Introducción

La pigmentación de los hongos que deterioran el papel se debe a la síntesis de varios tipos de pigmentos y moléculas cromóforas como carotenoides, melaninas, flavinas, fenazinas, quinonas, monascinas, violaceína e índigo (Melo et al, 2019; Rao et al, 2017). Aunque el rol de la mayoría de estos pigmentos en la biología de sus productores sigue siendo desconocido, se sabe que muchos de ellos pueden acumularse en esporas, micelio y/o difundir al sustrato que colonizan (^{Gmoser et al., 2017}; Mallo et al., 2017). Entre estos pigmentos fúngicos, las melaninas son los más problemáticos para los documentos en papel y las obras de arte, no solo por su coloración oscura, alta frecuencia y estabilidad química, sino también porque son los más difíciles de remover de la superficie del papel sin afectarlo (Melo, 2017).

Las melaninas también son biológicamente más relevantes que otros pigmentos fúngicos porque brindan protección a los hongos contra el estrés térmico, la radiación y la desecación, condiciones ambientales que son características en los repositorios de los museos que resguardan documentos patrimoniales en papel. Es conocido, que las melaninas son importantes para la supervivencia y la viabilidad de los propágulos de muchos hongos negros (Bell & Wheeler, 1986; Saparrat et al., 2009). La naturaleza recalcitrante de las melaninas, su inmovilización en la pared de los hongos negros que colonizan papel, así como su asociación con diferentes componentes de la matriz celulósica del sustrato condujo a considerar a estos pigmentos como posibles agentes etiológicos del deterioro estético de libros y otros documentos en papel. Además, ellas han sido consideradas responsables de la generación de manchas coloreadas en el papel que comúnmente se denominan manchas foxing (https://www.si.edu/ mci/english/learn_more/taking_care/mnm.html; Melo, 2017). Por lo tanto, comprender cómo los hongos negros, que sintetizan las melaninas, pueden contribuir al deterioro estético del papel, es clave para mejorar la durabilidad del patrimonio cultural en este tipo de soporte, buscando desarrollar estrategias sustentables de restauración que sean efectivas y/o que puedan minimizar la colonización del papel con hongos pigmentados y así evitar uno de los factores adjudicados al proceso de foxing.

El objetivo de este trabajo es brindar un panorama actualizado del estado de arte de las melaninas sintetizadas por hongos que colonizan papel, su localización en estructuras fúngicas específicas y su posible rol en el deterioro estético del papel o de otros materiales fabricados a base de papel que forman parte de varios bienes patrimoniales. Esta información es fundamental para establecer estrategias de manejo para la preservación y conservación de documentos históricos en papel que están expuestos a hongos negros celulolíticos.

Materiales y Métodos

Se realizó una búsqueda bibliográfica de la información actualizada y disponible sobre los pigmentos oscuros que sintetizan diferentes hongos negros que deterioran soporte celulósico, en especial documentos en papel. Para ello, se consultaron las bases de datos “Google académico” (https://scholar.google.com), “Scopus” (https:// www.scopus.com) y “Scielo” (https://scielo.org/ es) en busca de publicaciones referidas a estudios micológicos en obras antiguas de interés patrimonial en soporte papel, que han sido atacadas por hongos melanizantes. Se ha indagado acerca de los tipos de melaninas encontrados en dichos estudios y su localización en las estructuras fúngicas

Por otro lado, se consultó http://www.mycobank. org/ con el objeto de verificar la nomenclatura de los principales hongos que sintetizan melaninas. Se analizaron los resultados obtenidos a partir del relevamiento en 74 trabajos, siendo, la mayoría de ellos de reciente publicación en revistas nacionales e internacionales.

