[article pii="nd" doctopic="oa" language="es" ccode="FVET" status="1" version="4.0" type="ilus" order="09" seccode="invet060" sponsor="nd" stitle="InVet" volid="18" issueno="2" dateiso="20161200" fpage="363" lpage="370" issn="1668-3498"]ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
[front][titlegrp][title language="es"]Desarrollo de una técnica de inmunodifusión para la detección del virus Sacbrood en abejas[/title][/titlegrp]
[authgrp][author role="nd" rid="a01"][surname]Albo[/surname], [fname]GN.[/fname]1*[/author]; [author role="nd" rid="a01"][surname]Kuzmanich[/surname], [fname]R.[/fname]1[/author]; [author role="nd" rid="a02 a03"][surname]Reynaldi[/surname], [fname]FJ.[/fname][/author]2,3; [author role="nd" rid="a02 a03"][surname]Picotto[/surname], [fname]LD.[/fname][/author]2,3; [author role="nd" rid="a03"][surname]Sguazza[/surname], [fname]GH.[/fname][/author]3[/authgrp]
1[aff
id="a01" orgname="UNLP" orgdiv1="Facultad de Ciencias
Agrarias y Forestales"]Curso de Producción Animal I. Facultad de Ciencias Agrarias
y Forestales, UNLP,[/aff]
2[aff id="a02" orgname="CONICET"]CCT-CONICET [city]La Plata[/city][/aff]
3[aff id="a03" orgname="UNLP"
orgdiv1="Facultad de Ciencias Veterinarias"]LAVIR (Laboratorio de
Virología), Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP * e-mail: albo.graciela@yahoo.com.ar; Calle
60 y 118 s/n. Curso de Producción Animal I. FCAyF, UNLP. [city]La Plata[/city],
Provincia de [state]Buenos Aires[/state]. [country]ARGENTINA[/country][/aff]
[bibcom]Recibido: [hist][received
dateiso="20161128"]28/11/2016[/received]
Aceptado: [accepted dateiso="20170622"]22/06/2017[/accepted][/hist]
Resumen
[abstract
language="es"]La
apicultura es una de las actividades agrícolas más importantes de la República
Argentina. En los últimos años se ha observado, a nivel mundial, una marcada
disminución en el número de abejas. La mortalidad de las abejas, puede
atribuirse a la interacción de factores ambientales, al manejo de las colonias
o a la acción de diversos microorganismos, entre ellos los virus. Teniendo en
cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con técnicas de
diagnostico moleculares para la detección de virus, el objetivo de este trabajo
fue desarrollar un test de inmunodifusión que permita la detección del Virus de
la Cría Ensacada de forma más sencilla y económica.
Para ello una cepa autóctona del virus Virus de la Cría Ensacada fue utilizada
para inocular un conejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos específicos
contra este virus, que posteriormente fueron utilizados para estandarizar la
técnica de inmuodifusión. Esta técnica podría ser de gran utilidad en el futuro
para realizar un relevamiento rápido de las condiciones sanitarias para SBV en
colmenas de la República Argentina ya que debido a su baja complejidad podría
ser llevada a cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el país.[/abstract]
Palabras clave: [keygrp scheme="nd"][keyword type="m" language="es"]Abejas melíferas[/keyword]; [keyword type="m" language="es"]Virus[/keyword]; [keyword type="m" language="es"]Cría ensacada[/keyword]; [keyword type="m" language="es"]Inmunodifusión[/keyword][/keygrp].
[title language="en"]Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus[/title]
Summary
[abstract language="en"]Beekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.[/abstract]
Key words: [keygrp scheme="nd"][keyword type="m" language="en"]Honey bees[/keyword]; [keyword type="m" language="en"]Virus[/keyword]; [keyword type="m" language="en"]Sacbrood[/keyword]; [keyword type="m" language="en"]Immunodiffusion[/keyword].[/keygrp][/bibcom][/front]
[body]Introducción
La apicultura es importante
para el hombre, fundamentalmente por el rol de la abeja melífera (Apis
mellífera., L) en su desempeño como polinizador de cultivos10.
