Introducción

Se describe a la transferencia embrionaria (TE) como el proceso de colectar uno o más embriones (EMB), en el inicio de su desarrollo, de una determinada hembra donante (DN) y transferirlos al útero de receptoras fisiológicamente sincronizadas, para dar continuidad a la preñez ⁽⁹. El principal uso en bovinos está relacionado con un mejor aprovechamiento de la vía materna en programas de mejoramiento genético.

La selección genómica está siendo utilizada cada vez más para seleccionar las DN ⁽²⁹ y testear genéticamente a toros superiores ⁽¹⁷; siendo probados por la producción de sus hermanos, en lugar de sus progenies ³⁰.

De esta manera los intervalos generacionales se han acortado a 3,5 años en comparación de los 5,5 de las pruebas de progenie tradicionales ²⁰.

El éxito de la TE se mide por el número de terneros nacidos vivos por DN en un determinado lapso de tiempo, siendo influenciado por factores como el número de ovulaciones, la fertilización y la viabilidad de los EMB¹. Sin embargo, el mayor problema es la variabilidad en la respuesta a los tratamientos superovulatorios (TS), reflejándose en que un 25-30% de vacas no producen EMB ^{(1, 13,18)}.

Existe poca información acerca de los factores genéticos y/o ambientales que afectan la respuesta a los tratamientos superovulatorios (TS) y producción de EMB en razas sintéticas ⁹. Los TS disponibles provocan respuestas extremadamente variables ¹² lo que hace imposible estimar el número de EMB recuperados por DN, por lo que se considera un promedio de 5 EMB transferibles, con extremos de 0 a más de 50 ¹⁴.

Otro de los factores negativos son las altas tasas de ovocitos sin fertilizar, atribuidos a alteraciones de la maduración como consecuencia del desorden bioquímico, metabólico y motriz del oviducto y del útero, afectando el éxito y costo de la técnica ²⁶. En los últimos 15 años, el promedio de EMB transferibles por colecta ha aumentado de 5,5 a 6,7 a nivel mundial, mejorando un 22% ¹⁹.

Los avances, como iniciar los TS en momentos al azar ^{(4, 6, 19)}, el uso de IATF ^{(8, 21)}, y la reducción del número de aplicaciones de FSH ^{(5,10, 36)} han hecho que los protocolos sean más fácil de implementar. Sería interesante saber si esta evolución será capaz, en el futuro, de alterar la variabilidad en las respuestas.

En base a lo expuesto, se propuso comenzar la superovulación (SPO) el día 3 en vez del cuarto día después de la aplicación de ¹⁷⁾ p-estradiol y progesterona, como en los protocolos convencionales.

El objetivo fue evaluar la respuesta a dos protocolos, mediante la evaluación de las estructuras recuperadas a la colecta, utilizando el método no quirúrgico a circuito cerrado, en DN Braford del Noreste Argentino (NEA).

Material y métodos

El experimento se llevó a cabo en cinco cabañas del NEA adheridas al Centro Biotecnológico de Reproducción Bovina (MUNAR y Asociados S.A.). Las DN (n=60) fueron asignadas aleatoriamente (DBCA) a dos tratamientos (T1: n=30 y T2: n=30); en cada programa de TE se trabajó con 12 DN (6 para T1 y 6 para T2), considerando a cada uno como unidad experimental y a cada cabaña como un bloque.

Los TS se iniciaron con el control de las ondas foliculares y del folículo dominante comenzando ambos el día 0 con dispositivos intravaginales de progesterona CIDR® (1,9 g de progesterona, Lab. Zoetis, Argentina) + 100 mg de Progesterona® (Lab. Río de Janeiro, Argentina) + 5 mg de 17p estradiol (Lab. Río de Janeiro, Argentina) (P4+17p-e+DIB).

En T1 el día 3 se comenzó la SPO con FSH Folltropin-V® (400 mg NIH-FSH-Pl; Vetrepharm, Canadá Inc.), 8 aplicaciones totales IM a dosis decrecientes, 2 diarias (320 mg totales). El día 5 además de FSH, se aplicó 150 qg (2 ml) de prostaglandina sintética, Acceleration-D® (Lab. Vabriela, Argentina).