Resultados

Hongos negros asociados al deterioro del patrimonio cultural del papel

De acuerdo con el concepto ecológico de Boddy e Hiscox (2016), la composición y la estructura de la micobiota que deteriora el papel está condicionada por los factores ambientales locales a los que está expuesto este sustrato susceptible al ataque de hongos celulolíticos, incluidas sus variaciones estacionales, y el conjunto de diásporas disponibles. Específicamente, las especies queD. S. Nitiu et al. - Pigmentos oscuros fúngicos asociados al deterioro de papel potencialmente pueden colonizar al papel, llegan del ambiente inmediato como esporas u otros propágulos y se establecen inicialmente sobre su superficie y en muchos casos colonizan la matriz compleja de su estructura. El éxito de la colonización que cada hongo tiene en este tipo de sustrato biodegradable depende también de la capacidad fúngica para persistir en dicho sustrato y poder desarrollar estructuras de reproducción y/o dispersión. Asimismo, ello está condicionado por el espectro de compuestos carbonados que puede utilizar cada hongo, así como por la tasa de crecimiento y su habilidad para aprovechar compuestos integrantes del sustrato a través de la síntesis de diferentes clases de enzimas, lo que a la vez depende del tipo de estrategia que cada hongo utiliza para hacer frente al entorno que habita (Boddy e Hiscox, 2016).

Varios hongos negros deterioran el patrimonio cultural en soporte papel a través de su actividad metabólica sobre la celulosa y otros componentes no celulósicos del papel, como aglutinantes, rellenos, aprestos y adhesivos (Bhardwaj & Bhatnagar, 2002). Estos hongos generan alteraciones en la matriz del papel debido a su capacidad para atacar los componentes del papel y/o generar efectos estéticos deletéreos en el soporte debido a la síntesis de pigmentos oscuros. Sin embargo, la característica distintiva y común a todos estos hongos negros es la presencia de melanina en sus paredes celulares y/o en su entorno inmediato, que le proporciona el color oscuro a sus esporas e hifas (Bárcena et al., 2015; Medina et al., 2018). Se cree que esta característica fenotípica convergente de estos hongos está relacionada principalmente con adaptaciones a condiciones ambientales adversas, ya que, como se mencionó anteriormente, la producción de melanina se considera necesaria para la protección contra el estrés ambiental. De hecho, se sabe que, al crecer en condiciones de estrés, muchos hongos sintetizan varios metabolitos secundarios, entre ellos la melanina (^{Calvo et al., 2002}), cuya producción se favorece en un crecimiento poco óptimo. Es probable que este pigmento oscuro confiera una ventaja de supervivencia al proteger a los hongos contra diferentes factores limitantes como los rayos UV, la radiación solar y el bajo potencial hídrico (desecación) (Dadachova et al., 2007; Toledo et al, 2017).

Asimismo, varios hongos negros que colonizan papel pueden ser agentes etiológicos de enfermedades en humanos como feohifomicosis, infecciones cutáneas, alergias y otras enfermedades respiratorias graves (Ferrandez-Pulido et al., 2019), hecho que aumenta el impacto negativo que pueden tener estos hongos. Además, la manipulación de objetos de papel contaminados con estos hongos puede constituir un grave riesgo para la salud, porque muchos de ellos pueden ser patógenos y/o toxicogénicos, incluso si ya están muertos (Pinheiro et al., 2011). En concreto, muchos hongos disponibles como esporas oscuras en el aire, como los pertenecientes a los géneros Aspergillus, Cladosporium, Scopulariopsis y Rhizopus, han sido registrados en altas concentraciones en varias instituciones que conservan documentos patrimoniales y, por tanto, son una posible causa de enfermedades respiratorias y alergias (Lacey & West, 2006; Mesquita et al., 2009).

Fig. 1: Presencia y desarrollo de hongos que sintetizan melaninas en papel. A: Deterioro estético causado por la actividad de hongos pigmentados. B: Observación directa de desarrollo de Chaetomium sp. en papel de abacá. 

