INTRODUCCION
La flora nativa es una importante fuente de alimentos, lubricantes, resinas, ceras, colorantes, fibras, energía, sustancias aromáticas y medicinales, con valor ornamental y ecológico. Sin embargo, sólo unas pocas especies silvestres y subutilizadas han sido evaluadas por sus potenciales agronómico y medicinal en el mundo (Iriondo, 2001; Alonso y Desmarchelier, 2006). El género Berberis en Argentina está representado con 26 especies (Orsi, 1984; Landrum, 1999; Zuloaga, Morrone y Belgrano, 2008) distribuidas en dos grandes áreas, la selva subtropical Tucumano Oranense en donde B. mikuna es la especie más común (Job, 1942) y la Estepa patagónica junto con el Bosque subantártico (Orsi, 1984). Las especies del género Berberis tienen variadas propiedades nutracéuticas, es decir nutricionales y terapéuticas, por tal motivo se han estudiado los contenidos de fenoles en las hojas (Koncic Kremer, Karlovic y Kosalec, 2010), en las raíces (Surveswaran, Cai, Corke y Sun, 2007; Tomosaka, Chin, Salim, Keller, Chai y Douglas, 2008) y en las frutas (Albrecht, Pelaran, Rojas, Albesa y Eraso, 2010; Ruiz etal., 2010; Arena, 2016).
El estudio de las poblaciones naturales es importante dado que se puede interpretar la plasticidad fenotípica de la especie. Esta puede estar presente en diferentes órganos y funciones de la accesión y podría observarse a través de sus cambios en la fenología, la morfología, la anatomía, la composición y las tres funciones principales que son básicas para el crecimiento y desarrollo de la accesión como la fotosíntesis, la respiración y la transpiración (Atlan, Hornoy, Delerue, Gonzalez, Pierre y Tarayre, 2015). Esta plasticidad es la que les permite a las accesiones una rápida respuesta a los cambios climáticos £ol¡c, Rakonjac, Zec, Nikolic y Fotiric Aksic, 2012) y resulta de tal relevancia como para ser considerada en estudios meteorológicos. Sin embargo, poco se sabe sobre cómo la geografía, la genética y el ambiente afectan estas características (Lankinen, Madjidian y Andersson, 2017). Estudios muy recientes demuestran cómo el ambiente (luz, temperatura, humedad) afectan los rasgos morfológicos y el éxito reproductivo de accesiones de Berberis microphylla crecidas en tres ambientes diferentes en Tierra del Fuego (Arena, Lencinas y Radice, 2018). Según estos estudios, la sombra en particular disminuye en las ramas el número de yemas según el total de nudos, el número de yemas mixtas y el número de frutos según la longitud de la rama (Radice y Arena, 2018). Además, aquellas condiciones que favorecieron el peso, el tamaño y el contenido de antocianinas en las frutas de calafate fueron menos beneficiosas para las variables productivas como el número y el peso de la fruta fresca según la longitud del brote (Arena, M. E. comunicación personal, correo electrónico recibido el 20 de febrero de 2020).
La especie B. mikuna además de la berberina en la madera, que es la sustancia utilizada para teñir lanas y telas de color amarillo y que ha sido revalorizada en los últimos años por el grupo WARMIPURA de Tafí del Valle (Pastrana, 2016), posee un fruto violáceo interesante en sabor y tamaño.
