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Introducción
Las enfermedades infecciosas son un problema de salud a nivel mundial, y son amplios los esfuerzos que se hacen para controlar este mortal problema. Una de las áreas de investigación es la búsqueda de alimentos funcionales, es decir, aque llos que tienen un efecto potencialmente positivo en la salud más allá de la nutri ción básica porque promueven una salud óptima y ayudan a reducir el riesgo de padecer enfermedades. Uno de ellos es la algarrobina que es un complemento nu tricional obtenido a partir de la algarro ba, que es la manera como se denomina al fruto maduro del algarrobo (Prosopis pallida), a la cual se le atribuyen varios beneficios y que en su composición po demos encontrar más minerales que los reportados en la miel de abejas y ofrece un valor nutricional mayor que el repor tado para las peras de marañón (Guil herme et al., 2009). En Perú, el algarrobo (Prosopis pallida) es el que más abunda de la zona costera peruana y se ha repor tado en trece (13) departamentos, desde Tumbes a Tacna (Dostert et al., 2012). Varias investigaciones encontraron que P. pallida, presenta actividad antimicro biana frente a una amplia variedad de microorganismos (Sandoval et al., 2016; Camacho, 2017; Vásquez, 2017; Cárde nas et al., 2017; Gonzales-Barrón et al., 2020; Enríquez Díaz et al., 2018; Castro, 2017; Bussmann et al., 2011; Bussmann et al., 2009; Grillo et al., 2018), entre ellos Escherichia coli (Sandoval et al., 2016; Gonzales-Barrón et al., 2020; Cas tro, 2017). En Perú se ha hecho variada investigación sobre las propiedades an timicrobianas de las distintas partes de P. pallida, pero muy poca investigación sobre las propiedades funcionales de la algarrobina a pesar de ser un alimento bastante apreciado, barato y de fácil ac ceso, en especial en el norte del Perú.
Algunas cepas de E. coli se asocian a múltiples enfermedades: infecciones del tracto urinario (ITU), inflamación de las meninges, sepsis, colitis hemorrágica, entre otras (Picazo et al., 2016). En Perú, la diarrea continúa siendo la tercera cau sa de muerte en niños menores de 5 años, pese a los avances recientes en el manejo y prevención de esta enfermedad, sien do Campylobacter y E. coli los patógenos más prevalentes a nivel comunitario en niños (Riveros et al., 2015). Javad Sha rifi-Rad et al. (2019) desarrollaron una amplia revisión bibliográfica sobre estu dios que abordan la composición quími ca y las propiedades farmacológicas de las plantas del género Prosopis. Los au tores concluyeron que estas plantas tie nen efectos benéficos para la salud muy prometedores aunque hay muy pocos estudios desarrollados para apoyar efec tivamente sus efectos farmacológicos, y que se necesitan más estudios preclínicos para dar soporte adicional y confirmar los efectos biológicos de las plantas del género Prosopis. Erika Castro (2017) se planteó demostrar si la miel de Apis me llifera y la algarrobina de Prosopis pallida presentan actividad antibacteriana fren te a los coliformes hallados en quesillos preparados de manera artesanal y que eran vendidos en el mercado “La Unión” de la ciudad de Trujillo, Departamento de La Libertad, Perú. Encontró que la al garrobina inhibió la multiplicación de las bacterias coliformes en todas las concentraciones trabajadas; concluyendo que la algarrobina tiene efecto antibacteriano frente a los coliformes y que este efecto es mayor que el de la miel de abejas.
El presente estudio tiene el objetivo de evaluar in vitro el efecto de la algarrobi na de Prosopis pallida frente a Escheri chia coli.
Material y Método
Se desarrolló una investigación de tipo intervención, analítico, prospectivo, longitudinal que respondió a un diseño experimental. Se emplearon cultivos de cepas de Escherichia coli ATCC® 25922™ y algarrobina certificada con registro sani tario y producida a partir de los frutos de Prosopis pallida “algarrobo”, proveniente de Piura-Perú y agua; con una concen tración final de 78° Brix.
