sWang^nY^rND^sFlorman^nHMPhosphoinositide - dependent pathways in mouse sperm are regulated by egg ZP3 and drive the acrosome reaction^lenDevelopmental Biology2200700002007304116-2620161200v18n2a02.htm0012-1606 0 5 6 7 : < C v E G [ k x q A @ a$ , # 8 !A v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15513article4313^rND^sJungnickel^nMK^rND^sSutton^nKA^rND^sWang^nY^rND^sFlorman^nHMPhosphoinositide - dependent pathways in mouse sperm are regulated by egg ZP3 and drive the acrosome reaction^lenDevelopmental Biology200700002007304116-2620161200v18n2a02.htm0012-1606Developmental BiologyBiology ' 0 5 6 7 : < C v E G \ k p A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15715article4315^rND^sde Lamirande^nE^rND^sGagnon^nCA positive role for the superoxide anion in triggering hyperactivation and capacitation of human spermatozoa^lenInt J Androl21993000019931621-2520161200v18n2a02.htm0105-6263 0 5 6 7 : < C v E G \ k p A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15715article4315^rND^sde Lamirande^nE^rND^sGagnon^nCA positive role for the superoxide anion in triggering hyperactivation and capacitation of human spermatozoa^lenInt J Androl1993000019931621-2520161200v18n2a02.htm0105-6263Int J Androl Androl ) 0 5 6 7 : < C v E G W d u s A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15917article4317^rND^sCrdoba^nM^rND^sMora^nN^rND^sBeconi^nMT.Respiratory burst and NAD(P)H oxidase activity are involved in capacitation of cryopreserved bovine spermatozoa^lenTheriogenology220060000200665882-9220161200v18n2a02.htm0093-691X 0 5 6 7 : < C v E G W d u s A @ a # !' v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc15917article4317^rND^sCrdoba^nM^rND^sMora^nN^rND^sBeconi^nMT.Respiratory burst and NAD(P)H oxidase activity are involved in capacitation of cryopreserved bovine spermatozoa^lenTheriogenology20060000200665882-9220161200v18n2a02.htm0093-691XTHERIOGENOLOGY NOLOGY * l 0 5 6 7 : < C v E G [ n ~ \ A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16018article4318^rND^sO'Flaherty^nCM^rND^sBeorlegui^nNB^rND^sBeconi^nMTReactive oxygen species requirements for bovine sperm capacitation and acrosome reaction^lenTheriogenology219990000199952289-30120161200v18n2a02.htm0093-691X 0 5 6 7 : < C v E G [ n ~ \ A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16018article4318^rND^sO'Flaherty^nCM^rND^sBeorlegui^nNB^rND^sBeconi^nMTReactive oxygen species requirements for bovine sperm capacitation and acrosome reaction^lenTheriogenology19990000199952289-30120161200v18n2a02.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY + 0 5 6 7 : < C v E G W m G 0 A @ a $ # 0 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16220article4320^rND^sCrdoba^nM^rND^sSanta-Coloma^nTA^rND^sBeorlegui^nNB^rND^sBeconi^nMTIntracellular calcium variation in heparin-capacitated bovine sperm^lenBiochemistry and Molecular Biology International219970000199741725-3320161200v18n2a02.htm1039-9712 0 5 6 7 : < C v E G W m G 0 A @ a # # / !80 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16220article4320^rND^sCrdoba^nM^rND^sSanta-Coloma^nTA^rND^sBeorlegui^nNB^rND^sBeconi^nMTIntracellular calcium variation in heparin-capacitated bovine sperm^lenBiochemistry and Molecular Biology International19970000199741725-3320161200v18n2a02.htm1039-9712BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY INTERNATIONALATIONAL , 0 5 6 7 : < C v E G W f v A @ # ' ) a+ 3 # ? v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16321article4321^rND^sCrdoba^nM^rND^sPintos^nL^rND^sBeconi^nMTHeparin and quercetin generate differential metabolic pathways that involve transferases and LDH dehydrogenase in cryopreserved bovine spermatozoa^lenTheriogenology2200700002007676420161200v18n2a02.htm0093-691X 0 5 6 7 : < C v E G W f v A @ " & ( a* 2 # > !G v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16321article4321^rND^sCrdoba^nM^rND^sPintos^nL^rND^sBeconi^nMTHeparin and quercetin generate differential metabolic pathways that involve transferases and LDH