Tanto por su aplicación en la industria tintórea como por las posibles propiedades nutracéuticas de la fruta es importante conocer todos los procesos fisiológicos de crecimiento y reproducción relacionados con la formación y maduración del fruto. Algunos aspectos de la fisiología de la especie han sido ya estudiados (Ceribelli, 2018) como también la conservación del polen (Mati, 2019) y los cambios histológicos que ocurren durante esa conservación (Radice, Galati, Zarlavsky y Arena, 2020). El objetivo de este trabajo es presentar la fenología de floración, y evaluar la variabilidad de algunas características morfo fisiológicas y bioquímicas de las flores y frutos entre las accesiones y entre los dos sitios de la región Alto de Medina (Tucumán).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y sitios de muestreo
Se seleccionaron arbustos de B. mikuna crecidos de manera espontánea en dos sitios considerados áreas de reserva natural de la localidad de Alto de Medina (Tucumán), denominados Chacra Dantur (CHD) (n = 5-6) y La Quebrada (QB) (n = 10 11). El criterio de selección fue la diversidad de ambientes respecto al relieve, la insolación y el clima. Si bien entre los dos sitios había menos de 2 km de distancia, los micrositios creados por la pendiente, la exposición geográfica y las especies acompañantes crearon situaciones ambientales muy diversas. El sitio CHD se caracterizó por una pronunciada pendiente y exposición oeste enfrentada a la cadena de cerros que marcan el límite geográfico con Salta. En consecuencia, la incidencia de la luz solar fue siempre menor que la del sitio QB y con diferencias de temperaturas entre las accesiones ubicadas en la parte alta y baja de la ladera que difieren en 90 m de desnivel aproximadamente. Por otro lado, las accesiones del sitio QB fueron seleccionadas en una situación de menor desnivel (40 m aproximadamente) y el sitio tuvo exposición este, es decir con mejor insolación contando además con la cercanía de un arroyo natural que aumentó la humedad ambiente. Los dos sitios pertenecen a la región protegida del bosque natural del Podocarpus parlatorei por lo cual no existe la intervención antrópica.
Las accesiones seleccionadas fueron identificadas satelitalmente para su seguimiento posterior (Tabla 1).
Medidas florales y fenología de floración
Durante la primavera del año 2017 se registró para cada una de las accesiones seleccionadas: el número de flores por inflorescencia (n=10) y el peso seco de las flores (n= 20). Se evaluó también el tamaño del grano de polen (n=20) y la germinación in vitro de los granos de polen (n= 500) según metodología de Radice y Arena (2016). Los pistilos fueron tomados de capullos en fase de pre antesis o código 59, según BBCH (escala fenológica universal) (Arena, Giordani y Radice, 2013) para ser escaneados y medidos a través del programa UTHSCSA Image Tool software 3.0 (Wilcox, D., Dove, B., McDavid, D. y Greer, D., 1996). Posteriormente se evaluó el número de óvulos por pistilo de acuerdo con Arena et al. (2018). La fenología de floración fue tomada sobre las accesiones crecidas en sitio CHD durante los años 2014, 2015 y 2016 y en la primavera del año 2017 en todas las accesiones muestreadas de ambos sitios. Se consideraron las fases de capullo, antesis, marchitamiento y fruto formado las cuales se evaluaron en proporción respecto del total de yemas florales presentes según la metodología de Radice and Arena (2018).
Evaluación de los frutos
La evaluación física de los frutos (n=10 por accesión) se realizó según Arena (2016). Se registró el peso fresco, peso seco, diámetro ecuatorial, diámetro polar, humedad, coloración de la piel, número de semillas, peso seco de semillas y la proporción del peso seco de las semillas respecto al peso seco del fruto. La evaluación química (n=3 por accesión, 5 g de frutos en cada muestra) se llevó a cabo según Arena, Postemsky y Curvetto (2012) y se evaluó el contenido de sólidos solubles, la concentración de antocianinas expresada en mg cianidina-3-glucósido/100 g peso fresco y la concentración de fenoles totales expresada como mg ácido tánico/100 g peso fresco.