Algunas estructuras pigmentadas que están asociadas con el micofilm desarrollado en papel corresponden a esporas y otras diásporas que contribuyen a la dispersión de los hongos que las diferencian. Asimismo, varias estructuras de coloración oscura de origen vegetativo, como hifas monilioides y esclerocios, así como también estructuras de reproducción sexual, como ascomas, cleistotecios, o peritecios, se inmovilizan sobre el papel (Fig. 1.), sin embargo, varios de estos hongos no se han reportado ampliamente en este tipo de soporte debido a la dificultad para detectarlos o aislarlos en cultivo (Quan et al., 2019). Por lo tanto, el grupo denominado “hongos pigmentados oscuros o melanizados” es un ensamble amplio que incluye a representantes filamentosos negros, levaduras negras, hongos meristemáticos y hongos pigmentados microcoloniales (Staley et al., 1982). Todos estos hongos comparten características macro y / o micromorfológicas relacionadas con su pigmentación oscura típica y también se denominan hongos dematiáceos (Ellis, 1971, 1976). Las coloraciones de estos hongos pueden variar porque las melaninas fúngicas pueden ser de color marrón, verde, púrpura o negra, lo que es dependiente de su estructura química (^{Frandsen et al., 2016}; Toledo et al., 2017). Además, este grupo fenotípico incluye representantes de diferentes clados filogenéticos (Ruibal et al.,2008). Los hongos negros que colonizan papel pertenecen en su mayoría al phylum Ascomycota, incluyendo específicamente los ubicados en los órdenes Capnodiales (Cladosporiaceae), Dothideales (Dothioraceae), Eurotiales (Aspergillaceae), Hypocreales (Hypocreaceae, Nectriaceae, Stachybotryaceae), Microascales (Micropoascaceae), Pleosporales (Pleosporaceae, Didymellaceae y otros insertae sedis) y Sordariales (Chaetomiaceae). Estos, presentan una baja tasa de crecimiento, un comportamiento de tipo xerofílico y una estrategia ecológica de vida condicionada por el estrés. Sin embargo, también existen otros hongos que colonizan el papel que producen esporas oscuras, pero son menos frecuentes, como algunas especies de crecimiento rápido del phylum Mucoromycota (Mucorales) y algunas de Basidiomycota (Polyporales). El conocimiento actual de los hongos negros y de otros hongos que sintetizan melaninas asociadas con papel, ha sido documentado en diversos trabajos de investigación nacionales e internacionales sobre patrimonio culturalque se resume en la Tabla 1.

Tabla 1: Hongos que sintetizan melaninas, antecedentes de sustrato y fuente de aislamiento en los que han sido registrados por la bibliografía, tipos de melaninas, localización y referencia bibliográfica. Referencias: *a, phylum Ascomycota; b, phylum Basidiomycota; c. phylum Mucoromycota.  

Los hongos colonizan el papel ya sea penetrando la matriz de microfibrillas o creciendo superficialmente para obtener los nutrientes disponibles. Pueden ser incluso utilizados como vector/soporte para la diferenciación de estructuras reproductivas y como vehículo de dispersión de sus propágulos (Pinzari & Montanari, 2011; Szczepanowska & Cavaliere, 2012). Varios de estos hongos negros que crecen lentamente sobre el papel se caracterizan por una baja capacidad competitiva y una naturaleza oligotrófica. Esto se ha relacionado con la conservación de energía y la limitación de ciertos nutrientes, necesarios para la supervivencia en este tipo de sustrato, que tiene escaso aporte de nutrientes y bajo nivel de nitrógeno. Sin embargo, algunos hongos tienen la capacidad de reciclar nitrógeno (^{Franco et al., 2018}). Algunos otros, como Aureobasidium pullulans y especies de Cladosporium, pueden obtener nutrientes del polvo, de gases atmosféricos y compuestos volátiles, prevalecen donde la humedad relativa excede el 75%, y no necesariamente utilizan al papel que están colonizando como sustrato (Wainwright et al., 1993).

