TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN

Efectos de un herbicida a base de glifosato sobre hematíes de Prochilodus lineatus (Pisces, Prochilodontidae)

 

Caramello, C.S.¹; Hernandez, D.R.¹; Jorge, M.J.²; Jorge, L.C.¹

¹Facultad Ciencias.Veterinarias, ²Fac.Cs.Exactas, Univ.Nac.del Nordeste, Cabral 2139, Corrientes, Argentina. E-mail: ccaramello@vet.unne.edu.ar

http://dx.doi.org/10.30972/vet.2923277

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Resumen

En la actualidad el sistema agrícola tiene como principal propósito el aumento de la producción con el fin de garantizar el abastecimiento y distribución de sus productos en el mercado, sea interno o externo, generando así mayor rentabilidad económica. Esto trae aparejado la implementación de diferentes agroquímicos que, vertidos al ambiente, pueden tener un impacto negativo sobre la flora, fauna, cuerpos hídricos e incluso en seres humanos. El glifosato (Roundup Full II) es uno de los herbicidas más empleados y sus beneficios están siendo objetados por las desventajas que podría provocar su utilización en forma excesiva. El objetivo de este trabajo fue evaluar la ocurrencia de alteraciones citoplasmáticas en eritrocitos de sábalo (Prochilodus lineatus) expuestos en un ensayo crónico al herbicida glifosato. Se utilizaron ocho ejemplares juveniles de sábalo, los que fueron distribuidos aleatoriamente en dos tratamientos según la adición del herbicida: control (C) sin adición y tratado (T) con adición de 0,1 μg/l de glifosato. El ensayo tuvo una duración de 70 días. Para la preparación de los frotis sanguíneos se procedió a la extracción de sangre periférica por punción de la vena caudal. Las alteraciones observadas fueron presencia de vacuolas citoplasmáticas, dacriocitosis y microcitosis. Estas anormalidades se presentaron con mayor frecuencia en el grupo T con respecto al C. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una respuesta patológica a nivel hemático ante una exposición crónica a la dosis de 0,1 μg/l del herbicida.

Palabras clave: peces, plaguicida glifosato, citotoxicidad, alteraciones eritrocitarias.

 

Abstract

Nowadays, agriculture main purpose is to increase production in order to guarantee the supply and distribution of products to both national and international markets, thus improving economic profitability. The latter is accompanied by the use of different agrochemicals that, discharged to the environment, can have a negative impact on flora, fauna, water bodies and even on humans. Glyphosate is a widely used herbicide which benefits are being questioned due to the disadvantages related to its excessive use. The objective of this work was to evaluate the occurrence of cytoplasmic alterations in “sábalo” erythrocytes (Prochilodus lineatus) exposed to a chronic test with glyphosate (Roundup Full II). Eight “sábalo” juvenils were used which were randomly distributed into two treatments: control (C), without glyphosate, and treated (T), with the addition of 0.1 μg/l of the herbicide. The trial lasted 70 days. For the preparation of blood smears, peripheral blood was collected by puncture of the caudal vein. The alterations observed were cytoplasmic vacuoles, dacryocytosis and microcytosis. These abnormalities occurred more frequently in the T group compared to C group. Results suggest the existence of an hematic pathological response when “sábalos” were submitted to a chronic exposure of 0.1 μg/l of the herbicide.

Key words: fishes, herbicide glyphosate, cytotoxicity, erythrocytic alterations.

 

Recibido: 16 marzo 2018

Aprobado: 23 mayo 2018

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INTRODUCCIÓN

El uso creciente e inapropiado de agroquímicos para proteger las cosechas genera desechos que podrían contaminar a los trabajadores involucrados en la manipulación del pesticida y además acumularse en el ambiente afectando directa e indirectamente a todos los seres vivos, suelos y cuerpos de agua ^{12, 17}. En la actividad agrícola de Argentina, uno de los plaguicidas ampliamente difundido es el Roundup Full II, cuyocompuesto activo es el glifosato (N-fosfonometil glicina).

El glifosato es un herbicida no selectivo de amplio espectro ¹, de carácter ácido, con toxicidad clase II (moderadamente tóxico) según la categorización de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos ²⁸. Este herbicida afecta todos los órganos de la planta y se aplica sobre el follaje en la etapa de postemergencia ²⁵.

Los cuerpos de agua son los principales receptáculos de los efluentes provenientes de diversas actividades ¹⁸. Por ello, es lógico pensar que estas sustancias podrían acumularse en la fauna acuática y en los sedimentos.

Los peces son utilizados como organismos bioindicadores de toxicidad ambiental, por ser muy sensibles y útiles en la evaluación de riesgos ecológicos por contaminantes químicos, ya que interactúan en varios niveles de la cadena trófica ^{13, 23}, por lo cual pueden sufrir bioacumulación de contaminantes en sus tejidos y las posibles lesiones podrían ser detectadas mediante la implementación de biomarcadores ¹⁴.