Análisis estadísticos
Los datos de la caracterización de las flores (número de flores por inflorescencia, peso seco de las flores, tamaño del grano de polen, número de óvulos y dimensiones de los pistilos) y la caracterización físico-química de los frutos se analizaron mediante ANOVA (p< 0,05). El modelo estadístico utilizado fue un modelo de efectos fijos con el factor accesión anidado al sitio. Sin embargo, las variables relativas a las propiedades físicas y químicas de los frutos se analizaron solamente en función del factor accesión dado que en el sitio CHD sólo dos accesiones produjeron frutos en cantidad suficiente para la obtención de muestras representativas, debido a cuestiones climáticas. Las medias se compararon a través de la prueba de Tukey (p< 0,05). Se efectuaron correlaciones estadísticas entre pares de variables químicas de los frutos. La germinación del grano de polen se analizó a través de la prueba de x2 y las diferencias entre accesiones con la prueba Post Hoc.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El número de flores diferenciadas por racimo no fue significativamente diferente entre sitios (p= 0,976), pero sí entre las accesiones de QB (p<0,001) (Figura 1). En QB, en las accesiones 162, 164, 165 y 182, se registraron 11 flores/ racimo mientras que en la accesión 185 sólo 6,4 flores/racimo cuyo valor fue significativamente inferior a todo el resto de las accesiones testeadas. Por otro lado, el peso seco de las inflorescencias no presentó diferencias significativas entre sitios (p= 0,070), pero sí entre las accesiones dentro de cada sitio (p< 0,001), aunque sin correlación entre esta medida y el número de flores/inflorescencia, especialmente para el sitio CHD (Figura 2). En CHD los máximos valores de peso seco de las inflorescencias se observaron en las accesiones 240 y 255 (5,6 y 5,8 mg respectivamente), mientras que el mínimo peso seco de las inflorescencias se encontró en la accesión 250 (4,3 mg). En la QB, la accesión 163, con inflorescencias de 6,1 mg de peso, fue significativamente superior a las accesiones 184, 185 y 190 (4 mg por inflorescencia) (Figura 2). La variabilidad encontrada en el peso seco de las inflorescencias dentro de cada sitio podría deberse a diferentes causas como la poca disponibilidad de hidratos de carbono de sus reservas, competencia entre crecimiento vegetativo y reproductivo como también a diferencias génicas entre los diversos germoplasmas estudiados (Arena et al., 2018). Un mayor número de flores por racimo podría ser una desventaja sobre todo para aquellas especies que son polinizadas por Insectos como es el caso de Berberis. Un mayor número de flores por racimo aumenta la oferta de flores, pero a su vez disminuye el número de visitas por flor lo cual resulta en menor cantidad de polen depositado en el estigma (Akter, Biella y Klecka, 2017).
El número de óvulos por pistilo no mostró diferencias significativas entre los dos sitios (p= 0,106) pero sí se encontraron diferencias entre accesiones sólo para el sitio QB (p< 0,001) (Tabla 2). En este sitio, el número de óvulos por pistilo varió entre 3 (accesión 180) y 4,9 (accesión 184). Los valores observados no mostraron grandes dispersiones en esta variable a diferencia de lo observado en la especie patagónica B. microphylla, en la cual se registraron variaciones entre 5,93 y 12,48 (Arena etal., 2018).
El tamaño del pistilo mostró diferencias muy significativas. El área del pistilo fue diferente entre los dos sitios (p= 0,01) y entre las accesiones dentro de cada sitio (p= 0,001). Los valores en CHD variaron entre 4,2 mm2 (accesión 235), y 6,8 mm2 (accesión 240), mientras que en QB variaron entre 3,5 mm2 (accesión 165) y 6,1 a 6,68 mm2 (accesiones 163, 164 y 172) (Tabla 2). El perímetro de los pistilos también mostró resultados similares. Para esta variable se detectaron efectos significativos de sitio (p= 0,007) y de accesión (p= 0,001). Los máximos valores en CHD fueron de 13,6 mm (accesión 240), mientras que en QB los máximos valores oscilaron entre 12,8 a 13, 3 mm (accesiones 136, 134 y 172) (Tabla 2). Estas diferencias de tamaño se traducen también en una diferencia de forma. Así, si bien en el eje menor de los pistilos no se encontraron diferencias significativas entre los sitios (p= 0,161), las mismas fueron significativas entre las accesiones en cada sitio (p<0,001), mientras que en el eje mayor de los pistilos las diferencias fueron significativas entre los sitios y accesiones (p< 0,001 para ambas). Las medidas de la altura y ancho del pistilo demuestran que las diferencias significativas más grandes fueron las del eje menor, es decir que en CHD el eje menor varió entre 1,2 mm (accesión 235) y 1,8 mm (accesión 240), mientras que en QB la accesión 185 presentó el pistilo más delgado (1,1 mm) y las accesiones 163, 164 y 172 fueron las que presentaron los pistilos más anchos (1,8 mm) (Figura 3B). Respecto del alto de los pistilos, en CHD las accesiones 235, 250 y 255 (3,9 a 4,2 mm) fueron las que resultaron con pistilos más cortos, mientras que los pistilos de la accesión 240 los más largos (4,9 mm) (Figura 3A). En QB, los pistilos más cortos se observaron en las accesiones 155, 165, 180, 182, 184 y 185 (3,4 a 3,8 mm), mientras que los más largos fueron observados en las accesiones 164, 172 y 190 (4,8 a 4,6 mm). El tamaño de la flor como el del ovario tiene una estrecha correlación con el tamaño final del fruto. Esto ha sido observado en varias especies como el duraznero (Prunus pérsica), el arándano rojo (Vaccinium asheí), el olivo (Olea europaea) y la granada (Púnica granatum) (Wetzstein, Weiguang y Porter, 2013).