Las hifas de hongos celulolíticos que colonizan papel ejercen un efecto mecánico y generan un microambiente en la trama del papel que facilita el acceso de otros microorganismos que no son celulolíticos. Entre ellos, los hongos mucoráceos y diferentes bacterias pueden a la vez ser formadores de biopelículas (Calvo et al., 2017). Este proceso secuencial se ve favorecido por la disponibilidad extracelular de compuestos orgánicos solubles generados principalmente por la actividad metabólica de los hongos celulolíticos y por una mayor retención de humedad en el soporte atacado (Mallo et al., 2017). Sin embargo, cuando los factores ambientales a que está expuesto el papel no son apropiados, varios hongos que lo deterioran pueden reducir su actividad metabólica y activar la diferenciación de estructuras reproductivas, generando estructuras de reposo pigmentadas, o eventualmente morir. Si las condiciones vuelven a ser favorables, se puede reactivar el metabolismo de los hongos activando la germinación de las esporas existentes u otras estructuras disponibles en el sustrato, y seguir deteriorando al papel. Sin embargo, algunos hongos, como los xerotolerantes, pueden vivir bajo estrés mediante la activación de varios mecanismos que les permiten crecer en tales condiciones. En este sentido, la desecación, la disminución en la actividad agua asociada al papel o los altos niveles de luz a los que puede estar expuesto durante el almacenamiento, consiguen provocar que algunos hongos que lo están colonizando sinteticen pigmentos. Este cambio en la coloración de las colonias fúngicas que deterioran papel puede ser también desencadenado como respuesta a los tratamientos utilizados para controlar el deterioro del papel y/o a la aplicación de radiación gamma o agentes químicos blanqueadores (Pavón Flores, 1976; Toledo et al., 2017). Llorente et al. (2012) reportaron que la pigmentación asociada a Cladosporium cladosporioides, un hongo que habitualmente deteriora papel, es debida a una 1,8-dihidroxinaftaleno (DHN)-melanina, la que incrementa su intensidad bajo el estrés impuesto por fungicidas. Dado que estos hongos deterioran con frecuencia el papel y son representantes típicos en el aire interior de bibliotecas, archivos y museos (Nitiu et al.,2020; Borrego & Herrera Barrios, 2021), el conocimiento sobre los procesos de melanización resulta clave a la hora de tomar decisiones en base a su erradicación, e identificar si pueden ser eliminados mediante el control de las condiciones ambientales o si es necesario utilizar otras estrategias sustentables de conservación.

Las melaninas son un grupo de polímeros aromáticos responsables de la coloración oscura de varias manchas en el papel, incluyendo (entre otros factores) aquellas relativas al foxing. Debido a su insolubilidad en una variedad de disolventes polares y orgánicos y a su naturaleza recalcitrante, las melaninas se encuentran entre los pigmentos más difíciles de eliminar del papel (Toledo et al., 2017). Además, algunos hongos como las especies del género Aspergillus, (incluido A. fumigatus, un típico representante con hifas hialinas que deteriora papel), también pueden sintetizar melaninas solubles (piomelanina). Específicamente, A. fumigatus es capaz de sintetizar varios tipos de melaninas, incluida una melanina tipo DHN insoluble en agua, que está presente predominantemente en conidios (Fig. 2), y una melanina alternativa sintetizada extracelularmente, que puede generar la pigmentación del micelio a causa de su acumulación en la superficie de las hifas (Schmaler-Ripcke et al., 2009). Por lo tanto, la coloración fúngica del papel puede ser un factor relevante en el deterioro, donde la naturaleza del pigmento responsable condiciona la elección de estrategias adecuadas de restauración, debido a que los mismos hongos pueden producir melaninas solubles e insolubles en agua. Esto es compatible con los resultados reportados en experimentos con agentes blanqueadores para reducir la coloración de diferentes papeles deteriorados y sus manchas asociadas (Mesquita et al., 2009). Aunque la mayoría de los hongos que tienen estructuras oscuras asociadas con el papel son generalmente tolerantes al estrés, los hongos ruderales que también tienen melaninas en sus esporas, como las especies del género Rhizopus, muestran una colonización secundaria del sustrato y también lo deterioran.

Melaninas: los pigmentos oscuros comunes de los hongos negros

Las melaninas están compuestas de estructuras alifáticas y aromáticas de tipo indol o fenol y son sintetizadas por una amplia gama de organismos (Toledo et al., 2017). Estos pigmentos, que son metabolitos secundarios, pueden tener diferente coloración y también pueden ser heterogéneos en cuanto a su organización estructural, composición y función (Nitiu et al., 2020). Sin embargo, todos estos pigmentos tienen propiedades fisicoquímicas similares, que incluyen resistencia a la hidrólisis ácida, estructura amorfa y polidispersa, naturaleza polimérica, carga neta negativa y una estructura radicalaria estable (Lee et al., 2019; Smith & Casadevall, 2019). Todas las melaninas, excepto la piomelanina, son insolubles en agua y disolventes orgánicos, siendo solo solubilizadas en solventes alcalinos. Estas propiedades fisicoquímicas explican los roles multifuncionales de los pigmentos oscuros que les permiten a los hongos negros adaptarse a diversas condiciones ambientales.