dehydrogenase in cryopreserved bovine spermatozoa^lenTheriogenology200700002007676420161200v18n2a02.htm0093-691XTHERIOGENOLOGY NOLOGY V- 0 5 6 7 : < C v E G Y h z f p A q @ y } ~ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16422article4322^rND^sWallimann^nT^rND^sDolder^nM^rND^sSchattner^nU^rND^sEder^nM^rND^sHornemann^nT^rND^sOGorman^nE^rND^sRuck^nA^rND^sBrdiczka^nDSome new aspects of creatine kinase (CK): compartmentation, structure, function and regulation for cellular and mitochondrial bioenergetics and physiology^lenBiofactors21998000019988229-3420161200v18n2a02.htm0951-6433 ^ 0 5 6 7 : < C v E G Y h z f A p @ x | } a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16422article4322^rND^sWallimann^nT^rND^sDolder^nM^rND^sSchattner^nU^rND^sEder^nM^rND^sHornemann^nT^rND^sOGorman^nE^rND^sRuck^nA^rND^sBrdiczka^nDSome new aspects of creatine kinase (CK): compartmentation, structure, function and regulation for cellular and mitochondrial bioenergetics and physiology^lenBiofactors1998000019988229-3420161200v18n2a02.htm0951-6433Biofactorsfactors / 0 5 6 7 : < C v E G Z i { A @ a " # . v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16624article4324^rND^sO'Flaherty^nC^rND^sBeconi^nM^rND^sBeorlegui^nNEffect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa^lenAndrologia219970000199729269-7520161200v18n2a02.htm0303-4569 0 5 6 7 : < C v E G Z i { A @ a ! # - !6 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16624article4324^rND^sO'Flaherty^nC^rND^sBeconi^nM^rND^sBeorlegui^nNEffect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa^lenAndrologia19970000199729269-7520161200v18n2a02.htm0303-4569Andrologiarologia 0 0 5 6 7 : < C v E G Y h { V A @ a # # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16725article4325^rND^sBeorlegui^nN^rND^sCetica^nP^rND^sTrinchero^nG,^rND^sCrdoba^nM^rND^sBeconi^nM.Comparative study of functional and biochemical parameters in frozen bovine sperm.^lenAndrologia21997000019972937-4220161200v18n2a02.htm0303-4569 0 5 6 7 : < C v E G Y h { V A @ a # " !+ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16725article4325^rND^sBeorlegui^nN^rND^sCetica^nP^rND^sTrinchero^nG,^rND^sCrdoba^nM^rND^sBeconi^nM.Comparative study of functional and biochemical parameters in frozen bovine sperm.^lenAndrologia1997000019972937-4220161200v18n2a02.htm0303-4569Andrologia ologia 2 T 0 5 6 7 : < C v E G S c $ - A . @ 6 : < aC K # W v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16927article4327^rND^sWu^nAH^rND^sBowers^nGNEvaluation and comparison of inmunoinhibition and inmunoprecipitation methods for differentiating MB and BB from macro forms of creatine kinase isoenzymes in patiens and healthy individuals^lenClin Chem2198200001982282017-2120161200v18n2a02.htm0009-9147 0 5 6 7 : < C v E G S c $ A - @ 5 9 ; aB J # V !_ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc16927article4327^rND^sWu^nAH^rND^sBowers^nGNEvaluation and comparison of inmunoinhibition and inmunoprecipitation methods for differentiating MB and BB from macro forms of creatine kinase isoenzymes in patiens and healthy individuals^lenClin Chem198200001982282017-2120161200v18n2a02.htm0009-9147Clin Chemin Chem 3 H 0 5 6 7 : < C v E G U f u A @ a ( # 4 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17028article4328^rND^sUrdal^nP^rND^sLandmark^nK^rND^sBasmo^nGMMononuclear cell magnesium and retention of magnesium after intravenous loading in patients with acute myocardial infarction^lenScand J Clin Lab Invest219920000199252763-620161200v18n2a02.htm0036-5513 0 5 6 7 : < C v E G U f u A @ a ' # 3 !