La fenología de floración observada entre el grupo de accesiones crecidas en el sitio CHD entre las primaveras de 2014 y 2016 fue notablemente diferente (Figura 4). La fase de antesis de las flores se inició el 11 de octubre del 2014 mientras queen el 2015, unos días antes del 24 de octubre. Para el año 2016, el 15 de octubre se observó un 30 % de flores en antesis lo cual indica que esta fase podría haberse iniciado la primera semana de octubre. Por otro lado, se puede observar cómo la presencia de frutos formados fue diferente observándose la mayor diferencia entre los años 2015, con un 15 % de frutos formados el 29 de noviembre, y 2016, con un 10 % el 23 de octubre (Figura 4). Además, la evolución de las fases capullo, antesis, marchitamiento y fruto, evaluada de manera proporcional, fue muy diferente según la accesión estudiada tal como se muestra en la Figura 5. En la accesión 230 se observó una fase de antesis incipiente mientras que en la 235, una fase final de antesis con un 79 % de frutos formados. La floración de las especies frutales silvestres puede ocurrir en diferentes momentos por diferencias genéticas, sin embargo, el comienzo, la duracióny la intensidad del período de floración están fuertemente influenciados por factores ecológicos (Nyéki y Soltész, 1996). El período de latencia y las necesidades de calor determinan el inicio de la floración, mientras que la temperatura, la radiación solar, la humedad y las condiciones de heladas influyen en la plena floración y los días totales del período de la floración (Arena et al., 2018). En estudios realizados con otros Berberis, se observó también, diferencias en la evolución de las fases entre germoplasmas debido a las variaciones genéticas existentes (Giordani et al., 2017).
El diámetro del grano de polen presentó diferencias significativas entre los sitios (p= 0,045) y entre accesiones dentro de cada sitio (p< 0,001). En CHD, el diámetro del grano de polen varió entre 38,9 y 45,5 |um entre las accesiones 245 y 255, respectivamente (Tabla 3), mientras que en QB varió entre 38,0 y 44,5 |um entre las accesiones 162 y 164, respectivamente. Los granos de polen resultaron muy similares en forma y dimensiones a los ya observados en las flores de calafate (B. microphylla) (Radice y Arena, 2016). Respecto de la germinación, los granos de polen de las accesiones 164, 180 y 235 fueron los que se diferenciaron significativamente del resto por sus valores mayores (80 %) (Figura 6). Sin embargo, en las accesiones 155, 163 y 165 la germinación resultó con valores significativamente más bajos que todo el resto pero mayores que 50 %. Estos resultados permiten inferir que la especie no posee problemas de andro-esterilidad (Nyéki y Soltész, 1996). Una eficiente fecundación está estrechamente relacionada con la viabilidad del polen y precisamente se considera el 50 % de viabilidad de los granos de polen como criterio base para la selección de ejemplares donores de polen utilizados en planes de mejoramiento de Berberis (Urquieta, 2010).