Fig. 2: Modelos que representan la arquitectura de la envoltura celular y la organización y composición de la pared celular en el conidio A: de diferentes especies de Aspergillus incluyendo la estructura de la hifa. B: estructura de la hifa de Aspergillus fumigatus (adaptado de Erwig & Gow, 2016). 

La melanina podría proporcionar a los hongos negros un escudo físico y químico extracelular contra factores estresantes o factores dentro del papel o su entorno. Esta localización podría ayudarlos a prevenir la degradación física, química y biológica (^{Gessler et al., 2014}), así como a prevenir la desecación del micelio, esporas u otros propágulos y por lo tanto promover la supervivencia fúngica en condiciones limitantes (Tudor et al., 2012). Aunque la melanina se localiza mayoritariamente en la pared celular, también se ha detectado en estructuras intracelulares de varios hongos negros, así como en ambientes libres de hongos. Por lo tanto, la síntesis de estos pigmentos se puede desencadenar tanto a nivel intracelular como extracelular. Algunas melaninas heterogéneas se sintetizan estrictamente en el entorno extracelular del hongo, por polimerización de fenoles de origen fúngico como otros de distinta procedencia. Éstos se encuentran disponibles en el medio, por la formación de complejos involucrando productos de oxidación de sustancias aromáticas con proteínas, o por la vía de degradación de tirosina como en el caso de la piomelanina (Bell & Wheeler, 1986; Smith & Casadevall, 2019). Por otro lado, existe también evidencia de la generación de gránulos de melaninas en vesículas tipo melanosomas o cuerpos multivesiculares. Hongos como Cryptococcus neoformans y Fonsecaea pedrosoi sintetizan melanina en melanosomas dentro de su citoplasma y luego la exportan a la pared celular dentro de vesículas y cuerpos multivesiculares. La externalización de esta melanina conduce a su acumulación en la trama de las paredes celulares de estos hongos o a su entorno, interaccionando a través de varias reacciones con la quitina y el quitosano u otra molécula componente de pared, lo que lleva a su anclaje. En este sentido, se ha reportado la presencia de melanina, polisacáridos y enzimas involucradas en la síntesis de melanina como las lacasas (enzimas que oxidan estructuras químicas que contienen grupos fenólicos) en vesículas extracelulares o exosomas de hongos.

Éstas son secretadas y capaces de generar melaninas con un mayor grado de polimerización formando gránulos de melanina más grandes que sus fuentes de partida. Así mismo pueden también, facilitar su inmovilización en la pared celular, formando densas capas concéntricas de melanina depositada, que se ha correlacionado con la extensión de la melanización de las estructuras.