< v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17028article4328^rND^sUrdal^nP^rND^sLandmark^nK^rND^sBasmo^nGMMononuclear cell magnesium and retention of magnesium after intravenous loading in patients with acute myocardial infarction^lenScand J Clin Lab Invest19920000199252763-620161200v18n2a02.htm0036-5513Scand J Clin Lab Invest Invest : 0 5 6 7 : < C v E G U b t Y A @ " % a, 4 # @ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17735article4335^rND^sRotem^nR^rND^sPaz^nGF^rND^sHomonnai^nZT^rND^sKalina^nM^rND^sLax^nY^rND^sBreitbart^nH,^rND^sNaor^nZCalcium-independent induction of acrosome reaction by protein kinase C in human sperm^lenEndocrinology21992000019921312235-4320161200v18n2a02.htm0013-7227 0 5 6 7 : < C v E G U b t Y A @ ! $ a+ 3 # ? !H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17735article4335^rND^sRotem^nR^rND^sPaz^nGF^rND^sHomonnai^nZT^rND^sKalina^nM^rND^sLax^nY^rND^sBreitbart^nH,^rND^sNaor^nZCalcium-independent induction of acrosome reaction by protein kinase C in human sperm^lenEndocrinology1992000019921312235-4320161200v18n2a02.htm0013-7227Endocrinology nology ; 0 5 6 7 : < C v E G S f w A @ a! ) # 5 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17836article4336^rND^sLax^nY^rND^sRubinstein^nS^rND^sBreibart^nHSubcellular distribution of protein kinase C alpha and beta I in bovine spermatozoa, and their regulation by calcium and phorbol esters^lenBiol Reprod219970000199756454-920161200v18n2a02.htm0006-3363 0 5 6 7 : < C v E G S f w A @ a ( # 4 != v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc17836article4336^rND^sLax^nY^rND^sRubinstein^nS^rND^sBreibart^nHSubcellular distribution of protein kinase C alpha and beta I in bovine spermatozoa, and their regulation by calcium and phorbol esters^lenBiol Reprod19970000199756454-920161200v18n2a02.htm0006-3363Biol Reprod Reprod A 0 5 6 7 : < C v E G X g j A @ a" * # 6 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18442article4342^rND^sMendes^nJOB^rND^sBurns^nPD^rND^sDe La Torre-Sanchez^nJF^rND^sSeidel^nGE.Effect of heparin on cleavage rates and embryo production with four bovine sperm preparation protocols^lenTheriogenology220030000200360331-4020161200v18n2a02.htm0093-691X 0 5 6 7 : < C v E G X g j A @ a! ) # 5 !> v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18442article4342^rND^sMendes^nJOB^rND^sBurns^nPD^rND^sDe La Torre-Sanchez^nJF^rND^sSeidel^nGE.Effect of heparin on cleavage rates and embryo production with four bovine sperm preparation protocols^lenTheriogenology20030000200360331-4020161200v18n2a02.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY A 0 5 6 7 : < C v E G Z j { e A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18543article4343^rND^sBreininger^nE^rND^sCetica^nPD^rND^sBeconi^nMT.Capacitation inducers act through diverse intracellular mechanisms in cryopreserved bovine sperm.^lenTheriogenology2201000002010741036-4920161200v18n2a02.htm0093-691X 0 5 6 7 : < C v E G Z j { e A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a02.htmSc18543article4343^rND^sBreininger^nE^rND^sCetica^nPD^rND^sBeconi^nMT.Capacitation inducers act through diverse intracellular mechanisms in cryopreserved bovine sperm.^lenTheriogenology201000002010741036-4920161200v18n2a02.htm0093-691XTHERIOGENOLOGYENOLOGY P 0 5 6 7 9 : A v C D U d s W A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc704article174^rND^sEl-Salhy^nM^rND^sVaali^nK.^rND^sDizdar^nV^rND^sHausken^nTAbnormal small intestinal endocrine cells in patients with irritable bowel syndrome^lenDig Dis Sci2201000002010553508-1320161200v18n2a03.htm0163-2116P 0 5 6 7 9 : A v C D U d s W A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc704article174^rND^sEl-Salhy^nM^rND^sVaali^nK.^rND^sDizdar^nV^rND^sHausken^nTAbnormal small intestinal endocrine cells in patients with irritable bowel syndrome^lenDig Dis Sci201000002010553508-1320161200v18n2a03.htm0163-2116Dig Dis SciDis Sci R N 0 5 6 7 9 : A v C D R d v c A @ ' + - a4 < # H v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc726article176^rND^sFacer^nP^rND^sBishop^nA.E.^rND^sLloyd,^nR.V.^rND^sWilson^nB.S.^rND^sHennessy,^nR.J.^rND^sPolak,^nJ.MChromogranin: a newly recognised marker for endocrine cells of the human gastrointestinal tract^lenGastroenterol2198500001985891366-7320161200v18n2a03.htm0892-9386 R 0 5 6 7 9 : A v C D R d v c A @ & * , a3 ; # G !P v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc726article176^rND^sFacer^nP^rND^sBishop^nA.E.