Los biomarcadores son definidos como respuestas biológicas provocadas por los contaminantes, dando lugar a la identificación y categorización de los daños producidos en los tejidos ¹⁵. Las alteraciones citoplasmáticas en los hematíes de los teleósteos son biomarcadores de exposición a agentes tóxicos y exhiben los efectos de los mismos como respuestas a dicha exposición.

Este tipo de biomarcador tiene la ventaja de permitir el examen sobre las células sanguíneas, tanto en condiciones de laboratorio como a campo y representa un elemento eficaz para la detección de los efectos causados por agroquímicos. Diversas investigaciones con pesticidas han evaluado el daño a nivel celular y detectaron alteraciones citoplasmáticas de eritrocitos de teleósteos como respuesta biológica provocada por la exposición a los contaminantes ^{2-4, 16, 20, 22, 26}.

Por lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la ocurrencia de alteraciones citoplasmáticas en eritrocitos de sábalos (Prochilodus lineatus) expuestos en un ensayo crónico al herbicida glifosato.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Los procedimientos metodológicos empleados fueron avalados por el Comité de Ética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), según Protocolo 0033.

En el ensayo se utilizaron ejemplares juveniles de Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae, Valenciennes 1847), provenientes del Centro de Piscicultura del Instituto de Ictiología del Nordeste (INICNE), Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE. Los peces fueron sometidos a un período de aclimatación durante una semana antes del ensayo, siendo alimentados con ración apropiada cada 48 h. Durante la aclimatación los especimenes se mantuvieron en tanques de 300 l de agua a 20°C, pH 7,0 y aireación constante. El fotoperíodo fue ajustado a 12 h de oscuridad y 12 h de luz.

Posteriormente, ocho especimenes de P. lineatus fueron colocados individualmente en acuarios de 25 l de capacidad cargados con 20 l de agua; cuatro de ellos fueron asignados al grupo control (C) y el resto al grupo tratado (T). Los acuarios del grupo C recibieron solo agua de pozo artesiano, el grupo T además del agua recibió 0,1 ug/l de glifosato.

El ensayo tuvo una duración de 70 días. Transcurrido este período de experimentación los peces fueron anestesiados con metasulfonato de tricaína MS-222 (Finquel®) disuelto en agua. La extracción de sangre periférica se realizó por punción de la vena caudal utilizando jeringas heparinizadas. Para la preparación de los frotis sanguíneos se siguió la técnica convencional para ambos grupos ^{10, 24}.

Se analizaron 2.000 eritrocitos en cada individuo. Solo se consideraron las células con membrana citoplasmática intacta. Finalmente se clasificaron los hematíes según su morfología. Las microfotografías fueron tomadas con cámara digital Motic 9.0 adaptada a un microscopio Olympus BX41. Las diferencias en las frecuencias de alteraciones citoplasmáticas se determinaron mediante la comparación del grupo tratado con el grupo control por medio del test no paramétrico U de Mann-Whitney. Para el análisis se utilizó el programa estadístico SPSS.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se analizaron por cada animal 2.000 células con membrana citoplasmática intacta, contándose un total de 8.000 tanto para el grupo control como para el tratado. En T se observaron 102 eritrocitos (1,28%) con anomalías citoplasmáticas, mientras que en C se evidenció un total de 21 (0,26%) (Tabla 1). Las alteraciones citoplasmáticas encontradas fueron: vacuolización (C: 10 = 47,63%; T: 27 = 26,46%); microcitosis (C: 9 = 42,85%; T: 32 = 31,37%) y dacriocitos (C: 2 = 9,52%; T: 43 = 42,15%), como se observa en Figura 1 y Tabla 2.

 

Tabla 1. TíIncidencia de alteraciones citoplasmáticas en eritrocitos de sangre periférica de Prochilodus lineatus de los grupos control y tratado (0,1 ug/l glifosato).

 

Tabla 2. Total de alteraciones citoplasmáticas encontradas en eritrocitos de Prochilodus lineatus de los grupos control y tratado (0,1 ug/l glifosato).

Estos resultados revelan que especimenes de P. lineatus expuestos a glifosato a la dosis de 0,1 μg/l muestran un aumento en la frecuencia de alteraciones citoplasmáticas contrastando con las del grupo control. El análisis estadístico de los datos evidenció una asociación entre la frecuencia de anomalías con el tipo de tratamiento (p<0,05), como se detalla en la Figura 2. Diferentes grados de lesiones hematológicas han sido descriptas en anfibios y mamíferos expuestos a glifosato ¹⁶. En igual sentido, ejemplares de peces como carpas (Cyprinus carpio) sometidas a dosis subletales de glifosato, exhibieron eritrocitos con una cantidad regular de vacuolas citoplasmáticas, las cuales son consideradas alteraciones severas ya que estarían indicando un elevado grado de toxicidad hemática ².