Se preparó agar Mueller Hinton, agar eosina azul de metileno, caldo triptica sa soya, TSI, LIA, Citrato de Simmons, MIO y agua peptonada. El desarrollo de las técnicas se aplicó considerando las pruebas de laboratorio convencionales usadas en microbiología. Las cepas de Escherichia coli ATCC® 25922™ se reac tivaron poniendo en contacto el hisopo que contenía la cepa con caldo tripticasa soya, luego se sembró por estría simple, usando el hisopo, una placa Petri con agar Müeller Hinton, finalmente se in cubó la placa sembrada por 24 horas a 37 °C. La pureza e identidad del cultivo se confirmó sembrando en agar Eosina Azul de metileno (EMB) y en los me dios diferenciales: TSI, LIA, Citrato de Simmons y MIO. Este paso se hizo por triplicado. Se preparó el estándar 0,5 de la escala de Mc Farland basándose en el Manual del Instituto Nacional de Salud (INS) (Sacsaquispe et al., 2020).
Elaboración de discos con algarrobina
Se elaboraron discos de papel filtro Whatman N°1 de 6 mm de diámetro con la ayuda de un perforador convencional, que luego se esterilizaron en autoclave por 15 minutos a 121°C, posteriormente fueron guardados en un frasco con tapa previamente esterilizado.
Se colocó 10 mL aproximadamente de algarrobina en una placa Petri estéril. Después se sumergieron los discos de papel filtro por grupos de 10-15 discos en esta placa. Se dejaron por 5 minu tos y luego se pusieron a secar en estu fa a 37 °C por 24 horas. Finalmente se guardaron en frascos estériles con tapa.
Preparación del inóculo
Se preparó a partir de cultivo de 24 ho ras conteniendo Escherichia coli ATCC® 25922™ provenientes de placas Petri con agar Mueller Hinton.
Se recolectó una azada por separado y se prepararon suspensiones en tubos de ensayo conteniendo 5 mL de agua peptonada al 0,1%, las cuales se ajusta ron al 0,5 de la escala de McFarland. De esta manera se tuvo una suspensión con 1,5x108 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL).
Demostración de la actividad antibacteriana
El método utilizado fue el de difusión en agar siguiendo las pautas propuestas por el Clinical and Laboratory Standards Institute (2019). Cada experiencia se re pitió 5 veces.
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Se prepararon soluciones de algarrobi na en agua destilada estéril al 75%, 50%, 25% y 12,5%. Se impregnaron sendos discos de papel filtro con 10 μL de cada una de las soluciones de algarrobina de Prosopis pallida, y luego se dejaron secar debidamente protegidos para evitar contaminaciones. Se rotularon seis (6) pla cas Petri conteniendo agar Müeller Hin ton en volumen apropiado para que el espesor sea de 4 mm sobre una superficie horizontal y se sembró por distribución uniforme la suspensión de Escherichia coli ATCC® 25922™ con turbidez equiva lente al tubo 0,5 de la escala Mac Far land. Se separó una (1) placa Petri para que sirviera de control positivo de cre cimiento bacteriano. En cada una de las cinco (5) placas restantes se colocaron equidistantes cinco discos de papel filtro impregnados con algarrobina al 100%, 75%, 50%, 25% y 12,5% respectivamente. Se incubaron todas las placas Petri a 37 °C durante 24 horas, tiempo después del cual se observaron las placas buscando la presencia de halos de inhibición, cuyos diámetros se midieron utilizando una regla milimetrada. Cada experiencia de repitió 5 veces.
Análisis estadístico
Los datos se procesaron en el paque te de software denominado SPSS v.26, para realizar los siguientes análisis: Ob tención de medidas descriptivas como la media aritmética, varianza, error y la desviación estándar para variables cuan titativas; comparación de medias con análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de confianza del 95%; prueba HSD de Tukey para evaluar si hay diferencia significativa entre los promedios de los diámetros de los halos de inhibición formados durante la determinación de la concentración mínima inhibitoria. Se consideraron resultados significativos aquellos valores de p<0,05
Aspectos éticos
En todo momento, se tuvieron presen tes los principios éticos para proteger el medio ambiente y la salud, procediendo responsablemente en la eliminación de los materiales conteniendo microor ganismos patógenos, los cuales fueron previamente esterilizados en autoclave; siguiendo lo que ordena la Ley General del Ambiente Nº 28611 (Ministerio del Ambiente, 2013).