La polinización no solo asegura la reproducción sexual en la mayoría de la
plantas con flores, si no también, en forma indirecta la sustentabilidad
productiva y el mantenimiento de la biodiversidad de la mayoría de los
ecosistemas terrestres14. En particular la
polinización producida por las abejas es necesaria para más del 35% de los
cultivos del mundo que producen alimentos básicos para el hombre1.
Desde el punto de vista de la producción de miel, la apicultura es una de las
actividades agrícolas más importantes de la República Argentina (en la
actualidad, nuestro país ocupa el 5º lugar como productor mundial de miel) lo
que representa un ingreso promedio anual cercano a los 100 millones de dólares,
provenientes de la explotación de más de 4,5 millones de colmenas.
Desde octubre de 2006, comenzaron a producirse a gran escala, pérdidas
inexplicables de abejas en Estados Unidos y la Unión Europea, que afectaron
negativamente la oferta global de miel. El fenómeno, denominado Síndrome de
despoblamiento de las colmenas (SDC), fue en parte responsable de la
disminución del 2% en la producción mundial de miel, desde 2006 hasta 2007. En
la actualidad, el SDC sigue siendo un problema para la producción y el comercio
de miel; particularmente en Estados Unidos y la Unión Europea, que han sido las
regiones más afectadas.
Las abejas son susceptibles de padecer enfermedades causadas por distintos
tipos de parásitos, hongos, bacterias y virus. En los últimos años las
enfermedades de origen viral de las abejas han adquirido un particular interés
ya que han causado diversos problemas en países productores como en Estados
Unidos5. Hasta el presente se han identificado 24
virus de abejas que infectan las colonias 6, 9. La
mayoría de estos virus tienen un genoma de ARN de simple cadena con polaridad
positiva y son clasificados como virus tipo Picornavirus 4,
12. Si bien muchos de estos virus con frecuencia existen en la
colonia como infecciones latentes pueden multiplicarse rápidamente bajo
condiciones de estrés y causar enfermedad.
En A. mellifera la enfermedad de la cría ensacada es producida por el
virus Sacbrood, también conocido como SBV (de acuerdo a su sigla en inglés). El
SBV pertenece al Género Iflavirus, Familia Iflaviridae, Orden Picornavirales.
SBV es una de las virosis de abejas más extensamente distribuidas,
encuentrandose en colonias de A. mellifera de todos los continentes.
En la cría en desarrollo el virus se multiplica en el interior de las glándulas
dermales que recubren el cuerpo del insecto; dichas glándulas son las
encargadas de segregar enzimas que desprenden la cutícula durante el proceso de
muda. El virus inhibe la secreción de estas enzimas, por lo que la larva no
puede desprenderse de su cutícula. Por lo tanto, las larvas van cambiando de
color conforme progresa la enfermedad.
No obstante, SVB también se multiplica en abejas jóvenes sin causar síntomas
aparentes2, esto permite que el virus persista en
las colonias año a año, sin embargo no se observa un gran porcentaje de muerte
de larvas porque las abejas adultas detectan y remueven la mayoría de las
larvas en estadios tempranos de infección. Los brotes más comunes de esta
enfermedad ocurren en primavera y a comienzos de verano o cuando el forraje es
limitado3. Ya que los efectos de la infección
viral no siempre son observables, existe un reto adicional en el diagnóstico y
seguimiento de estas infecciones virales6. El
conocimiento de la incidencia y diseminación de cada uno de estos virus a nivel
mundial, es vital para la predicción de epizootias, lo cual permite, el control
más efectivo de la enfermedad. Los datos epidemiológicos de la enfermedad también
aportarían información sobre la causa de la resistencia de las abejas de
América del Sur con respecto a las de América del Norte y Europa6.
En base a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue el de desarrollar un
método de doble inmunodifusión con el fin de simplificar el diagnostico de esta
enfermedad. .