El día 6 se retiró el dispositivo intravaginal (08:00 h) y el día 7 se detectó celo por la mañana (08:00 h) y por la tarde (18:00 h) se aplicó 50 mg (2 ml) de Gonasyn® (Lab. Syntex, Argentina) y se realizó inseminación artificial con dos dosis (pajuelas) de semen, repitiéndose el día 8 (08:00 h) con una sola dosis. El día 14 se llevó a cabo la colecta de EMB. A continuación se esquematizan los protocolos correspondientes.

Las DN se manejaron en piquetes contiguos al sitio donde se aplicaron los TS, con sombra, reparo, así como agua fresca y limpia. Se controló la alimentación en base a pasturas y/o heno de buena calidad y alimento balanceado. La condición corporal de las mismas al inicio del tratamiento no difirió entre grupos ( X ± E.E.= 6,85 ± 0,11, en escala 1-9) ¹⁵.

Se administraron suplementos vitamínicos y minerales por vía SC: 5 ml de Cuprhormone® y 10 ml de Selfos-ADE® (Laboratorio Agro Insumos) 10 días antes del inicio de los TS. Se utilizó semen producido en centros de inseminación certificados por SENASA y CABIA, siendo nuevamente analizado previo a su utilización.

Los EMB fueron obtenidos mediante método no quirúrgico a circuito cerrado de flujo discontinuo. Se emplearon filtros (EM-CON®) estériles con malla de acero inoxidable de 75 ^m de poro para el filtrado del medio de colecta (Flush®, Nutricell).

El volumen de la solución conteniendo los EMB (50 ml) se colocó en placas de Petri cuadriculadas, una vez encontrados fueron transportados a una placa más chica con medio Holding® (Nutricell) a fin de lavarlos antes de la transferencia en fresco o la congelación. Una vez que los EMB fueron lavados se realizó la evaluación morfológica de los mismos mediante el uso de lupa estereoscópica (40x).

Los EMB obtenidos fueron clasificados teniendo en cuenta el estadio de desarrollo y grados de calidad según normas de la International Embryo Transfer Society (IETS) ³¹. Para el diseño experimental estadístico se las frecuencias absolutas y relativas y prueba de Chi2 (p<0,05). Para todos los análisis estadísticos se utilizó software estadístico Infostat ¹¹.

Resultados y discusión

Los resultados de la estadística descriptiva para las variables respuesta se presentan en la Tabla 1.

Los EMB transferibles fueron inferiores a los informados por otros autores, de 7,8 ± 0,3 en razas sintéticas Braford y Brangus y 7,5 ± 0,6 en Bonsmara ²⁵, al igual que en Bonsmara de 7,6 ± 0,7 ³³ y Brangus de 7,7± 1,1 ³⁴; así mismo se mostraron similares a 6,8 ± 0,6 en Simmental ²⁵⁾ y 7,0 ± 1,7 en Braford 35y superiores a 5,7 ± 0,3 25y 5,7 ± 0,6 en Aberdeen Angus 32utilizando 260 mg de Folltropin-V en dosis decrecientes IM cada 12 h, durante 4 días.

Los EMB degenerados obtenidos resultaron inferiores a 3,5 utilizando FSH-P, 3 mg IM dos veces al día por 5 días ³. Respecto a los ovocitos sin fertilizar se mostraron superiores a 3,19 ± 3,09 en Brahman con un protocolo P-24 similar a T2 28. Los EMB congelables fueron inferiores de 6,71 ± 0,44; mientras que los transferibles en fresco similares a 0,93 ± 0,09 en vacas Nelore tratadas con 8 aplicaciones de FSH ²³.

En la Tabla 2 se informa la estadística descriptiva de las variables evaluadas según tratamientos.

