Introducción

La leishmaniosis visceral (LV) es una enfermedad sistémica crónica severa, causada por Leishmania donovani o L. infantum ²³. La afección se transmite a huéspedes humanos y animales a través de la picadura de moscas hembras del género Phlebotomus en el “viejo mundo” y Lutzomya en el “nuevo mundo” ¹¹. La LV está caracterizada clínicamente por fiebre prolongada, debilidad, anorexia, pérdida de peso, hepatomegalia, esplenomegalia, hipergammaglobulinemia y pancitopenia. Sin un tratamiento, la enfermedad puede progresar y culminar en una severa caquexia, enfermedad multisistémica, sangrado, infecciones secundarias y muerte ^{10, 16}. En la LV los componentes de la saliva del vector ejercen en el hospedador un efecto vasodilatador, anticoagulante, inmunomodulador y quimioatrayente de células inmunitarias. Esto induce un reclutamiento hacia el sitio de infección de células polimorfonucleares, macrófagos y posteriormente células natural killer(NK) y células dendríticas (CD). La respuesta inmunitaria innata se inicia después de que estas células inmunitarias equipadas con receptores, hayan contactado con leishmanias y reconocido sus patrones moleculares patogénicos, así como otras moléculas de leishmanias conservadas. Las primeras células reclutadas del sitio de infección por protozoarios son los polimorfonunucleares, en concreto los granulocitos neutrófilos, cuya función principal implica la fagocitosis y la eliminación de patógenos en respuestas inmunitarias innatas ¹². Diversos estudios han descrito la presencia de parásitos de leishmanias en las CD de huéspedes infectados. Las CD cumplen un papel esencial como células presentadoras de antígenos, siendo un nexo entre las respuestas inmunitarias innatas y las adquiridas. Las células precursoras de CD se producen en la médula ósea y circulan hacia los tejidos donde residen como células inmaduras con una alta capacidad fagocítica ⁶. Durante el contacto con el parásito, las CD inmaduras interaccionan a través de sus receptores con diversos antígenos de Leishmania sp. Después de la interacción entre los parásitos y las CD, estas últimas sufren un proceso de maduración durante el cual aumentan la expresión en superficie de CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) de tipo I y II, así como de moléculas co-estimuladoras. Las CD infectadas son capaces de sintetizar interleukinas (IL-12, a diferencia de los macrófagos), que conducen a la generación de un perfil de tipo Th1 ²⁴. Dependiendo del tipo de sinapsis que se establezcan, se promueven unos u otros fenotipos Leishmania-específicos de tipo Th1/Th2 (TCD4+), citotóxico (TCD8+) o supresor (Treg) ⁴. Durante la década de 1980 se profundizó el conocimiento de la funcionalidad de los linfocitos T y se identificaron dos tipos de respuestas colaboradoras: la Th1 (inmunidad celular o retardada) y la Th2 (inmunidad humoral). Las Th1 son altamente efectivas en la eliminación de patógenos intracelulares y las Th2 son de gran importancia en la eliminación de microorganismos extracelulares y parásitos ¹. Los granulocitos pueden liberar citoquinas proinflamatorias que atraen CD (células dendríticas) y su interacción a través de un receptor específico orquesta respuestas inmunitarias de tipo Th1 ²². Estas dos respuestas, fundamentalmente de tipo celular, dirigidas por los linfocitos T helper, representan dos formas evolutivas: la Th1 se asocia a un aumento de linfoproliferación específica con niveles de inmunoglobulinas moderados o bajos y la Th2 con una linfoproliferación específica disminuida, inmunoglobulinas muy elevadas y una evolución clínica desfavorable. En la leishmaniosis, la expansión de las células Th1 se asocia a la inmunidad protectora y la de Th2 a la progresión o persistencia de la enfermedad ^{2, 3, 9, 13}. Se ha evidenciado que las células Th1 producen interferón (IFN-γ), interleukina (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF-α). En cuanto al papel de la IL-12 se ha sugerido que la expresión simultánea de ésta junto con IL-2 e INF-γ conducen a un proceso de retraso en el establecimiento de la enfermedad en perros infectados experimentalmente ²¹. En ese contexto, varios estudios han demostrado que la susceptibilidad a la LV está relacionada a altos títulos de anticuerpos circulantes y a una depresión de la inmunidad mediada por células T de tipo 1, principalmente con disminución de la producción de IFN-γ e interleukina (IL-12), incluyendo un marcado aumento de las interleukinas IL-4 e IL-10 ^{17, 21} . Similar a la LV humana, la LV caninaactiva está caracterizada por activación policlonal de células B, inmunosupresión específica y la aparición de síntomas clínicos dependiendo de la cantidad de parásitos en diferentes órganos viscerales ^{19, 20}. Parece existir una interacción entre citoquinas de Th1 y Th2 durante la infección por Leishmania, y esto sugiere roles importantes para las diferentes citoquinas en la protección y patogénesis de la enfermedad ⁵ .La respuesta inmune innata ordena el reclutamiento celular y ayuda a desarrollar el microambiente de citoquinas para el cual están preparadas las células T ^{14, 18} . El control de la infección de LV depende de una exitosa respuesta inmune mediada por células ¹⁵ en la cual el INF-γ producido principalmente por células T CD4+ y células NK estimuladas por IL-12, lleva a la acción microbicida mediada por óxido nítrico ^{7, 8}.El objetivo del presente trabajo fue establecer la relación entre la carga parasitaria y la respuesta inmune en perros infestados naturalmente con Leishmania sp