Materiales y Métodos
Aislamiento y purificación viral
Para el desarrollo de este
trabajo se utilizó como punto de partida una cepa autóctona de SBV, previamente
aislada en la Cátedra de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de
la UNLP durante el año 2011. Con el fin de aumentar el título viral de esta
muestra, se inoculo inicialmente 10¼l de la suspensión viral en el abdomen de
15 pupas de abejas de 15 días de edad (pupas de ojos rojos), utilizando una
jeringa Hamilton. Una vez inoculadas las pupas fueron mantenidas a 22°C (±1)
durante tres días (para permitir la replicación del virus). Transcurrido el
tiempo de incubación, se realizo un macerado en mortero con arena estéril de
las pupas infectadas con solución fisiológica. El homogenizado obtenido fue
clarificado por centrifugación a 5.000 g durante 15 minutos, y posteriormente
esterilizado por filtración (con filtro de 0,22 ¼m) y almacenado a -70°C hasta
su uso. De la misma manera que se explicó anteriormente, se realizaron dos
nuevos pasajes del virus en un mayor número de pupas de abeja (40 y 100 pupas
respectivamente).
La suspensión viral obtenida en los tres pasajes se concentró por
centrifugación a 28.000 g durante 5 horas y posteriormente fue purificada por
ultra-centrifugación en gradiente de sacarosa (20-60%) a 40.000 g en una
Ultracentrífuga (Beckman, Modelo L8-80M) con un rotor de ángulo fijo (Type
50Ti) a 5ºC durante 6 horas.
La fracción que contenía las partículas virales fue finalmente concentrada por
ultracentrifugación a 28.000 g durante 4 horas. El pellet que se obtuvo fue
resuspendido en solución fisiológica, la suspensión obtenida de esta manera se
esterilizo por filtración con filtro de 0,22 ¼m y conservada a -70° C hasta su
posterior uso en los ensayos de obtención de anticuerpos. Para confirmar la
presencia del virus en la fracción purificada se llevo a cabo un examen por
microscopia electrónica. La identidad del virus purificado fue corroborada por
medio de una RT-PCR que permite la detección de distintos virus de abejas
(entre ellos SBV) previamente estandarizada en nuestro laboratorio13.
Obtención de anticuerpos anti-SBV
Para la obtención de
anticuerpos específicos contra SBV, la solución de virus previamente purificada
fue inoculada en un conejo de acuerdo al protocolo estándar16.
Brevemente, la suspensión de virus purificado conteniendo aproximadamente 250
¼g de proteínas virales totales fue combinada en partes iguales con adyuvante
completo de Freund y se mezcló enérgicamente con ayuda de un vortex durante 5
minutos. La emulsión así obtenida (aproximadamente 1 cm3) fue
inoculada en un conejo por vía subcutánea. A los 15 días post-inoculación se
efectuó una segunda inoculación (1er booster) con las mismas
condiciones descriptas anteriormente, pero utilizando adyuvante incompleto de
Freund. A los 30 días posteriores a la primo-inoculación se realizó una tercera
inoculación (2do booster) utilizando 500 ¼g de la solución de
proteínas virales totales en solución acuosa (sin adyuvante). Todas las
técnicas previamente descriptas fueron avaladas por el CICUAL (protocolo nº
58-4-16P).
Pasados los 45 días post-inoculación, una muestra de suero del conejo inoculado
fue analizada por un ensayo de western blot con el fin de confirmar la
presencia de anticuerpos contra el virus.
Western Blot
El análisis del suero por western blot se llevo a cabo de acuerdo al protocolo original de Towbin15. Inicialmente se sembraron 15 ¼l de la solución viral (la misma con que se inoculó el conejo) en un gel de poliacrilamida al 12,5%. Luego de la electroforesis el gel se equilibro con un buffer de transferencia (48 mM Tris, 39 mM Glicina y 20% metanol - pH 9.2) y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, previamente humedecida en el mismo buffer, aplicando una corriente transversal de 15 V durante 30 min. Una vez realizada la transferencia, la membrana se bloqueo con una solución de PBS conteniendo 5% de leche en polvo durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente la membrana se incubó con una dilución 1:500 del suero obtenido del conejo durante 2 hs a 37ºC con agitación suave, luego se realizaron 3 lavados con PBS con 0.1% de Tween-20. Finalmente la membrana se incubó con una dilución 1:2000 del segundo anticuerpo (anti-conejo marcado con peroxidasa) durante 2 hs a 37º con agitación suave. El revelado se realizó incubando la membrana en una solución de diaminobencidina y agua oxigenada. También se utilizo como control negativo, un suero normal de conejo en las mismas condiciones previamente descriptas.
