Introducción
El manglar es uno de los ecosistemas costeros que brinda más servicios ambientales y a la vez uno de los más amenazados a nivel mundial 19. Su correcto funcionamiento depende de la actividad de varias especies que lo habitan. En el caso de los manglares en los que la vegetación predominante es el mangle rojo (Rhizophora mangle) -como es el caso de los manglares del pacífico americano- la especie clave es el cangrejo del manglar Ucides occidentalis, que se encarga de reciclar entre el 75 y 84% de la materia orgánica de dicho ecosistema 1, 20. En el Perú, el ecosistema del manglar se ubica casi exclusivamente en la región Tumbes, abarcando 4541 ha y estando dominado por el mangle rojo 13 , con sólo 300 ha en la región Piura, que no cuenta con mangle rojo 7. La población de U. occidentalis se localiza mayormente en la zona Tumbes 13. U. occidentalis es un cangrejo que habita las costas del Pacífico americano, desde la isla Espíritu Santo (México) hasta San Pedro de Vice en Piura (Perú) 1, viviendo en la zona intermareal donde se alimenta de hojas de mangle rojo 20. Es también el cangrejo más explotado en el manglar peruano, lo que ha originado que su población se reduzca un 35,8% en el lapso de 11 años (Prospección bioecológica de Ucides occidentalis en Región Tumbes, 2010, 1ra edición, Ed. Instit Mar Perú, Tumbes, 20 p.) Su situación es similar a la de U. cordatus en Brasil, el cual también redujo dramáticamente su población 5, 17 por lo cual a partir de 2001 se inició su repoblamiento liberando larvas cultivadas al medio natural 6, 9. Sin embargo, este esfuerzo se realizó de manera inadecuada, sin haber estudiado la diversidad genética o la estructura genética poblacional de este cangrejo, por lo que posteriormente tuvo que hacerse para mejorar las estrategias de redoblamiento 16. Es posible que a corto plazo se requiera realizar también repoblamiento de U. occidentalis en el manglar peruano, por lo que es necesario conocer la diversidad genética y la estructura genética poblacional del mismo, para poder orientar la estrategia de repoblamiento a realizar, que no solo debe incrementar el tamaño poblacional sino mantener la diversidad genética y evitar inducir niveles altos de estructuración genética poblacional 12. La evaluación de la diversidad genética y de la estructura genética poblacional, se puede realizar secuenciando un fragmento del gen de la subunidad I de la citrocromo oxidasa (COI), tal como se ha empleado reiteradas veces en estudios similares en plantas y animales, incluyendo los crustáceos 2, 10, 11, 23. Esta investigación tuvo como objetivo determinar la diversidad genética y la estructura genética poblacional de U. occidentalis en el manglar de la región Tumbes (Perú).
Material y Métodos
Recolección de la muestra
Una muestra de 55 ejemplares de U. occidentalis se recogió de nueve estaciones de muestreo en el manglar de Tumbes (Perú) (Figura 1). Los cangrejos fueron llevados para su análisis al Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de Tumbes (Puerto Pizarro, Perú).
Obtención de muestras de músculo
Se extrajo 0,1 g de músculo de U. occidentalis y se colocó en un microtubo de centrífuga de 1,5 ml, añadiéndole 1 ml de etanol al 95%.
Extracción de ADN
Se realizó utilizando el protocolo de extracción con bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB), tal como lo efectuaron acertadamente otros investigadores en 2017 15.
Amplificación del fragmento del gen COI
(por reacción en cadena de la polimerasa, PCR). La amplificación se llevó a cabo en un volumen de reacción de 25 µl, conteniendo 16,75 µl de agua ultra pura, 2,50 µl de buffer 10X PCR RXn (marca Invitrogen), 2,50 µl de MgCl2 10 mM (marca Invitrogen), 0,50 µl de mix 10 mM de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs, marca Fermentas), 1,00 µl de albúmina de suero bovino (BSA), 0,50 µl de iniciador forward LCO1490 y 0,50 µl de iniciador reverse HCO2198 (ambos a 10 pMol/ µl, marca Fermentas), 0,25 µl de Taq polimerasa (5 U/ µl, marca Invitrogen) y 0,50 µl de la muestra de ADN. La amplificación se realizó en un termociclador (marca Techne modelo FTC3102D) con pre desnaturalización a 95°C por 1 min, seguido de 40 ciclos de amplificación (desnaturalización a 94°C por 30 s, hibridación a 50°C por 45 s y polimerización a 72°C por 1 min) seguido de una etapa de polimerización final a 72°C por 7 min.
Secuenciación del ADN
Cuarenta y cinco (45) muestras de ADN amplificadas exitosamente fueron enviadas para su secuenciamiento a Macrogen (Maryland, USA), obteniéndose 42 secuencias.
Análisis de las secuencias nucleotídicas
Las 42 secuencias nucleotídicas fueron alineadas en el software Mega versión 5, y comparadas con dos secuencias del fragmento del gen COI de U. occidentalis obtenidas de Genbank (números de acceso: JX524479 y JX524480) para descartar nucleótidos no confiables en las secuencias investigadas, después de lo cual la longitud de las secuencias se redujo a 543 pb. Las secuencias depuradas fueron depositadas en GenBank, (números de acceso: JX564556 - JX564597).
Análisis de la diversidad genética y la estructura genética poblacional
Las secuencias fueron analizadas con los software Mega 5 y DnaSP 5, para determinar la composición nucleotídica, el número de haplotipos (Nh), la diversidad de haplotipos (h) y la diversidad nucléotida (π). Con GenAlex 6 se obtuvo la matriz de distancia genética de Nei, se evaluó el nivel de estructura genética poblacional usando análisis molecular de varianza (AMOVA) y la correlación entre distancias genéticas y geográficas mediante el test de Mantel.