^rND^sLloyd,^nR.V.^rND^sWilson^nB.S.^rND^sHennessy,^nR.J.^rND^sPolak,^nJ.MChromogranin: a newly recognised marker for endocrine cells of the human gastrointestinal tract^lenGastroenterol198500001985891366-7320161200v18n2a03.htm0892-9386Gastroenterol nterol] d 0 5 6 7 9 ; B v D F Y m } h ( A ) @ 1 5 8 a? G # S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc8317article1717^rND^sShroyer^nN.F.^rND^sHelmrath^nM.A.^rND^sWang^nV.Y.^rND^sAntalffy^nB^rND^sHenning^nS.J.^rND^sZoghbi^nH.Y.Intestine-specific ablation of mouse atonal homolog 1 (Math1) reveals a role in cellular homeostasis^lenGastroenterol22007000020071322478-8820161200v18n2a03.htm0892-9386] 0 5 6 7 9 ; B v D F Y m } h A ( @ 0 4 7 a> F # R ![ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a03.htmSc8317article1717^rND^sShroyer^nN.F.^rND^sHelmrath^nM.A.^rND^sWang^nV.Y.^rND^sAntalffy^nB^rND^sHenning^nS.J.^rND^sZoghbi^nH.Y.Intestine-specific ablation of mouse atonal homolog 1 (Math1) reveals a role in cellular homeostasis^lenGastroenterol2007000020071322478-8820161200v18n2a03.htm0892-9386Gastroenterolenterol x 0 5 6 7 9 : A v C D S c s N A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc967article247^rND^sGrhn^nYT^rND^sEicker^nSW^rND^sDucrocq^nV^rND^sHertil^nJAEffect of Diseases on the Culling of Holstein Dairy Cows in New York State^lenJournal of Dairy Science219980000199881966-97820161200v18n2a04.htm0022-0302 0 5 6 7 9 : A v C D S c s N A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc967article247^rND^sGrhn^nYT^rND^sEicker^nSW^rND^sDucrocq^nV^rND^sHertil^nJAEffect of Diseases on the Culling of Holstein Dairy Cows in New York State^lenJournal of Dairy Science19980000199881966-97820161200v18n2a04.htm0022-0302Journal of Dairy Science cience 4 0 5 6 7 9 : A v C D U c s w 2 A 3 @ ; ? A aG O # [ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc978article248^rND^sGruber^nBL.^rND^sSorbi^nD^rND^sFrench^nDL^rND^sMarchese^nMJ^rND^sNuovo^nGJ.^rND^sKew^nRRMarkedly elevated serum MMP-9 (gelatinase B) levels in rheumatoid arthritis: a potentially useful laboratory marker^lenClin Immunol Immunopathol219960000199678161-7120161200v18n2a04.htm0090-1229 $ 0 5 6 7 9 : A v C D U c s w A 2 @ : > @ aF N # Z !c v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc978article248^rND^sGruber^nBL.^rND^sSorbi^nD^rND^sFrench^nDL^rND^sMarchese^nMJ^rND^sNuovo^nGJ.^rND^sKew^nRRMarkedly elevated serum MMP-9 (gelatinase B) levels in rheumatoid arthritis: a potentially useful laboratory marker^lenClin Immunol Immunopathol19960000199678161-7120161200v18n2a04.htm0090-1229Clin Immunol Immunopatholopathol 0 5 6 7 : < C v E G V g O A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10011article2411^rND^sIsmail^nB^rND^sNielsen^nSSPlasmin protease in milk: Current knowledge and relevance to dairy industry^lenJournal of Dairy Science220100000201093114999-500920161200v18n2a04.htm0022-0302 0 5 6 7 : < C v E G V g O A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10011article2411^rND^sIsmail^nB^rND^sNielsen^nSSPlasmin protease in milk: Current knowledge and relevance to dairy industry^lenJournal of Dairy Science20100000201093114999-500920161200v18n2a04.htm0022-0302Journal of Dairy ScienceScience 0 5 6 7 : < C v E G W j y _ A ! @ ) - a/ 7 # C v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10112article2412^rND^sMehrzad^nJ^rND^sDesrosiers^nC^rND^sLauzon^nK^rND^sRobitaille^nG^rND^sZhao^nX^rND^sLacasse^nPProteases Involved in Mammary Tissue Damage During Endotoxin-Induced Mastitis in Dairy Cows^lenJournal of Dairy Science22005000020058820161200v18n2a04.htm0022-0302 0 5 6 7 : < C v E G W j y _ A @ ( , a. 6 # B !K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10112article2412^rND^sMehrzad^nJ^rND^sDesrosiers^nC^rND^sLauzon^nK^rND^sRobitaille^nG^rND^sZhao^nX^rND^sLacasse^nPProteases Involved in Mammary Tissue Damage During Endotoxin-Induced Mastitis in Dairy Cows^lenJournal of Dairy Science2005000020058820161200v18n2a04.htm0022-0302Journal of Dairy Science cience