Dado que los exosomas también pueden estar representados por estructuras con dos unidades de membrana, los constituyentes lipidíeos de sus membranas internas parecen ser la fuente de los componentes alifáticos detectados en la melanina depositada en la pared celular. Además, se ha informado sobre la restructuración de la melanina en la pared celular fúngica, incluida la reconfiguración de los gránulos de melanina, aunque aún dicho proceso no ha sido caracterizado en su totalidad (Camacho et al., 2019). Chrissian et al, (2020) reportaron que la composición y arquitectura molecular de la pared celular de los hongos negros del género Cryptococcus son características críticas para el anclaje y disposición de sus melaninas. Dado que los gránulos de melanina en la pared celular parecen ser dinámicos, reorganizables y reestructurados, se espera que futuras estrategias sean desarrolladas a fin lograr la remoción de estos pigmentos del papel que contenga hifas melanizadas. Sin embargo, hasta donde se sabe, no existen datos disponibles sobre la eliminación de estas hifas de matrices celulósicas sin afectar notoriamente la estructura del papel. Por lo tanto, la síntesis de melaninas en hongos que colonizan papel puede minimizarse controlando las condiciones ambientales y sus procesos metabólicos. Además, dado que la acumulación de las melaninas en la pared celular de muchos hongos negros también se puede prevenir por condiciones fisiológicas (Walker et al, 2010), se debe porizar la optimización de los procedimientos para eliminar los gránulos de melanina sin causar efectos severos a nivel de la trama y estructura del papel antes que alguna intervención sea aplicada. Dado que a la vez la mayoría de las melaninas fúngicas se ubican en las paredes celulares de los hongos que deterioran el papel, esto dificulta aún más el éxito del procedimiento de restauración (Bárcena et al., 2018). Tampoco, en la mayoría de los casos, se conoce la estructura exacta de las melaninas que estos hongos sintetizan. No obstante, las tecnologías avanzadas de resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía electrónica pueden proporcionar información sobre la estructura de las melaninas (Nosanchuk et al., 2015). Mediante espectroscopia 1D-RMN y correlaciones HSQC 1H-13C, Sun et al, (2016) identificaron regiones de naturaleza alifática y aromática en la melanina extracelular de Auricularia aurícula, siendo estimada su fórmula molecular condensada como [C18 (OR)3H7O4N2]n. Aunque la estructura de las melaninas aumenta en complejidad a lo largo de la ontogenia fúngica, las mismas cuentan con enlaces covalentes que contienen carbono entre pirroles y N-acetilglucosaminas derivadas de quitina o glicéridos provenientes de los lípidos de membrana. Los datos de RMN en estado sólido respaldan un apilamiento de unidades aromáticas basadas en unas de tipoindol mediante enlaces covalentes, que genera un material estructurado en ciertas regiones pero que globalmente es amorfo (Nosanchuk et al., 2015). Desafortunadamente, estos datos se obtuvieron solo para las melaninas de Cryptococcus neoformans. Beltrán-García et al, (2014) informaron también, que la melanina asociada al micelio de Mycosphaerella fijiensis está constituida por 50 unidades de 1,8-DHN. Por todo lo expuesto se desprende que un análisis más detallado mediante metodologías de punta como RMN en estado sólido y técnicas físicas y de imágenes deberían llevarse a cabo utilizando las melaninas de los hongos que deterioran papel con mayor frecuencia, ya que proporcionará las bases para caracterizar la estructura de sus melaninas tanto si están asociadas a la pared celular fúngica y/o a la matriz del papel que están colonizando. Dicha información será útil para contribuir al desarrollo de estrategias para eliminar los pigmentos oscuros que deterioran estéticamente al papel.

Conclusiones

Este análisis bibliográfico intenta brindar un panorama actualizado del estado de arte de las melaninas sintetizadas por hongos que colonizan y deterioran papel, su localización en las estructuras fúngicas, y su contribución en el deterioro de matrices celulósicas.

Puesto que las melaninas sintetizadas por hongos pueden deteriorar invaluables obras de patrimonio cultural, el conocimiento de estos pigmentos oscuros es fundamental para mejorar las estrategias de conservación de documentos históricos basados en soportes celulósicos. Las propiedades fisicoquímicas de las melaninas son la base para desarrollar tácticas promisorias para la conservación óptima de colecciones documentales y su restauración.

Es conocido que las melaninas mejoran la tolerancia de los hongos que colonizan papel a las condiciones ambientales establecidas en los reservorios de conservación. Ellas funcionan a modo de un escudo protector contra una amplia variedad de agentes estresantes del ambiente, como la exposición a agentes químicos que se utilizan para eliminar manchas en papel. El conocimiento de estos pigmentos oscuros es fundamental para mejorar las estrategias de conservación de documentos históricos y obras de arte en papel. Dadas las características de las melaninas y su susceptibilidad a solubilizarse en condiciones alcalinas, éste podría ser su talón de Aquiles y la base para el diseño de procedimientos de restauración considerando tratamientos alcalinos.

Contribución de los Autores

Todos los autores han realizado conjuntamente y a partes iguales la colecta de datos, su interpretación y redacción del manuscrito.