Diagrama 1: Cantidad de amastigotes de Leishmania sp y linfocitos Th1 en biopsias de pabellón auricular. 

Material y Métodos

Se trabajó con un total de 20 animales, todos reaccionantes a la inmuno-cromatografía directa mediante Kala Azar Detect canino, de los cuales algunos presentaban síntomas y otros fueron asintomáticos. Se obtuvieron muestras de esos 20 caninos, que procedían principalmente de clínicas privadas, así como también de aquellos perros que se encontraron en lugares donde se constató la presencia de flebótomos infectados, correspondientes a distintas zonas del nordeste argentino. Se seleccionaron pacientes caninos con diagnóstico serológico reactivo a leishmania mediante prueba serológica con tiras inmunocromatográficas rk39 Kala Azar Detect canino. A esos pacientes se les extrajeron muestras para exámenes parasitológicos directos, por punción de médula ósea, extensión en portaobjetos y coloración con Giemsa. También se obtuvieron muestras por biopsia de piel del pabellón auricular. En todos los casos se anotaron los síntomas. Con las muestras de pabellón auricular se realizó la técnica inmuno-histoquímica para detectar la proporción de linfocitos Th1 en relación con la carga parasitaria. Para la obtención del anticuerpo primario se envió una muestra conservada en nitrógeno líquido de nódulo linfático de un canino naturalmente infectado con Leishmania sp al Instituto de Salud y Ambiente del Litoral (ISAL, Universidad Nacional del Litoral, Facultad de Bioquímica y Cs. Biológicas, Santa Fe). A partir de esa muestra se elaboró el anticuerpo primario policlonal purificado para la detección de los linfocitos Th1. Se practicó la técnica inmuno-histoquímica con el desparafinado e hidratación de las muestras, inhibición de peroxidasa endógena, incubación con el anticuerpo primario y luego con el secundario. Poste-riormente se recurrió al revelado mediante la aplicación de extravidina (Sigma) 1/200 durante 30 minutos en cámara húmeda, a temperatura ambiente, aplicando luego el cromógeno. Para finalizar se contrastó con hematoxilina durante un minuto y se procedió a deshidratar y montar las muestras con bálsamo de Canadá natural. También se practicó inmuno-histoquímica para la detección de la cantidad de leishmanias, de la misma manera descripta anteriormente pero cambiando el anticuerpo primario y secundario. Para poder relacionar la carga parasitaria con la proporción de linfocitos Th1 se evaluaron 2 muestras seriadas consecutivas de cada biopsia (una muestra co-loreada para Leishmania sp y otra para linfocitos Th1). La carga parasitaria se determinó como baja, moderada y elevada, así como también para la población de linfocitos Th1 (Diagrama 1).