Los EMB transferibles fueron similares a los informados de 7,67 ± 0,53, los degenerados superiores de 0,67 ± 0,17; los ovocitos sin fertilizar superiores de 0,33 ± 0,10 y las estructuras totales también superiores de8.7 ± 0,6 utilizando FSH a dosis decrecientes, durante 4 días a partir del cuarto día ²³

Tabla 5 (ayb): Frecuencias absolutas y relativas de estadios embrionarios: mórula en precompactación (m.prec.), mórula, blastocito, blastocito mediano (b. med.) y expandido (b. exp.) de calidad excelente, buena y regular; prueba chi2y p-valor, según T1 y T2 en DN Braford del NEA.

La estadística descriptiva para EMB congelables y transferibles en fresco se presenta en la Tabla 3.

Los EMB congelables fueron superiores a los obtenidos por otros autores, de 3,71 ± 3,85 en Brahman con un protocolo P-24 similar a T2 ²⁸. Los EMB transferibles en fresco resultaron inferiores a los obtenidos de 5.7 ²; 5,6 ²² y 4,4 ±3,87 28, utilizando FSH, eCG y anti-eCG (200 mg FSH, 2000 UI eCG y 2500 UI anti-eCG).

En la Tabla 4 se presentan las frecuencias absolutas y relativas de la prueba de independencia, según tratamiento, para las estructuras recuperadas en la colecta.

Resultados similares a los obtenidos en T1 de EMB transferibles fueron presentados de 64% utilizando Folltropin-V (bajo contenido de LH) ²⁷. Sin embargo, se han informado resultados similares a los logrados en T2, de 37% trabajando con DN de razas carniceras con protocolos similares ⁷, y resultados de 18% cuando utilizaron Folltropin-P (alto contenido de LH) ⁽²⁷.

Sin embargo, se han informado resultados similares a los logrados en T2, de 37% trabajando con DN de razas carniceras con protocolos similares ⁷, y resultados de 18% cuando utilizaron Folltro- pin-P (alto contenido de LH) ²⁷.

Los EMB degenerados en ambos casos fueron inferiores a lo informado, de 28 y 13%; mientras que en ovocitos sin fertilizar obtuvieron 8% y 68%, utilizando Folltropin-V (bajo contenido de LH) y con Folltropin-P (alto contenido de LH) superiores a lo logrado en este ensayo ²⁷.

Por último se presentan los resultados de la prueba de independencia para calidad y estadios embrionarios (Tabla 5).

El estadio mórula fue superior de 20 y 31%, los blastocitos similares a 40 y 54% en Holstein usando (Folltropin®) con y sin tratamiento de somatotrofina bovina (bST), respectivamente ²⁴. Otros trabajos lograron obtener una mayor cantidad de EMB en los estadios de mórula, blastocito temprano y blastocito con un 37; 30 y 23%, respectivamente, y en menor grado blastocitos expandidos con un 6% ¹⁶.

Así también se reporta predominancia de los estadios mórula, blastocito temprano y blastocito con un 32,9; 26,4 y 19,1% respectivamente, y en menor grado 0,9% de blastocitos expandidos y 0,4% de blastocitos eclosionados ⁽²⁶, siguiendo los mismos patrones porcentuales que el presente trabajo.

Los EMB de calidad excelente se presentaron con una frecuencia similar a 85 y 84%, los de buena calidad fueron inferiores a 15% y los de calidad regular también inferiores de 16% en DN superovuladas (con Folltropin®), similar a T2, con y sin tratamiento con somatotrofina bovina (bST)²⁴.

Concluimos que bajo las condiciones en las que se realizó el ensayo, el uso anticipado de FSH en los protocolos de SPO en DN Braford del NEA no permitió mejorar la respuesta super-ovulatoria evaluada mediante el total de estructuras y/o la calidad de los EMB recuperados en la colecta, respec­ to a los tratamientos convencionales. Sin embargo, puede ser utilizado cuando por razones estratégicas (agenda, infraestructura, caminos, clima, disponibilidad de personal) sea necesario, sin afectar la producción de EMB, acortando los tratamientos convencionales.