l ~ 0 5 6 7 : < C v E G W j + A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10314article2414^rND^sNielsen^nC^rND^sEmanuelson^nUMastitis control in Swedish dairy herds^lenJournal of Dairy Science2201300002013961120161200v18n2a04.htm0022-0302 0 5 6 7 : < C v E G W j + A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10314article2414^rND^sNielsen^nC^rND^sEmanuelson^nUMastitis control in Swedish dairy herds^lenJournal of Dairy Science201300002013961120161200v18n2a04.htm0022-0302Journal of Dairy ScienceScience 0 5 6 7 : < C v E G ` q ? A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10415article2415^rND^sOlde Riekerink^nRGM^rND^sBarkema^nHW^rND^sKelton^nDF^rND^sScholl^nDTIncidence Rate of Clinical Mastitis on Canadian Dairy Farms^lenJournal of Dairy Science220080000200891420161200v18n2a04.htm0022-0302 0 5 6 7 : < C v E G ` q ? A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10415article2415^rND^sOlde Riekerink^nRGM^rND^sBarkema^nHW^rND^sKelton^nDF^rND^sScholl^nDTIncidence Rate of Clinical Mastitis on Canadian Dairy Farms^lenJournal of Dairy Science20080000200891420161200v18n2a04.htm0022-0302Journal of Dairy ScienceScience " 0 5 6 7 : < C v E G Y h x g A @ " a+ 3 # ? v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10718article2418^rND^sPitkala,^nAM^rND^sHaveri^nS^rND^sPyorala^nV^rND^sHonkanen- Buzalski,^nTBovine mastitis in Finland 2001- Prevalence, distribution of bacteria, and antimicrobial resistance^lenJournal of Dairy Science2200400002004872433-244120161200v18n2a04.htm0022-0302 0 5 6 7 : < C v E G Y h x g A @ ! a* 2 # > !G v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10718article2418^rND^sPitkala,^nAM^rND^sHaveri^nS^rND^sPyorala^nV^rND^sHonkanen- Buzalski,^nTBovine mastitis in Finland 2001- Prevalence, distribution of bacteria, and antimicrobial resistance^lenJournal of Dairy Science200400002004872433-244120161200v18n2a04.htm0022-0302Journal of Dairy Science cience # 0 5 6 7 : < C v E G V d *z ) ? A @ @ H L N aU ] # i v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10819article2419^rND^sRaulo^nSM^rND^sSorsa^nT^rND^sTervahartiala^nTet al.Increase in milk metalloproteinase activity and vascularpermeability in bovine endotoxin-induced and naturally occurring Escherichia coli mastitis^lenVeterinary Immunology and Immunopathology220020000200285137-14520161200v18n2a04.htm0165-2427 6 0 5 6 7 : < C v E G V d *z ) A ? @ G K M aT \ # h !q) v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc10819article2419^rND^sRaulo^nSM^rND^sSorsa^nT^rND^sTervahartiala^nTet al.Increase in milk metalloproteinase activity and vascularpermeability in bovine endotoxin-induced and naturally occurring Escherichia coli mastitis^lenVeterinary Immunology and Immunopathology20020000200285137-14520161200v18n2a04.htm0165-2427VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGYTHOLOGY % @ 0 5 6 7 : < C v E G c y ] A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc11021article2421^rND^sSnoek-van Beurden^nPAM^rND^sVon den Hoff^nJWZymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors^lenBioTechniques22005000020053873-8320161200v18n2a04.htm0736-6205 0 5 6 7 : < C v E G c y ] A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a04.htmSc11021article2421^rND^sSnoek-van Beurden^nPAM^rND^sVon den Hoff^nJWZymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors^lenBioTechniques2005000020053873-8320161200v18n2a04.htm0736-6205Biotechniqueshniques _ 0 5 6 7 9 : A v C D T g t A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSc705article175^rND^sDurn^nM.C^rND^sMarqus^nF.J.Detection of Neorickettsia risticii, the agent of Potomac horse fever, in a Gypsy Vanner stallion from Manitoba.^lenCan Vet J220161200201657293-29520161200v18n2a06.htm0008-5286 _ 0 5 6 7 9 : A v C D T g t A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSc705article175^rND^sDurn^nM.C^rND^sMarqus^nF.J.Detection of Neorickettsia risticii, the agent of Potomac horse fever, in a Gypsy Vanner stallion from Manitoba.