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Introducción
La utilización de dispositivos intravaginales (DIV) de liberación de progesterona (P4) para la sincronización de celos en ovinos, comenzó a mediados de la década de 1980 como una alternativa a las esponjas intravaginales 7. Estudios realizados en Brasil y Uruguay dan cuenta de DIV conteniendo 300 mg de P4, utilizados hasta en tres oportunidades con porcentajes de celos y ovulación entre 80% y 100% en pequeños rumiantes (6, 8-11).
Las hembras con DIV de primero y segundo uso tuvieron concentraciones séricas de P4superiores a los 2 ng/ml 10,11. Sin embargo, las concentraciones séricas fueron inferiores a 2 ng/ml en animales con DIV de tercer uso (11, lo que podría promover el crecimiento excesivo y la persistencia del folículo de mayor tamaño (2, 12).
No existe información sobre las concentraciones de P4 alcanzadas con DIV que contengan menor concentración hormonal inicial ni resultados de estudios farmaco-cinéticos mediante análisis no compartimental de las concentraciones séricas de P4 luego de la colocación de DIV nuevos o usados en ovejas.
El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la utilización y reutilización de DIV con una concentración inicial de 160 mg de P4.
Material y métodos
Animales
El estudio se realizó durante la estación reproductiva en el predio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina, de acuerdo con las recomendaciones internacionales especificadas en la guía para el cuidado y uso de los animales de laboratorio 3y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de FCV-UNLP.
Se utilizaron hembras ovinas % Texel (n=20) con una condición corporal entre 2,5 y 3,0 (1 emaciada a 5 gorda), las cuales fueron alimentadas con heno de alfalfa y balanceado comercial, con acceso ad-libitum al agua de bebida. Se utilizaron DIV nuevos y usados con 300 mg de P4 y con 160 mg P4.
Todos los DIV usados fueron colocados, previo al inicio del experimento, en ovejas durante 7 días para que se consuma el contenido de P4 equivalente a un solo uso. Luego del retiro de los DIV, éstos fueron lavados, sanitarizados y mantenidos en un lugar seco y oscuro hasta su posterior reutilización 10.
Siete días previos al inicio del experimento, todas las hembras recibieron una dosis de 75 μg de cloprostenol, el cual se repitió al día 1 con la finalidad de provocar la luteólisis y asegurar la ausencia de P4 endógena durante el experimento. El día 0 correspondió a la colocación del DIV (Figura 2.1). Las ovejas fueron asignadas en forma aleatoria a 5 grupos experimentales: CON: grupo control (n=4) animales sin DIV; CRON: Grupo DIV 160 mg P4 de 1° uso (n=4), animales con DIV nuevo; CROU: Grupo DIV 160 mg P42° uso (n=4), animales con DIV usado; CIDN: Grupo DIV 300 mg de P4 de 1° uso (n=4), animales con DIV nuevo; CIDU: Grupo DIV 300 mg de P4de 2° uso: (n=4), animales con DIV usado.
Siete días más tarde se retiraron los DIV y al día 18 se aplicó una dosis de 75 μg de cloprostenol para inducir la luteólisis y asegurar la ausencia de P4 endógena. En el día 19 se repitió el experimento.
Determinación de progesterona
En ambas réplicas experimentales, se recolectaron muestras de sangre por venopunción yugular a la hora 0 (antes de la colocación del DIV), a las 12, 24, 36, 48,72, 84, 96, 108, 120, 136, 144, 156 y 168 h luego del inicio de los tratamientos. Además, se realizaron dos ventanas de sangrado, una primera ventana a las 2, 4, 6, 8 y 10 h; y otra a las 170, 172, 174, 176, y 178 h del inicio de cada réplica.
Las muestras sanguíneas se centrifugaron durante 10 min a 2000 rpm y los sueros se almacenaron a -20°C hasta su análisis. Las determinaciones de P4 se realiza ron por medio de la técnica de radio-inmuno-ensayo a través de un kit comercial. Los valores de control bajo fueron 0,5, 0,7 y 0,8 ng/ml y los valores de control alto fueron 5,0, 4,5 y 7,7 ng/ml. El coeficiente de variación (CV) intraensayo fue del 9,4 % y el CV inter-ensayo fue del 11,6 % para el pool bajo y para el pool alto fue del 4,2 % y del 6,3 %, respectivamente.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como cuadrados medios mínimos ± error estándar. La significancia estadís tica fue fijada en P<0,05. La oveja fue considerada la unidad experimental. Las concentraciones séricas de P4 (ng/ml) fueron analizadas mediante análisis de varianza utilizando el procedimiento MIXED de SAS® como mediciones repetidas en el tiempo 8. El modelo incluyó el efecto aleatorio de la oveja y el efecto fijo del tiempo (día del tratamiento), tratamiento (CON, CRON, CIDN, CROU, CIDU) y la interacción de tiempo por tratamiento.
El análisis farmaco-cinético de los datos de concentración de P4 en función del tiempo obtenidos, se realizó mediante el programa Phoenix. Los parámetros farmacocinéticos analizados fueron la concentración máxima observada (CM máx ), el tiempo de ocurrencia de la concentración máxima (T máx ), el área bajo la curva de concentración en función del tiempo desde el día 0 hasta el día 7 (ABC0-7d), el ABC extrapolado al infinito (ABC0-∞)y el tiempo medio de residencia de la partícula en el sistema (TMR).
El análisis estadístico de los resultados del estudio farmacocinético se realizó mediante análisis de varianza utilizando el procedimiento GLM de SAS®. El modelo incluyó el efecto fijo de tratamiento (CON, CRON, CIDN, CROU, CIDU). El nivel de significancia fue fijado en P<0,05.
