Introducción

En la actualidad existe una gran competitividad en el sector ganadero. En todo momento se busca producir cantidad y calidad, siendo ello un motivo importante para el uso de biotecnologías reproductivas. La producción de embriones in vitro es una biotecnología reproductiva empleada a nivel mundial, por sus diversas aplicaciones en la mejora genética animal.

Sin embargo la baja tasa de desarrollo embrionario in vitro causada por diversos factores como la mala calidad de los gametos, anomalías cromosómicas, desacoplamiento de telómeros y condiciones de cultivo que no son óptimas, inducen el estrés oxidativo resultando una gran limitante en la producción de embriones in vitro como herramienta reproductiva y posterior aplicación en la mejora genética.

Los embriones producidos in vitro son muy susceptibles al estrés oxidativo y consecuentemente tienen problemas en su desarrollo. El estrés oxidativo ha sido relacionado con diferentes tipos de lesiones celulares, peroxidación de lípidos de membrana, oxidación de aminoácidos y ácidos nucleicos, apoptosis y necrosis, que posteriormente disminuyen la viabilidad de los embriones producidos in vitro^7,8.

El resveratrol es un polifenol natural presente en numerosas plantas y frutos como cacahuetes, moras, arándanos y, sobre todo, en la uva y el vino tinto ⁽³. Recientemente se ha observado un aumento en el interés por el resveratrol tras los hallazgos beneficiosos sobre la quimioprevención, la cardioprotección, los procesos inflamatorios y varios aspectos del metabolismo, aumentando la vida útil de varios organismos, desde levaduras hasta vertebrados ¹⁵.

Mediante este descubrimiento se han realizado varios estudios con el objetivo de identificar funciones biológicas del resveratrol en la reproducción de mamíferos^5,9. La adición de resveratrol como suplemento a los medios de cultivo en la producción de embriones in vitro es utilizado en diversas especies.

En una investigación se adicionaron 2 μM de resveratrol en soluciones de MIV mejorando y optimizando la calidad y resistencia de los ovocitos porcinos a la crioconservación ⁴. Otros utilizaron el resveratrol a una concentración de 0.5 μM obteniendo un efecto beneficioso sobre el desarrollo de pre-implantación que conduce a la formación de blastocistos y una mejor calidad del embrión ¹⁰.

En bovinos la adición de resveratrol al medio CIV o medio de vitrificación, ayudó a los embriones a recuperar parcialmente su estado inicial en el proceso de vitrificación y calentamiento ² y en ratones promovieron la calidad de los ovocitos al prevenir el daño al ADN ¹².

La técnica de separación de blastómeras es utilizada como una herramienta para aumentar la producción de células embrionarias (embriones) ⁶. Sin embargo, no se han probado los beneficios que el resveratrol puede tener en el proceso de producción de embriones in vitro por la técnica de separación de blastómeras, con la finalidad de aumentar los porcentajes y la calidad de los embriones producidos in vitro y de esta manera brindar un beneficio social entregando a menor costo los em­ briones y mejorando la genética a nivel de la región y del país.

Por ello, el objetivo general de esta investigación fue evaluar el efecto del resveratrol en el porcentaje y calidad de embriones in vitro generados por separación de blastómeras en ganado bovino.

Material y métodos

Localización del estudio y materiales utilizados. El estudio se realizó en el Laboratorio de biotecnología animal, reproducción y mejoramiento genético del Instituto de Investigación en ganadería y biotecnología, Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza, región Amazonas, Perú.

Colecta de ovarios y aspiración de los ovocitos. Se colectaron ovarios de vacas cruce con Brown Swiss, con un rango de edades de 1 a 4 años, fisiológicamente sanas. Los ovarios fueron recolectados en vacas de la cuidad de Chachapoyas con ayuda de tijeras y posteriormente se transportaron al laboratorio en un recipiente isotérmico conteniendo cloruro de sodio al 0.9% (wt/vol) con 0,025 mg/ml de estreptomicina, temperado a 37°C. Se aspiraron los folículos de tamaño medio (2 a 6 mm) usando una jeringa de 10 ml y una aguja de 18 G con medio de manipulación HEPES suplementado con 50 mg/ml de gentamicina y 10% (vol/vol) de suero fetal bovino (SFB).

Maduración in vitro de los ovocitos. Fueron seleccionados los ovocitos con citoplasma homogéneo y varias capas de células de cúmulos compactos ^11,17. La maduración in vitro fue realizada en 24 horas, en una atmósfera humidificada con 5% CO a 38,5°C, en placas de 4 celdas conteniendo medio de maduración TCM199 suplementadas con 0,25 mg/ml de piruvato de sodio, 50 ug/ml de gentamicina, 0,01 UI/ml de hormona folículo estimulante (FSH), 0,01 UI/ml de hormona luteinizante (LH), 0,1 mg/ml de glutamina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidermal (EGF), 1 ug/ml de 17 hestradiol y 10% SFB.

Fertilización in vitro de los ovocitos. Para la fertilización se utilizó semen nacional congelado de la raza Brangus. Espermatozoides mótiles fueron lavados, seleccionados y capacitados por el método de Percoll ¹⁴ y adicionados al medio de fecundación TALP-FIV ²⁰; suplementado con 0,25 mg/ml de piruvato de sodio, 50 ug de gentamicina, 0,03 mg/ml de heparina y 3 mg/ml de suero de albumina bovinafactor cinco (BSAV). Los ovocitos madurados y los espermatozoides capacitados se incubaron por 18 horas en una atmósfera humidificada a 38,5°C con 5% CO₂.