^lenCan Vet J20161200201657293-29520161200v18n2a06.htm0008-5286Can Vet J Vet Je 0 5 6 7 9 ; B v D F Y h { , A - @ 5 9 < aA I # U v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSc7611article1711^rND^sGreiman^nS.E.^rND^sTkach^nM.^rND^sVaughan^nJ.A.^rND^sTkach^nV.V.Laboratory maintenance of the bacterial endosymbiont, Neorickettsia sp., through the life cycle of a digenean, Plagiorchis elegans.^lenExperimental Parasitology220150000201515778-8320161200v18n2a06.htm0014-4894e 0 5 6 7 9 ; B v D F Y h { A , @ 4 8 ; a@ H # T !] v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSc7611article1711^rND^sGreiman^nS.E.^rND^sTkach^nM.^rND^sVaughan^nJ.A.^rND^sTkach^nV.V.Laboratory maintenance of the bacterial endosymbiont, Neorickettsia sp., through the life cycle of a digenean, Plagiorchis elegans.^lenExperimental Parasitology20150000201515778-8320161200v18n2a06.htm0014-4894Experimental Parasitologyitology g , 0 5 6 7 9 ; B v D F S a q k A @ a ! # - v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSc7813article1713^rND^sLin^nM.^rND^sZhang^nC^rND^sGibson^nK.^rND^sRikihisa^nYAnalysis of complete genome sequence of Neorickettsia risticii: causative agent of Potomac horse fever.^lenNucleic Acids Res.220090000200937186076-609120161200v18n2a06.htm0305-1048g 0 5 6 7 9 ; B v D F S a q k A @ a # , !5 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a06.htmSc7813article1713^rND^sLin^nM.^rND^sZhang^nC^rND^sGibson^nK.^rND^sRikihisa^nYAnalysis of complete genome sequence of Neorickettsia risticii: causative agent of Potomac horse fever.^lenNucleic Acids Res.20090000200937186076-609120161200v18n2a06.htm0305-1048Nucleic Acids Res. s Res. f z 0 5 6 7 9 : A v B C T c s ) ; A < @ D H J aS [ # g v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc572article92^rND^sFrisk^nA.L.^rND^sKonig^nM.^rND^sMoritz^nA.^rND^sBaumgartner^nW.Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum, whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper^lenJ. Clin. Microbiol2199900001999373634-364320161200v18n2a07.htm0095-1137 0 5 6 7 9 : A v B C T c s ) A ; @ C G I aR Z # f !o v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc572article92^rND^sFrisk^nA.L.^rND^sKonig^nM.^rND^sMoritz^nA.^rND^sBaumgartner^nW.Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum, whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper^lenJ. Clin. Microbiol199900001999373634-364320161200v18n2a07.htm0095-1137J. clin. Microbiol robiol &g 0 5 6 7 9 : A v B C Z k { 3 J A K @ S W Z aa i # u v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc583article93^rND^sGallo Caldern^nM^rND^sRemorini^nP^rND^sPeriolo^nO^rND^sIglesias^nM.^rND^sMattion^nN.^rND^sLa Torre^nJDetection by RT-PCR and genetic characterization of canine distemper virus from vaccinated and non-vaccinated dogs in Argentina.^lenVeterinary Microbiology2200700002007125341-34920161200v18n2a07.htm0378-1135 < 0 5 6 7 9 : A v B C Z k { 3 A J @ R V Y a` h # t !} v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc583article93^rND^sGallo Caldern^nM^rND^sRemorini^nP^rND^sPeriolo^nO^rND^sIglesias^nM.^rND^sMattion^nN.^rND^sLa Torre^nJDetection by RT-PCR and genetic characterization of canine distemper virus from vaccinated and non-vaccinated dogs in Argentina.^lenVeterinary Microbiology200700002007125341-34920161200v18n2a07.htm0378-1135VETERINARY MICROBIOLOGYBIOLOGY h 0 5 6 7 9 : A v B C R a p A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc594article94^rND^sLi Yi,^nS^rND^sHongli^nX^rND^sJianke^nW^rND^sYuening^nCH^rND^sShen^nY^rND^sBin^nLDevelopment of a combined canine distemper virus specific RT-PCR protocol for the differentiation of infected and vaccinated animals (DIVA) and genetic characterization of the hemagglutinin gene of seven Chinese strains demonstrated in dogs^lenJournal of Virological Methods2201200002012179281-28720161200v18n2a07.htm0166-0934 0 5 6 7 9 : A v B C R a p A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc594article94^rND^sLi Yi,^nS^rND^sHongli^nX^rND^sJianke^nW^rND^sYuening^nCH^rND^sShen^nY^rND^sBin^nLDevelopment of a combined canine distemper virus specific RT-PCR protocol for the differentiation of infected and vaccinated animals (DIVA) and genetic characterization of the hemagglutinin gene of seven Chinese strains demonstrated in dogs^lenJournal of Virological Methods201200002012179281-28720161200v18n2a07.htm0166-0934Journal of Virological Methods ethods j 0 5 6 7 9 : A v B C T b s ? A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc616article96^rND^sMorales^nM.