Como era previsible, la forma de los frutos maduros fue significativamente diferente entre las diferentes accesiones estudiadas. Respecto de las propiedades físicas de los frutos se observaron diferencias significativas en las variables de peso fresco, peso seco y tamaño (diámetro ecuatorial y polar), color, humedad, número y peso seco de semillas entre las accesiones (Tabla 4). Sin embargo, la relación porcentual de las semillas con el fruto (PSS/PSF) no presentó diferencias significativas. La accesión 163 produjo frutos grandes y más pesados en términos de peso fresco con respecto al resto de las accesiones, a excepción de las accesiones 172 y 180. Además, si bien no hubo diferencias en la relación porcentual de los pesos de fruto y semilla entre accesiones, en la accesión 163 se obtuvo un valor intermedio respecto del resto, lo cual podría ser beneficioso dado que la parte importante del fruto es la pulpa (Tabla 4). La accesión 185 produjo frutos más pequeños, pero sin diferencias significativas con los medidos en las accesiones 155, 184 y 186. Los frutos presentaron un alto contenido de humedad (> 60 %) lo cual los hace muy jugosos destacándose en particular los de la accesión 172 con un 76 % de humedad (Tabla 4). El número de semillas por fruto varió entre 2,7 y 4,2. Estos valores fueron significativamente inferiores a los observados en los frutos de B. microphylla (Arena, Giordani y Radice, 2011). Sin embargo, en la especie B. mikuna, las semillas son de mayor tamaño y constituyen entre el 43 y 68 % del peso total del fruto (Tabla 4).
Las propiedades químicas de los frutos también mostraron diferencias significativas entre las accesiones (Tabla 5). La accesión 184 registró el valor más alto de sólidos solubles (21 °Brix), pero sin diferenciarse significativamente de la accesión 182. Contrariamente las accesiones 162 y 235 mostraron valores muy bajos de sólidos solubles (11,5 y 12,0 °Brix, respectivamente), sin diferenciarse significativamente de las accesiones 172, 180, 185 y 245. Los frutos de la accesión 180 presentaron la mayor concentración de antocianinas (675,9 mg cianidina-3-glucósido/100 g peso fresco), aunque sin diferencias significativas con respecto a los frutos de la accesión 182. Los frutos de la accesión 180 también presentaron la mayor concentración de fenoles totales (1270,5 mg ác. tánico/100 g peso fresco) pero sin presentar diferencias significativas con respecto a las accesiones 164, 182 y 184. Estos resultados se reafirman con la correlación establecida entre el contenido de antocianinas y fenoles totales (r= 0,66 y p< 0,01). Los contenidos de antocianinas y fenoles totales en los frutos de algunas accesiones fueron comparables a los obtenidos en frutos cosechados en el año 2017 (Ceribelli, 2018) y comparables con los encontrados en los frutos de B. microphylla de Tierra del Fuego (Arena et al., 2012).
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos, B. mikuna presenta una elevada variabilidad en la mayoría de las características morfofisiológicas y bioquímicas evaluadas tanto en las flores como en los frutos formados de las diversas accesiones. Sin embargo, en general los ambientes no mostraron efectos diferenciados sobre las medidas florales estudiadas. El contenido de antocianinas y fenoles en los frutos de la mayoría de las accesiones, aunque de elevada variabilidad, destaca a estos frutos como potenciales alimentos funcionales. Estas propiedades, además del contenido de berberina en su leño, hacen que esta especie sea muy interesante en el mejoramiento vegetal. Por otro lado, si bien no se calcularon aún los rindes en las condiciones en las cuales crece, esta especie produce una cantidad considerable de fruta que podría incrementarse notablemente si se le aplicaran las prácticas de manejo adecuadas. Los resultados obtenidos en este trabajo son los primeros antecedentes en B. mikuna, los que contribuirán al conocimiento de la biología reproductiva de esta especie y serán de fundamental importancia para la introducción de esta especie al cultivo productivo.