Cultivo in vitro de los cigotos. Ellos se cultivaron en grupos de 25 en placas de cuatro pocillos durante tres días a 38,5°C, con mezcla de gases, utilizando el medio SOF base ²⁰; suplementado con 0,044 g/l de piruvato de sodio, 0,039 g/l de L-glutamina, 3,0 mg/ml de suero de albumina bovina (BSA-FAF), 1 X de aminoácidos esenciales, 1 X de amino ácidos no esenciales, 10 mg/ml de EGF, 0,1 mg/ml de ácido cítrico, 0,5 mg/ ml de myoinositol, 50 μg/ml de gentamicina, 2% de SFB y dos concentraciones de resveratrol de 2 μM y 0,5 μM.

Separación de blastómeras y cultivo en WOW. Los embriones de tres días de cultivo con ocho a diez blastómeras fueron despojados de su zona pelúcida con 0,2% de pronasa en Hepes-buffered SOF para ser cultivados en WOW (pocillos hechos manualmente con un punzón) a razón de cuatro blastómeras por pocillo, con el medio de cultivo SOF mencionado anteriormente y suplementado con concentraciones de 2 gM y 0,5 gM de resveratrol, posteriormente se colocaron en incuba­ dora de CO2durante 6 días.

Tinción de yoduro de propidio (PI) (células muertas), flurescein diacetate (FDA) (células vivas) y Hoechst (células totales). Pasados los seis días de cultivo los embriones fueron colocados en medio de tinción compuesto por phosphate buffered saline-alcohol polivinílico suplementado con 1,0 mg/ml de PI, 1,0 mg/ml de FDA y 1,0 mg/ml de Hoechst para luego ser llevados a incubación por 10 minutos y posteriormente ser examinados con ayuda de un microscopio invertido con fluorescencia (Olympus, Japón).

Análisis estadístico. Los datos de clivaje, desarrollo embrionario, producción de embriones, cantidad de células totales y células vivas obtenidos en las 4 repeticiones por tratamiento (2 μM, 0,5 μM) y grupo control (sin aplicación de resveratrol) se analizaron mediante el análisis de varianza (ANOVA) en un diseño completamente al azar (DCA) usando el software estadístico Statistix 16.0¹⁸.

Resultados

La suplementación con resveratrol al día 3 de cultivo no alteró la tasa de clivaje (50, 52 y 52%); sin embargo la suplementación de resveratrol con 0,5 μM fue significativamente superior (p<0,05) en 4% respecto a los otros grupos en número de embriones de 8 a 10 blastómeros (Tabla 1 y Figura 1).

El número y porcentaje de blastocistos al sexto día de cultivo post separación de blastómeras no presentó diferencia al nivel de p<0,05 (Tabla 2, Figura 2), sin embargo se notó una superioridad numérica al agregar 0,5 μM respecto a los otros tratamientos.

La concentración de 0,5 μM de resveratrol en el cultivo post-separación de blastómeras superó (p<0,05) en 9 y 8 células totales con respecto a 2 μM y el grupo control. Asímismo presentó superioridad en número de células vivas la suplementación con 0,5 μM de resveratrol respecto al 2 μM y al control, como se muestra en la Tabla 3.

Discusión

Según los investigadores¹⁹, el uso de resveratrol en la fecundación ayuda a contrarrestar la poliespermia dando por consiguiente mejores resultados en clivaje y producción de embriones en bovinos. En la presente investigación se agregaron las dosis de resveratrol posteriormente a las 18 horas de fecundación, donde éste ya no tuvo contacto con los espermatozoides, sino directamente con los cigotos ya fecundados, por lo cual en los resultados no hubo diferencias en clivaje por tra­ tamientos y grupo control.

Otros investigadores reportaron que la adición de resveratrol en los medios de cultivo para la producción de embriones in vitro tiene un efecto positivo en su calidad ya que disminuye los procesos de apoptosis ¹⁵.

Ello fue corroborado por otros investigadores ²¹, los cuales determinaron que la suplementación con altas o bajas concentraciones de resveratrol no influyen en las tasas de producción in vitro de blastocistos bovinos; sin embargo respaldan que las bajas concentraciones de su suplementación en los medios de cultivo mejoran la calidad de los embriones bovinos.

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en la presente investigación, donde no se observaron diferencias significativas (p<0,5) en la tasa de producción de blastocistos con el uso de resveratrol, lo cual podría también haber estado influenciado por la manipulación en la separación de blastómeros aumentando el estrés oxidativo que resulta en altos niveles tóxicos de ROS, perjudicando su desarrollo embrionario ^1,8 .

Por su parte, los resultados en calidad embrionaria fueron similares respecto al promedio del número de células totales (96,0) y el promedio de células vivas por embrión, lo cual indica que la adición de resveratrol en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 μM tiene efecto positivo en la calidad de los embriones producidos por separación de blastómeras.

La mejoría en la calidad embrionaria respecto al número de células totales es corroborada por varios investigadores ^10,16, quienes realizaron estudios con resveratrol en la producción de embriones in vitro en cerdos y bovinos, teniendo mejores resultados con la concentración de 0,5 μM, concordando con estos resultados, que usando la misma cantidad de resvertarol presentó mejor calidad (Tabla 3, Figura 3).

Otros ⁴⁾ reportaron mejores resultados en el proceso de vitrificación de ovocitos porcinos con una concentración de 2 μM por lo cual se tomó en consideración esta concentración por ser también la separación de blastómeras un proceso que provoca estrés fuera del desarrollo normal de un embrión. Sin embargo esta concentración de resveratrol no tuvo efecto positivo sobre el porcentaje y la calidad de blastocistos (Tabla 2, Tabla 3).

En conclusión, surge que la suplementación con resveratrol al medio SOF no aumenta el porcentaje de blastocistos pero sí mejora su calidad al usar una concentración de 0,5 μM.