Desarrollo del test inmunodifusión
Una vez que se comprobó la
presencia de anticuerpos en el conejo inoculado, este fue sangrado. El suero
obtenido se fracciono en alícuotas y se conservaron a -20°C para su posterior
uso en el desarrollo de la prueba de inmunodifusión. La técnica de
inmunodifusión se realizó en placas de Petri de acuerdo al método de
Ouchterlony8. Para ello, se realizaron
perforaciones en el gel con un sacabocados de 6 pocillos periféricos alrededor
de un pocillo central (en forma de roseta). El suero específico anti-SBV fue
colocado en el pocillo central y el antígeno control (virus purificado) en tres
pocillos exteriores alternados, mientras que las muestras a probar en los
fueron sembradas en los tres pocillos restantes. Finalmente la placa fue
incubada en atmósfera de humedad dentro de un rango de temperatura de 20 a 25ºC
y se realizó la lectura de las líneas de precipitación utilizando una luz
puntiforme a las 24-48 hs.
Para conseguir las condiciones óptimas de precipitación, en primer lugar se
probaron distintas cantidades de salinidad y pH del agar y posteriormente se
estandarizaron las concentraciones de antígeno y anticuerpos. Una vez puesta a
punto la técnica, se analizaron 40 muestras de campo obtenidas a partir del
sobrenadante del macerado de 15 abejas en 2 ml de PBS provenientes de distintos
colmenares de la provincia de Buenos Aires. Todos los resultados obtenidos por
la prueba de inmunodifusion (tanto positivos como negativos) fueron confirmados
por medio de una RT-PCR13.
Resultados
Aislamiento y purificación viral
La suspensión viral obtenida luego de los tres pasajes por pupas fue concentrada y parcialmente purificada por ultra-centrifugación (Figura 1A). La fracción purificada fue analizada por microscopia electrónica para confirmar la presencia del virus, observándose partículas virales correspondientes a virus sin envoltura, con simetría icosaédrica y un diámetro de aproximadamente 30nm, consistente con las características esperadas para un picornavirus (Figura 1B). Para corroborar la identidad del virus purificado se realizó una RT-PCR, por medio de la cual pudo observarse la presencia de una banda de aproximadamente 350pb (Figura 1C), lo cual se condice con el tamaño esperado del fragmento amplificado a partir del virus SBV (342pb).
Figura 1. A:
Purificación del virus por ultra-centrifugación. B: Micrografía
electrónica de la muestra de virus purificado
Obtención de anticuerpos anti-SBV
Al analizar por Western Blot una muestra de suero del conejo inoculado (a los 45 días posteriores a la primer inoculación), se observó la presencia de varias bandas especificas para el virus SBV, de aproximadamente 25, 34, 37 y 44 KDa que pueden corresponder a las proteínas estructurales de virus y una banda de gran intensidad con un peso estimado de 80 KDa, posiblemente debido a la presencia de la pre-proteína VP0. Mientras que al realizar este mismo ensayo utlilizando un suero normal de conejo (control negativo) no se observo la presencia de ninguna de estas bandas (Figura 2).
Figura 2.
Western blot. 1: Suero del conejo inoculado; 2: Marcador de peso molecular PegeRuler
(Fermentas); 3: Suero normal de conejo (control negativo).
Desarrollo del test inmunodifusión
Para conseguir las condiciones óptimas de precipitación, en primer lugar se probaron distintas cantidades de salinidad y pH del agar. De todas las condiciones analizadas, la mejor definición de las líneas de precipitación fue conseguida con un gel a pH de 8.6, conteniendo un 1% de agar noble, 9% de acido bórico y 2% de hidróxido de sodio (Figura 3).
Figura 3.
Inmunodifusion en gel de agar: Ag: Antigeno (Virus purificado); S+: Suero
Control Positivo (obtenido a partir de la inoculacion del conejo); S-: Suero
Control Negativo (proveniente de un conejo normal, sin inocular).
