Yoshihiko Soga describe para SIIC su artículo editado en Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology 31(4):271-276, diciembre 2013

Okayama, Japón (especial para SIIC)
La proteína catiónica de los eosinófilos (PCE) es una de las proteínas liberadas en el contexto de la desgranulación de los eosinófilos, y se detecta en las lesiones inflamatorias alérgicas. Por lo tanto, la PCE, con actividad citotóxica, ha sido relacionada con la inflamación alérgica. Esta citotoxicidad tiene, esencialmente, un efecto antiparasitario y bactericida sobre las enfermedades infecciosas. Sin embargo, se ha informado que la PCE también ejerce citotoxicidad sobre las células del huésped, por ejemplo contra el epitelio de la tráquea. Por otra parte, estudios recientes demostraron que la PCE no induce muerte celular, aunque inhibe el crecimiento de las células cancerígenas. En un estudio previo demostramos que la PCE humana incrementa la diferenciación de las células miocárdicas neonatales murinas y la formación de fibras de estrés en los fibroblastos de ratones Balb/c 3T3; en cambio, los efectos de la PCE humana sobre los fibroblastos humanos no se conocen. Si bien los modelos murinos son útiles para conocer la fisiología de los eosinófilos in vivo, los modelos con roedores difieren de aquellos con seres humanos, en distintos aspectos importantes. Por ejemplo, los eosinófilos de la mucosa de las vías aéreas, en los modelos murinos de provocación con alérgenos, no muestran indicios de desgranulación. Por lo tanto, el papel de la PCE humana podría ser diferente del observado en los roedores; en este sentido, es importante evaluar los efectos de la PCE humana sobre los fibroblastos de los seres humanos. El presente trabajo se realizó con el objetivo de analizar los efectos de la PCE humana sobre la expresión de citoquinas en fibroblastos de dermis humana normal (FDHN), mediante la valoración del crecimiento celular. Además, mediante ensayo de matrices proteicas se valoró la expresión de citoquinas por los FDHN estimulados con PCE que podrían modificar el crecimiento celular. La PCE humana recombinante (PCEhr) en su forma madura, sin el péptido de señal de secreción, se expresó en bacterias y se preparó tal como ha sido descripto con anterioridad. Los FDHN adultos, disponibles comercialmente, se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (MEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 10 µg/ml de gentamicina a 37ºC, en ambiente humidificado con CO2 al 5%. Todos los estudios in vitro con FDHN se realizaron entre los pasajes 5 y 9. Los FDHN se colocaron en placas de ocho pocillos con MEM, con 10% de SFB y 10 µg/ml de gentamicina, en concentración de 5 x 103 células por pocillo. Luego de 24 horas, el medio de cultivo se cambió por MEM con SFB al 0.5%, sin gentamicina. Luego de otras 24 horas, las células fueron estimuladas con PCEhr (0 a 10 µg/ml) durante 24 horas. Las células se tiñeron con hematoxilina y eosina; se realizó observación microscópica de las células, expuestas o no a PCEhr (0 a 10 µg/ml). El recuento de células se efectuó con aumento de 100 x. Se contaron cinco campos separados por pocillo y se utilizaron cinco pocillos para cada grupo de concentración de PCRhr. Se calcularon los promedios y las desviaciones estándares (DE) de tres experimentos independientes. El crecimiento celular de los FDHN se determinó mediante observación microscópica y recuento celular de los FDHN estimulados con PCEhr. Los FDHN, en concentración de 1.0 x 105 células por pocillo, se colocaron en placas de seis pocillos con MEM, con 10% de SFB y gentamicina, en concentración de 10 µg/ml. Luego de 24 horas, el medio se cambió por MEM con 0.5% de SFB sin gentamicina. Luego de otras 24 horas, las células fueron estimuladas con 100 ng/ml de PCErh durante 24 horas, o no lo fueron. Se obtuvieron los sobrenadantes de los cultivos y se determinaron los niveles de citoquinas mediante ensayo con anticuerpos en membrana (human cytoquine antibody array C series 1000), el cual consiste en 120 anticuerpos contra citoquinas y quimioquinas diferentes, colocados en membrana por duplicado, según las instrucciones del fabricante. Se detectó la intensidad de las señales, por medio del programa computarizado ImageJ. Los niveles de intensidad relativa de las citoquinas se normalizaron según las cantidades de referencia presentes en el control positivo en cada membrana, sobre la base de los niveles promedio de intensidad y el promedio de la intensidad del control positivo; los resultados se expresaron como porcentajes. Las sensibilidades para las distintas citoquinas analizadas fueron proporcionadas por el fabricante. Se calcularon los valores promedio con DE para tres experimentos independientes. La PCE no ejerció efectos citotóxicos sobre los FDHN; en cambio se asoció con crecimiento aumentado de estas células. Se comprobó un incremento del recuento celular, dependiente de la dosis. La concentración máxima de PCEhr que aumentó el número de células en 1.56 veces fue de 100 ng/ml; los valores fueron estadísticamente diferentes de los que se observaron en los cultivos sin estimulación con PCE (ANOVA/prueba de Scheffe, p < 0.05). Los ensayos de matrices indicaron que el factor neurotrófico ciliar (ciliary neurotrophic factor [CNTF]), el péptido de activación de neutrófilos (neutrophil activating peptide [NAP-2]) y la neurotrofina (NT-3) estuvieron sustancialmente aumentados en los FDHN estimulados con 100 ng/ml de PCE, en comparación con aquellos sin estimulación (prueba de Welch, p < 0.05). Los resultados del presente estudio indican que la PCE no es citotóxica contra los FDHN; sin embargo induce su crecimiento, un hallazgo concordante con las observaciones que se obtuvieron previamente en fibroblastos de ratones Balb/c 3T3. La mayor expresión de CNTF, NAP-2 y NT podría explicar la participación de la PCE en la inflamación alérgica y la activación del crecimiento de FDHN. De hecho, si bien el incremento no fue particularmente elevado (de sólo 1.56 veces), se comprobó un aumento del recuento celular mediante la estimulación con PCE. Los hallazgos, en relación con la actividad de la PCE, sugieren la participación de la PCE en la fibrosis y en la inflamación alérgica leve. Otras moléculas cuya expresión aumentó por debajo del nivel de significación estadística en el análisis de matrices también podrían contribuir a este fenómeno, de manera conjunta. Nuestros resultados indican que los niveles de producción de las principales citoquinas proinflamatorias, como la interleuquina (IL) 1-beta, la IL-6 y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a, por su sigla en inglés) no aumentaron, de manera significativa, con la estimulación con PCE. Los resultados en conjunto indican que la PCE no es citotóxica, pero que induce una fuerte reacción inflamatoria en los FDHN. En conclusión, la PCE no es citotóxica pero se asocia con crecimiento aumentado de los FDHN. Los resultados del análisis de matrices indican que el CNTF, el NAP-2 y la NT-3 podrían estar involucrados en el crecimiento de los FDHN. Estos hallazgos contribuirán a esclarecer el papel de la PCE e n la inflamación alérgica.