Por otro lado, se han detectado anomalías sanguíneas en ensayos con diferentes plaguicidas utilizando a los peces como indicadores de contaminación ambiental. Así en C. carpio se identificaron eritrocitos crenados con evidentes alteraciones a nivel citoplasmático en los individuos tratados con concentraciones subletales de fenvalerato (0,01 ppm) y cipermetrina (0,02 ppm) durante un ensayo de 48 horas ²⁰.

 

Figura 1. Microfotografía de frotis sanguíneos de Prochilodus lineatus, observándose morfología eritrocitaria de los grupos control (a, c, e) y tratado con 0,1 ug/ñ de glifosato (b, d, f). N: eritocitos normales, MC: microcitos, D: dacriocitos, V: vacuolas citplasmáticas. Barras = 25 μm

 

Figura 2. Incidencia de alteraciones citoplasmáticas (%) en eritrocitos de sangre periférica de P. lineatus de los grupos control y tratado. En negro: con alteraciones citoplasmáticas; en gris: sin alteraciones.

 

Especímenes de Clarias batracus tratados en ensayos subagudos y a concentraciones subletales de carbaryl y carbofuran presentaron eritrocitos con alteraciones morfológicas (equinocitos) ²⁶. Ensayos con la misma especie expuestos durante 96 h a diferentes concentraciones de los pesticidas 2,4 D y Butaclor, provocaron distintas anomalías en el citoplasma de los hematíes, tales como equinocitos, anisocromacia, anisocitosis y vacuolas ⁴.

Ejemplares de Chana punctatus sometidos durante 30 días a dosis de 0,05, 0,10, 0,15, 0,20 y 0,25 mg/l de malatión, exhibieron glóbulos rojos con alteraciones citoplasmáticas descriptas como acantocitos, esferocitosis, equinocitosis, vacuolización, contracciones elípticas de la membrana y disrupción de la misma ²².

Individuos de Catla catla puestos en contacto a dosis subletales de monocrotofos (insecticida), butaclor (herbicida) y radiación, revelaron diversas malformaciones como ser equinocitosis, anisocromacia, presencia de vacuolas citoplasmática y microcitosis ³.

La membrana del eritrocito está constituida por un glicocálix (con abundantes carbohidratos), una bicapa lipídica (de proteínas transmembranales y lípidos) y un citoesqueleto membranal (proteínas con disposición de red, intrincada en la bicapa lipídica). El glifosato actuaría modificando la constante dieléctrica del disolvente (agua) que rodea la célula, disminuyendo las fuerzas hidrofóbicas entre los lípidos asociados ^{9, 19, 28}, originando un desacople en la fosforilación oxidativa ²⁸. Tales alteraciones originan daños a nivel de la capa fosfolipídica y pérdida de la estabilidad de membrana, generándose así cambios morfológicos en los glóbulos rojos ¹¹.

Además, se demostró que la exposición a glifosato provocaría lesiones en las membranas celulares y daños en el citoesqueleto, modificaciones que estarían relacionadas con liberación citosólica de componentes, así como pérdida de la regulación iónica. En el mismo sentido, las células expuestas a glifosato evidencian cambios característicos de procesos apoptóticos ⁸.

La presentación de dacriocitos y microcitos en sangre podría ocurrir por restricción severa de hierro, fragmentación celular y daños oxidativos a nivel de la membrana celular. En peces, dichos mecanismos serían inducidos como consecuencia de la interacción con agentes estresores (elementos tóxicos). Diversas sustancias químicas son vertidas al agua, contaminando los recursos hídricos y afectando los organismos acuáticos. Algunas de ellas son capaces de promover alteraciones fisiológicas, incluidos los disturbios hematológicos. Tales mecanismos son desencadenados con el propósito de subsanar lesiones o adaptar el organismo a las nuevas condiciones ambientales ⁶.

Diferentes autores sugieren que el fenómeno de vacuolización podría ocurrir como un mecanismo del organismo para disminuir la disponibilidad de xenobióticos ^{7, 21}. Además, se propone que este fenómeno puede ser el resultado de daños a nivel mitocondrial ²⁷. Dichas lesiones en eritrocitos también estarían asociadas a la interacción entre el material genético y las especies de oxígeno reactivo generadas por el metabolismo del xenobiótico ⁵.

La información obtenida en esta experiencia nos lleva a concluir que ante una exposición crónica del herbicida glifosato (70 días a la dosis de 0,1 μg/l), los especimenes de P. lineatus exhiben una respuesta patológica a nivel eritrocitario, expresada por la formación de microcitos y dacriocitos, así como fenómenos de vacuolización. Al mismo tiempo, se destaca que los hematíes de teleósteos son excelentes indicadores de citotoxicidad, factibles de ser utilizados en el monitoreo ambiental.

 

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