^rND^sMora^nL.^rND^sSalazar^nJ.Distemper canino: sobrevida por edad, sexo raza y estacin.^lesAvances en Ciencias Veterinarias21997000019971220161200v18n2a07.htm0716-260X 0 5 6 7 9 : A v B C T b s ? A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc616article96^rND^sMorales^nM.^rND^sMora^nL.^rND^sSalazar^nJ.Distemper canino: sobrevida por edad, sexo raza y estacin.^lesAvances en Ciencias Veterinarias1997000019971220161200v18n2a07.htm0716-260XAVANCES EN CIENCIAS VETERINARIAS NARIAS l 0 5 6 7 9 : A v B C W i x = " A @ a # $ v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc638article98^rND^sScagliarini^nA^rND^sBattilani^nM^rND^sCiulli^nS^rND^sPrsperi^nS^rND^sMorganti^nLMolecular analysis of the NP Gene of Italian CDV Isolates^lenVeterinary Research Communications2200000002000^s1355-35720161200v18n2a07.htm0165-7380 0 5 6 7 9 : A v B C W i x = " A @ a # # !," v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc638article98^rND^sScagliarini^nA^rND^sBattilani^nM^rND^sCiulli^nS^rND^sPrsperi^nS^rND^sMorganti^nLMolecular analysis of the NP Gene of Italian CDV Isolates^lenVeterinary Research Communications200000002000^s1355-35720161200v18n2a07.htm0165-7380VETERINARY RESEARCH COMMUNICATIONSCATIONS m ` 0 5 6 7 9 : A v B C V i w > A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc649article99^rND^sVandevelde^nB^rND^sKristensen^nK^rND^sBrand^nC^rND^sGreene^nL.^rND^sHoerlein^nBChronic Canine distemper virus encephalitis in mature dogs^lenVeterinary Pathology21980000019801717-2920161200v18n2a07.htm0300-9858 0 5 6 7 9 : A v B C V i w > A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a07.htmSc649article99^rND^sVandevelde^nB^rND^sKristensen^nK^rND^sBrand^nC^rND^sGreene^nL.^rND^sHoerlein^nBChronic Canine distemper virus encephalitis in mature dogs^lenVeterinary Pathology1980000019801717-2920161200v18n2a07.htm0300-9858Veterinary pathologythology , 0 5 6 7 9 ; B v D F V c *q w " A # @ + / 1 a7 ? # K v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc7512article1212^rND^sVranckx^nK^rND^sMaes^nD^rND^sCalus^nDet al.Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis is a suitable tool for differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae strains without cultivation^lenJ. Clin. Microbiol.2201100002011492020-320161200v18n2a08.htm0095-1137 0 5 6 7 9 ; B v D F V c *q w A " @ * . 0 a6 > # J !S v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a08.htmSc7512article1212^rND^sVranckx^nK^rND^sMaes^nD^rND^sCalus^nDet al.Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis is a suitable tool for differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae strains without cultivation^lenJ. Clin. Microbiol.201100002011492020-320161200v18n2a08.htm0095-1137J. clin. Microbiol.robiol. C ; 0 5 6 7 9 : A v C D T e v A A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc772article162^rND^sBailey^nL.^rND^nR.D.^sWoods^rND^nA.G.^sGibbsSacbrood virus of larval honey bee (Apis mellifera Linnaeus )^lenVirol219640000196423425-2920161200v18n2a09.htm0042-6822C 0 5 6 7 9 : A v C D T e v A A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc772article162^rND^sBailey^nL.^rND^nR.D.^sWoods^rND^nA.G.