Resultados
Al inicio de cada réplica, las concentraciones séricas de P4 en todos los grupos experimentales fueron menores a 1 ng/ml, confirmando la ausencia de cuerpo lúteo durante el experimento (Figuras 1 y 2). Luego de la inserción de los DIV, el T máx fue alcanzado entre las 4,5 y 15,7 h, sin presentar diferencias significativas entre grupos (Tabla 1; p>0,05). La Cmaxalcanzada fue similar entre CIDN y CRON (Tabla 1; p>0,05). En cambio, el grupo CIDU tuvo mayor concentración sérica que el grupo CROU (Tabla 1; p<0,05).
Así mismo, las hembras del grupo CROU presentaron concentraciones séricas menores a 2 ng/ml a partir de las 48 h de colocado el DIV (Figura 2). El TMR fue similar entre DIV nuevos y entre DIV nuevos vs. usados (Tabla 1; p>0,05). En cambio, al comparar entre los DIV usados, el TMR fue mayor en CIDU que en CROU (Tabla 1; p<0,05).
Figura 1 Concentraciones séricas de P4 (ng/ml) en ovejas luego de la inserción de un DIV nuevo. CON: grupo control; CIDN: DIV 300 mg de P4 de 1° uso, CRON: DIV 160 mg P4 1° uso.
Figura 2 Concentraciones séricas de P4(ng/ml) en ovejas luego de la inserción de un DIV usado (cuadrados medios mínimos ± error estándar). CON: sin DIV; CIDU: DIV 300 mg P4 2° uso y CROU: DIV 160 mg P4 2° uso.
El análisis farmacocinético no compartimental determinó que el ABC0-7d fue similar entre grupos CIDN y CRON (p: 0,05; Tabla 1). Asímismo, los grupos CIDU y CROU presentaron diferencias significativas entre sí (p<0,05) y con los grupos con DIV nuevos (p<0,05; Tabla 1).En términos absolutos, el CIDU liberó un 41,20% menos de P4 que el CIDN (Figura 2.3), y el CROU liberó un 72,5% menos de P4 que CRON (Figura 2.3).
A pesar de que no hubo diferencias significativas en la liberación de P4 entre los CIDN y CRON, el CROU liberó un 68,5% menos de P4que el CIDU (Figura 2.3). Al analizarse el ABC0-7d se tuvieron resultados similares a los correspondientes al ABC0-7d.
Tabla 1 Parámetros farmacocinéticos de las concentraciones séricas de P4 tras la aplicación de DIV nuevo y usado (cuadrado medio mínimo ± error estándar) en ovejas.
| grupo | 81.ABC0-7 82. (ng h/ml) | 83.ABC0-∞ 84. (ng h/ml) | 85.Cmax (ng/ml) | 86.T 87. (h)x | 88.Tmax 89. (h) |
|---|---|---|---|---|---|
| CIDN | 92.980,73±88,19a | 93.982,37±88,53a | 94.10,80±1,03a | 95.7,00±1,06 | 96.75,64±2,49 |
| CRON | 99.822,93±103,54a | 100.830,56±103,12a | 101.10,18±1a | 102.4,50±0,82 | 103.68,85±2,24 |
| CIDU | 106.586,48±66,39bc | 107.589,42±65,63b,c | 108.5,51±0,86b,c | 109.15,75±8,16 | 110.81,22±1,55c |
| CROU | 113.226,15±33,16b,d | 114.231,00±36,12b,d | 115.3,48±0,40b,d | 116.6,25±,571 | 117.71,04±1,74d |
ABC0-7: área bajo la curva concentración hasta los 7 d. ABC0-m: área bajo la curva concentración extrapolada al infinito. Cmax: concentración sérica máxima. Tmax: tiempo a la concentración máxima. TMR: tiempo medio de residencia. Valores en una columna con diferentes superíndices, difieren al p<0.05.
Discusión
En nuestro conocimiento, este es el primer trabajo que realiza un estudio sobre la farmacocinética mediante análisis no compartimental de las concentraciones séricas de P4 en DIV nuevos o usados. De los DIV con 160 mg P4 utilizados, sólo las ovejas del grupo CRON presentaron concentraciones de P4>2 ng/ml durante el período de 7 días estudiados mientras que el grupo CROU presentó concentraciones sub-luteales de P4(<2 ng/ml) a partir de las 48 h de colocado el DIV.
Estas concentraciones séricas hormonales, posiblemente promoviesen el crecimiento excesivo y la persistencia del folículo de mayor tamaño, así como el envejecimiento del folículo ovulatorio 3,12. Si bien algunos trabajos previos estudiaron los perfiles séricos de P4 con DIV 300 mg de P4 nuevos y usados, estos estudios no incluyeron los estudios farmacocinéticos mediante análisis no compartimental del ABC0-7, el ABC0-∞, Cmax alcanzada, y el TMP de P4.
Los resultados obtenidos a partir de las concentraciones séricas de P4 de los grupos CIDN y CIDU son coincidentes con trabajos previos 1,5 11. Mientras que en éste y otros estudios previos las concentraciones séricas de P4 alcanzadas con CIDN en ovejas fueron similares 12, en nuestro estudio las concentraciones alcanzadas por CIDU fueron más bajas 12. Los estudios de farmacocinética no compartimental realizados en este trabajo no están disponibles para las labores previas y por lo tanto no se puede realizar una comparación.
En base a los resultados de este trabajo, la reutilización de DIV con 160 mg de P4 no sería efectiva ya que las concentraciones séricas de P4 serían un tercio de las producidas en hembras con un DIV nuevo y con valores < 2 ng/ml durante un periodo de tratamiento de 7 días, lo que afectaría la dinámica y el crecimiento folicular, causando un excesivo desarrollo y persistencia en el tiempo de los folículos y posiblemente disminuyendo la fertilidad.