Resultados
Demostración de la actividad antibacte riana de la algarrobina frente a Escheri chia coli
Los resultados obtenidos muestran que la algarrobina presentaba efecto antibacteriano contra Escherichia coli ATCC® 25922™ en el 100% de las pruebas. El diámetro promedio de los halos de in hibición fue de 12,48 ± 0,71 mm, con un error estándar de 0.14 (Tabla 1).
Tabla 1: Medidas estadísticas descriptivas de los halos de inhibición ocasionados por la inte racción de la algarrobina con Escherichia coli. Table 1: Descriptive statistical measures of the inhibition halos caused by the interaction of algarrobin with Escherichia coli.
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la algarrobina frente a Escherichia coli
Los diámetros de los halos de inhibición que se formaron al final de los ensayos se presentan con detalle en la Tabla 2.
Tabla 2: Diámetro de los halos de inhibición expresado en mm formados por la interacción de la algarrobina a diferentes concentraciones con Escherichia coli. Table 2: Diameter of the inhibition halos expressed in mm formed by the interaction of algarrobin at different concentrations with Escherichia coli
Se obtuvo un diámetro promedio de 12,6±0,55 mm con algarrobina pura, 11,4±0,55 mm con algarrobina concen trada al 75%, 8,2±0,84 mm con algarro bina concentrada al 50% y no se observó halo de inhibición cuando se utilizó al garrobina al 25% y 12,5% de concentra ción (Tabla 3).
Tabla 3: Medidas estadísticas descriptivas de los halos de inhibición, expresados en mm, oca sionados por la interacción de la algarrobina a diferentes concentraciones frente a Escherichia coli Table 3: Descriptive statistical measurements of the inhibition halos, expressed in mm, caused by the interaction of algarrobin at different concentrations against Escherichia coli
Los resultados muestran que el efec to inhibitorio varía acorde al grado de concentración de la algarrobina, tan es así que el efecto inhibitorio va disminu yendo conforme va bajando la concen tración de la algarrobina, y cae a cero cuando la concentración de la algarrobi na alcanza el 25% o menos, por lo que la concentración mínima inhibitoria de algarrobina frente a Escherichia coli es del 50%.
El análisis de varianza muestra que las diferencias en el grado de inhibición de Escherichia coli cuando es sometida a tratamiento con diferentes concentra ciones de algarrobina son significativas (Tabla 4).
Tabla 4: Análisis de varianza (ANOVA) entre los diámetros de los halos de inhibición ocasio nados por la interacción de la algarrobina a diferentes concentraciones con Escherichia coli ATCC® 25922™ Table 4: Analysis of variance (ANOVA) between the diameters of the inhibition halos caused by the interaction of algarrobin at different concentrations with Escherichia coli ATCC® 25922™
También existen diferencias signifi cativas con un margen de error del 1% entre los grados de inhibición de Esche richia coli ATCC® 25922™ sometida a la acción de la algarrobina cuando se com paran otras combinaciones de concen traciones, excepto cuando se compara la inhibición producida por la algarrobina al 25% y 12,5%, entre las que no existe diferencia significativa (Tabla 5).
Discusión
El método utilizado en esta investigación para evaluar la actividad antimicrobiana fue el de difusión en agar, el cual es ampliamente utilizado para evaluar la acti vidad antimicrobiana de extractos y está diseñado específicamente para bacterias de crecimiento rápido como Escherichia coli (Herrera, 1999).
Los resultados de esta investigación muestran que la algarrobina de Prosopis pallida sí presenta efecto antibacteriano contra Escherichia coli. Estos resultados eran los esperados debido a que otras investigaciones demostraron que Proso pis pallida presenta actividad bacteriana frente a Escherichia coli (Sandoval et al., 2016; Gonzales-Barrón et al., 2020; Cas tro, 2017).