Resultados
Diversidad genética poblacional
La diversidad genética de U. occidentalis fue alta (Tabla 1), según lo indica su número de haplotipos: 30 en 42 individuos. Tres haplotipos (Hap2, Hap3 y Hap5) estuvieron presentes simultáneamente en las tres zonas de estudio (Zarumilla, Tumbes y Corrales), dos lo estuvieron en dos zonas (Hap6 en Zarumilla y Corrales, y Hap9 en Puerto Pizarro y Corrales). Los 25 haplotipos restantes se hallaron distribuidos en una sola zona. La frecuencia de haplotipos varió entre 2,38% para los menos frecuentes, y 14,29% para el más frecuente (Hap3) hallado en seis individuos de los 42 muestreados. El promedio de diferencias nucleótidas fue de 4,396 nucleótidos en la secuencia de 543 pb y la diversidad nucléotida (π) fue de 0,00810. La distancia genética fue baja y varió entre 0,001 a 0,005 (descartando las distancias dentro de la misma estación de muestreo). La mayor distancia genética se dio entre la estación de muestreo de El Jelí y la estación del estero Corrales (Tabla 2).
Estructura genética poblacional
El AMOVA mostró que la variabilidad genética se debió en un 96% a las variaciones genéticas de los individuos dentro de las poblaciones y en un 4% a la variación entre poblaciones. El test de Mantel presentó un coeficiente de correlación de Pearson casi igual a cero (r = -0,032), indicando la inexistencia de una correlación entre la distancia geográfica y la distancia genética evaluada.
Discusión
La diversidad genética de U. occidentalis fue alta, lo que se expresa a través de un elevado número de haplotipos (30 de 42) y la existencia de polimorfismo, pues el haplotipo más frecuente (Hap3) tuvo una frecuencia menor al 95% 12. El polimorfismo es frecuente en el gen COI: se ha reportado en varios crustáceos, entre ellos los cangrejos Eriocheir sinensis 23, Procambarus clarkii 2 y Scylla paramamosain 14. También ha sido reportado en U. cordatus 10 en el cual el haplotipo más frecuente tuvo una frecuencia de 15,7%, que es bastante similar a la hallada en esta investigación. La razón de este polimorfismo es que al ser un gen mitocondrial tiene alta tasa de mutación 3 con lo que es probable un alto número de haplotipos. U. occidentalis tuvo una diversidad de haplotipos: Hd = 0,9721, lo que también indica una alta diversidad. En varios crustáceos se ha observado un alto índice de diversidad de haplotipos cuando se evalúa el gen COI. Así, en el cangrejo del fango (Scilla paramamosain) se ha reportado Hd entre 0,625 y 0,914 14; en el camarón de río (Macrobrachium amazonicum) de 0,8488 22 y en U. cordatus de 0,97 10, siendo esta última muy similar a la encontrada para U. occidentalis tal vez por tratarse de especies del mismo género. La diversidad nucléotida (π) para el gen COI de U. occidentalis fue de 0,00810 (0,8%); otros investigadores también han hallado valores similares en otros crustáceos, como en los cangrejos Austropotamobius pallipes y A. torrentium con valores de 0,001 a 0,034 21, en el cangrejo Scylla paramamosain con 0,001 a 0,003 14, en el camarón Macrobrachium amazonicum con 0,0005 a 0,0242 22, así como en U. cordatus con 0,0063 a 0,0065 10. Esto muestra que la alta diversidad nucleótida de U. occidentalis es una característica compartida con otros crustáceos. La estructura genética poblacional de U. occidentalis fue muy baja, del 100% de la variabilidad genética, 96% se da intra poblaciones y sólo 4% inter poblaciones, lo que indica que las poblaciones en las zonas estudiadas son bastante similares. Este resultado es semejante al hallado en U. cordatus al usar microsatélites 4 (92,2% de variabilidad intra poblacional y sólo 7,8% inter poblacional), así como usando el gen COI 10 (97,44% de variabilidad intra poblacional y 2,56% inter poblacional). El análisis de Mantel realizado a U. occidentalis mostró que la distancia genética no tiene correlación con la distancia geográfica. Estudios con U. cordatus 4, 8, 10 han concluido que en dicha especie tampoco existe correlación, incluso poblaciones de U. cordatus distantes más de 4500 km y separadas por la desembocadura del río Amazonas (que podría suponer una barrera geográfica importante) se mostraron genéticamente similares 16. La baja estructuración genética poblacional observada en U. occidentalis se justifica por que al igual que U. cordatus tiene un alto flujo génico que se desarrolla por la eficiente dispersión larval, pues los estadios posteriores a Zoea II salen a mar abierto 10 permaneciendo allí por 20 a 69 días, tiempo en que las larvas pueden ser trasportadas por las corrientes varios miles de kilómetros, permitiendo el intercambio efectivo de genes 4, 16.
La alta diversidad genética y la baja estructuración genética poblacional de U. occidentalis en los manglares de Tumbes (Perú), indican que el repoblamiento del mismo en el manglar tumbesino es posible utilizando un stock de reproductores no muy elevado al contarse con una población con alta diversidad genética 18. El esfuerzo de recolectar el stock de reproductores depende de la estructura genética poblacional: si es alta, la selección de reproductores se dará en cada una de las subpoblaciones para conservar los alelos exclusivos de cada una de ellas; si es baja la selección puede realizarse considerándose una población única 18. Por ello, un futuro repoblamiento de U. occidentalis en el manglar de Tumbes, se podría realizar utilizando una cantidad baja de reproductores recolectados en pocas zonas del manglar.