Resultados

Sobre un total de 20 animales analizados, 12 (60%) presentaron síntomas y 8 (40%) no los presentaron. De los animales sin sintomatología, 4 (50%) revelaron una elevada carga parasitaria en las biopsias de pabellón auricular, 2 (25%) carga moderada y 2 (25%) carga baja con escasos parásitos identificables (Figura 1). En cuanto a la proporción de linfocitos Th1 se pudo observar que en las muestras donde había una elevada carga parasitaria, la cantidad de Th1 no superaba las 3 células por campo de mayor aumento, mientras que en las muestras donde prevalecían carga moderada y baja de parásitos, la cantidad de Th1 superaba las 6 células por campo de mayor aumento (Figura 2), pudiendo llegar hasta 10. De los animales con sintomatología, 2 (16%) presentaron baja carga parasitaria, 2 (16%) carga moderada y 8 (67%) carga elevada de parásitos en las biopsias de piel (Figura 3).

Figura 1: Piel de pabellón auricular de canino asintomático, con escasa cantidad de amastigotes de Leishmania sp (puntillado de color marrón oscuro, IHQ, 40X). Recuadro superior con detalle a mayor aumento (IHQ, 100X). 

De las muestras provenientes de animales con síntomas se observó que donde había moderada y elevada carga de parásitos, la cantidad de linfocitos Th1 no superaban las 5 células (Figura 4), mientras que las muestras con baja carga parasitaria superaban las 8 células por campo de mayor aumento.

Figura 2: Misma biopsia de Figura 1, resaltando mediante inmunomarcación la presencia de 8 células Th1 en color marrón (IHQ 100X). 

Figura 3: Biopsia de piel de pabellón auricular de canino con síntomas. Se observan abundantes amastigotes de Leishmania sp (IHQ, 40X). Recuadro: ídem a mayor aumento (IHQ, 100X). 

Figura 4: Misma biopsia de la Figura 3, resaltando mediante inmunomarcación la presencia de linfocitos Th1. Las flechas indican dos células inmunomarcadas (IHQ 100X). 

Discusión

Cuando las células dendríticas toman contacto con antígenos de LV, sufren un proceso de maduración por lo cual aumentan en su superficie la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad. Estas células dendríticas infectadas sintetizan IL-12, que conduce a generar un perfil de tipo Th1 ²⁴. Las respuestas colaboradoras de Th1 son efectivas para eliminar patógenos que se hallan dentro de las células, mientras que las de tipo Th2 son eficaces para la eliminación de microorganismos extracelulares y parásitos ¹. En la leishmaniosis, la expansión de células Th1 se asocia a inmunidad protectora y la de Th2 a progresión de la enfermedad y persistencia ^{2, 3, 13}. Si bien hay estudios que indican que la LV se caracteriza por aparición de síntomas clínicos dependiendo de la carga parasitaria en diferentes órganos ^{19, 20}, en este estudio la presencia o ausencia de signos clínicos en muchos casos no estuvo relacionada a la cantidad de parásitos encontrados en las biopsias de piel. Se han encontrado animales sin sintomatología y con elevada cantidad de parásitos presentes en la biopsia, así como animales con baja carga parasitaria y sintomatología variable. Por otra parte, se observa que la alta carga parasitaria se relaciona con inmunosupresión mediada por linfocitos Th1, mientras que en los animales con alta respuesta inmunológica, la carga parasitaria está disminuida. Los datos obtenidos coinciden con autores que manifiestan que el control de la LV depende de una exitosa respuesta inmune mediada por células ¹⁵, en la cual el IFN-γ producido por las células Th1 y NK estimuladas por IL-12, lleva a la acción microbicida mediada por óxido nítrico.