Una vez que se hallaron las condiciones óptimas para la precipitación, se estandarizaron las concentraciones de antígeno (virus purificado) y anticuerpos (suero de conejo) Con el fin de obtener una línea de precipitación nítida y equidistante entre el pocillo central y los pocillos periféricos. Una vez puesta a punto la técnica, se analizaron 40 muestras de campo obtenidas a partir del sobrenadante del macerado de 15 abejas en 2 ml de PBS provenientes de distintos colmenares de la provincia de Buenos Aires. Para el análisis de las muestras tomadas a campo, el suero específico anti-SBV fue colocado en el pocillo central y el antígeno control (virus purificado) fue sembrado en tres pocillos exteriores alternados. Las muestras a probar en los fueron sembradas en los tres pocillos restantes. Luego de las 48hs de incubación se procedió a la lectura de los resultados considerando positivas aquellas muestras formaban una línea continua (línea de identidad) con las líneas correspondientes a los pocillos de antígeno control flanqueantes (por ejemplo Figura 4 muestras 1 y 2). Las muestras en que solo aparecieron las líneas de los controles del antígeno, fueron consideradas negativas (Figura 4, muestra 3).
Figura 4.
Resultados obserbados de la Inmunodifusion. Ag: Antigeno (Virus purificado);
S+: Suero Control Positivo (obtenido a partir de la inoculacion del conejo).
Muesta 1 y 2 positivas. Muestra 3 negativa.
Por medio de esta técnica, 4 de las muestras analizadas (10% del total de muestras) resultaron positivas para SBV. Para confirmar los resultados obtenidos con la prueba de inmunodifusión, las 40 muestras de campo fueron analizadas por medio de una RT-PCR (utilizando el mismo protocolo ya descripto en la sección de Materiales y Métodos), obteniéndose una total concordancia en el resultado de ambas técnicas.
Conclusiones
En el presente trabajo se
logro poner a punto una técnica serológica de inmunodifusión doble que permite
la detección del virus SBV a partir de muestras de abejas. También se
compararon diferentes técnicas (RT-PCR y Western Wlot) con el objetivo de
incrementar las herramientas diagnósticas de modo de aumentar la detección
temprana de casos positivos de SBV y poder definir el diagnóstico de esta
enfermedad aún en colmenas asintomáticas De todas las técnicas ensayadas,
Western Blot es sin duda la más laboriosa de las tres debido que requiere
varias horas de desarrollo (48 - 72hs). Mientras que por su parte, si bien la
RT-PCR es una técnica mucho más rápida, su costo es muy elevado en comparación
con las otras técnicas ensayadas.
En cuanto a la técnica de Inmunodifusión en Gel de Agar (IDGA), si bien son
necesarias 48 horas para emitir el diagnóstico, la misma posee una alta
especificidad. Es una técnica muy sencilla y de bajo costo, lo que la convierte
en una técnica apropiada para su implementación en el diagnóstico de esta
enfermedad.
La IDGA ya ha sido adoptada como Gold Standard para el diagnóstico de muchas
enfermedades de interés veterinario, como por ejemplo la Anemia Infecciosa
Equina, la Leucosis Bovina y la Brucelosis. Para el diagnostico de estas
enfermedades, la IDGA ha sido considerada como una técnica moderadamente
sensible pero altamente especifica (con una especificidad en algunos casos
cercana al 100%). En un trabajo previo (con características similares al aquí
desarrollado) realizado por Ribiere et. al (2000)11
con el virus de la Parálisis Crónica de la Abeja se ha demostrado que el
Western Blot es un método eficaz en el diagnóstico de esta infección.
Simultáneamente con el Western Blot también desarrollaron una técnica de IDGA.
Los autores concluyeron que si bien es menos sensible que el Western Blot, la
IDGA es más sencilla, rápida y no requerir grandes cantidades de reactivos. La
comparación de los resultados de ambas técnicas mostró una buena concordancia.
Por todo lo expuesto se podría proponerse a la IDGA como una técnica económica
destinada al screening de un gran número de muestras y utilizar otras
técnicas más laboriosas con la RT-PCR para la confirmación de las muestras
sospechosas.[/body] .
[back]Bibliografía[other standard="other" count="16"]
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