Erika Castro (2017) concluyó que la algarrobina de Prosopis pallida presenta actividad antibacteriana frente a los coli formes hallados en quesillos preparados de manera artesanal. Los coliformes son un grupo amplio de bacterias que pue den hallarse contaminando alimentos, entre las cuales se encuentra Escherichia coli, por ello consideramos que sus resul tados indican que la algarrobina presenta actividad antimicrobiana contra coliformes, pero no indica frente a cuáles bacte rias. Con nuestra investigación estamos demostrando que la algarrobina inhibe a Escherichia coli. Estudios posteriores podrían enfocarse a determinar contra qué otros coliformes presenta actividad antimicrobiana la algarrobina.
La actividad antimicrobiana de la al garrobina de Prosopis pallida podría de berse a la presencia de polifenoles, flavo noides y taninos (Cárdenas, 2017). Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios abundantes en las plantas, a los cuales se les atribuyen propiedades antibacterianas y antioxidantes (Doroteo et al., 2013). Los polifenoles reportados en Prosopis pallida son el ácido gálico, catequinas, taninos condensados, etc. (Flor, 2013). Los mecanismos que se cree que son responsables de la toxicidad de los fenoles contra los microorganismos incluyen la inhibición de la enzima be taglucano sintasa por los compuestos oxidados, posiblemente a través de la re acción con grupos sulfhidrilo o a través de interacciones no específicas con las proteínas (Mason, 1987).
Muchas preparaciones fitoquími cas con alto contenido de flavonoides han reportado actividad antibacteriana (Cushnie, 2005). Varias investigaciones han demostrado que la actividad antio xidante de los flavonoides se debe a una combinación de sus propiedades como quelante de hierro y captadora de radi cales libres, además de su cualidad para inhibir las oxidasas: lipooxigenasa, ci clooxigenasa, mieloperoxidasa y la xan tina oxidasa; lo cual evita la formación de especies reactivas de oxígeno y de hidroxiperóxidos orgánicos (Escamilla et al., 2009; Pérez, 2003). Escherichia coli utiliza su peroxidasa para sobrevivir al estrés oxidativo (Agranoff et al., 1998), la cual, al ser inhibida, podría afectar el crecimiento de esta bacteria. Diaz (2012) afirma que “el ácido gálico, las catequi nas y otros compuestos fenólicos, pre sentes a la algarrobina, actúan sobre las membranas celulares, inhibiendo los 18 canales iónicos”. García (2012) comple menta la explicación sobre el mecanismo de acción antibacteriana de los polifeno les afirmando que “los compuestos fe nólicos pueden alterar las membranas y pared celular de las bacterias e inhibir la síntesis de enzimas, con la consecuente salida de proteínas, ácidos nucleicos, io nes inorgánicos y otros elementos vita les para la célula bacteriana, con lo que conduciría a la muerte bacteriana”. Ca macho (2017) reportó que los productos de Prosopis pallida no presentaban acti vidad antibacteriana contra Escherichia coli. Este resultado opuesto al encontra do por nosotros podría deberse a que Camacho trabajó con Escherichia coli ATCC® 8739™, que en la página oficial de ATCC (www.atcc.org) se reporta como una cepa acondicionada para ensayos de biorresistencia, a diferencia de la cepa ATCC® 25922™ que la reportan como una cepa acondicionada para pruebas de sus ceptibilidad antimicrobiana por discos. Bussmann et al. (2009) tampoco encon traron actividad contra Escherichia coli. Ellos trabajaron con Escherichia coli ais lada de paciente con infección urinaria. Milagros Yábar et al. (2017) encontraron que el 45,9% de las Escherichia coli aisla das de pacientes con infección urinaria eran multirresistentes, es decir, habían desarrollado mecanismos para resistir a tratamientos con sustancias antibacte rianas. Este hallazgo podría explicar este resultado opuesto al encontrado por no sotros.
En conclusión, la algarrobina de Pro sopis pallida presenta efecto antibac teriano sobre Escherichia coli, con una concentración mínima inhibitoria de 50% V/V. La magnitud de la inhibición bacteriana varía en relación directa a la concentración de la algarrobina con un margen de error del 5%. No hay diferen cia estadísticamente significativa entre el grado de inhibición de Escherichia coli cuando se emplea algarrobina al 100% o algarrobina al 75%, cuando el intervalo de confianza es 99%.