^sGibbsSacbrood virus of larval honey bee (Apis mellifera Linnaeus )^lenVirol19640000196423425-2920161200v18n2a09.htm0042-6822Virol22Virol H x? 0 5 6 7 9 : A v C D V e F A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc827article167^rND^sGenersch,^nE^rND^nM^sAubertEmerging and re-emerging viruses of the honey bee (Apis mellifera)^lenVet Res22010000020104165420161200v18n2a09.htm0928-4249 H ~ 0 5 6 7 9 : A v C D V e F A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc827article167^rND^sGenersch,^nE^rND^nM^sAubertEmerging and re-emerging viruses of the honey bee (Apis mellifera)^lenVet Res2010000020104165420161200v18n2a09.htm0928-4249Vet Res et ResI P@ V 0 5 6 7 9 : A v C D X 7 A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc838article168^rND^sOuchterlony^nODiffusion-in-gel methods for immunological analysis^lenAllergy219580000195851-7820161200v18n2a09.htm0105-4538 I V 0 5 6 7 9 : A v C D X 7 A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc838article168^rND^sOuchterlony^nODiffusion-in-gel methods for immunological analysis^lenAllergy19580000195851-7820161200v18n2a09.htm0105-4538ALLERGY LLERGYK A 0 5 6 7 9 ; B v D F U g *| s A @ a # ) v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8510article1610^rND^sRader^nR.^rND^sHowlett^nB.G^rND^sCunningham^nS.Aet alAlternative pollinator taxa are equally efficient but not as effective as the honeybee in a mass flowering crop^lenJ Appl Ecol2200900002009461080-8720161200v18n2a09.htm0021-8901K 0 5 6 7 9 ; B v D F U g *| s A @ a # ( !1 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8510article1610^rND^sRader^nR.^rND^sHowlett^nB.G^rND^sCunningham^nS.Aet alAlternative pollinator taxa are equally efficient but not as effective as the honeybee in a mass flowering crop^lenJ Appl Ecol200900002009461080-8720161200v18n2a09.htm0021-8901J Appl Ecolpl Ecol L B 0 5 6 7 9 ; B v D F V h w p A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8611article1611^rND^sRibiere^nM^rND^sFaucon^nJ.P.^rND^sPpin^nM.Detection of chronic honey bee (Apis mellifera L.) paralysis virus infection: application to a field survey.^lenApidologie220000000200031567-7720161200v18n2a09.htm0044-8435 L 0 5 6 7 9 ; B v D F V h w p A @ a # !" v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc8611article1611^rND^sRibiere^nM^rND^sFaucon^nJ.P.^rND^sPpin^nM.Detection of chronic honey bee (Apis mellifera L.) paralysis virus infection: application to a field survey.^lenApidologie20000000200031567-7720161200v18n2a09.htm0044-8435Apidologiedologie Q F 0 5 6 7 9 ; B v D F Z m K A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc9116article1616^rND^sVaitukaitis^nJ^rND^sRobbins^nJ.B.^rND^sNieschlag^nE^rND^sRoss^nG.TA method for producing specific antisuera with small doses of immunogen^lenJ Clin Endocrinol Metab219710000197133988-9120161200v18n2a09.htm0021-972XQ 0 5 6 7 9 ; B v D F Z m K A @ a # !! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a09.htmSc9116article1616^rND^sVaitukaitis^nJ^rND^sRobbins^nJ.B.^rND^sNieschlag^nE^rND^sRoss^nG.TA method for producing specific antisuera with small doses of immunogen^lenJ Clin Endocrinol Metab19710000197133988-9120161200v18n2a09.htm0021-972XJ Clin Endocrinol Metabl Metab 0 5 6 7 9 ; B v D F ] l A @ V A @ a # + v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc9912article1712^rND^sRuiz-Carretero^nP^rND^sNacher^nA^rND^sMerino-Sanjuan^nM^rND^sCasabo^nV.G.200000002000Pharmacokinetics and absolute bioavailability of oral cefuroxime axetil in the rat^lenInt J Pharm220000000200020289-9620161200v18n2a10.htm0378-5173 0 5 6 7 9 ; B v D F ] l A @ V A @ a # * !3 v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc9912article1712^rND^sRuiz-Carretero^nP^rND^sNacher^nA^rND^sMerino-Sanjuan^nM^rND^sCasabo^nV.G.200000002000Pharmacokinetics and absolute bioavailability of oral cefuroxime axetil in the rat^lenInt J Pharm20000000200020289-9620161200v18n2a10.htm0378-5173Int J PharmJ Pharm B t 0 5 6 7 : < C v E G X ' A @ a # v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10013article1713^rND^sSchwartz^nGEstimating the dimension of a model^lenAnn Stat21978000019786461-420161200v18n2a10.htm0090-5364 H 0 5 6 7 : < C v E G X ' A @ a # ! v18n2c:\scielo\serial\invet\v18n2\markup\v18n2a10.htmSc10013article1713^rND^sSchwartz^nGEstimating the dimension of a model^lenAnn Stat1978000019786461-420161200v18n2a10.htm0090-5364Ann Statnn Stat
